סרט משי תרבות מערכת במבחנה ניתוח ביולוגי עיצוב

Summary

סרטי משי הם קבוצה חדשה של biomaterials בקלות להתאמה אישית עבור מערך של יישומים ביו. הסרט הציג משי מערכת התרבות ניתנת להתאמה ביותר למגוון של

Abstract

סרטי משי מבטיחים חלבון מבוססי biomaterials זה יכול להיות מפוברק עם נאמנות גבוהה מבחינה כלכלית בתוך ^1,2 מעבדת מחקר הסביבה. חומרים אלה רצוי כי הם בעלי מאפיינים ממדי חומר לשליטה מאוד, הם ביולוגית לקדם את הידבקות התא, ניתן לשנות באמצעות דפוסים טופוגרפית או על ידי שינוי כימי של פני השטח, והוא יכול לשמש מחסן של מולקולות פעילות ביולוגית לאספקת יישומים סמים הקשורות ^3-8. בנוסף, סרטי משי הם פשוט יחסית עיצוב מותאם אישית, יכול להיות מתוכנן לפרק בתוך דקות או לבזות לאורך השנים או במבחנה in vivo, והם מייצרים עם מוסף של להיות שקוף בטבע, ולכן מתאים במיוחד עבור יישומי הדמיה ^{9 - 13.} מערכת התרבות המתודולוגיה המוצגת כאן מייצג גישה להרחבה על הערכות מהירה של שטח פני התא משי הסרטאינטראקציות. מעניינת במיוחד היא השימוש פני סרטי משי בדוגמת ללמוד הבדלי התרבות התאים ואת תגובותיהם של תאים עבור יישור ^12,14. התרבויות היו בתרבית זרע בשני מיקרו בדוגמת ושטוח הסרט מצעים משי, ולאחר מכן להעריך את ההדמיה שלב בניגוד זמן לשגות, סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, והערכה ביוכימי של פעילות מטבולית ותוכן חומצות גרעין. לסיכום, סרט משי במערכת התרבות חוץ גופית מציעה התקנה ניסיונית להתאמה אישית מתאים ללימוד על פני קרום התא אינטראקציות על מצע ביולוגי, אז מה שיכול להיות מותאם ולאחר מכן לתרגם את במודלים vivo. תצפיות באמצעות מערכת התרבות המוצגת כאן כרגע בשימוש לסייע יישומים החל אינטראקציות סלולריים הבסיסיים לעיצוב מכשור רפואי, ולכן הם רלוונטיים למגוון רחב של תחומים ביו.

Protocol

1. ייצור של תבניות גומי סיליקון

1. לייצר או לרכוש השטח הטופוגרפי הרצוי על הליהוק. לפרסום זה תקן 100 פרוסות סיליקון חרוט מ"מ יתוארו (איור 1).
2. לשקול את polydimethylsiloxane (PDMS) האיתות (רכיב) ו זרז (מרכיב ב) פתרון ביחס 1:09 (9 גרם האיתות ו 1 גרם זרז) כאמור ערכת לרכוש.
3. מערבבים היטב פתרונות ליזום תהליך ריפוי.
4. סיליקון במקום רקיק פני השטח בתוך צלחת הליהוק.
5. לשקול את 4.5 גרם של הפתרון PDMS על גבי פרוסות סיליקון.
6. מורחים PDMS פתרון כדי לכסות בקוטר 100 מ"מ שטח של משטח פרוסות.
7. הטה רקיק להפיץ הפתרון PDMS באופן שווה.
8. מכסים עם פרוסות סיליקון בקוטר 100 מ"מ המכסה צלחת פטרי.
9. במקום להטיל את הגדרת 60 ° C בתנור במשך הלילה, לוודא כי ריפוי מתרחש על משטח שטוח.
10. במקום לרפא PDMS / סיליקון פרוסות סיליקון לתוך אתנול 70%אמבטיה לפני ההסרה.
11. בגין הסרת PDMS מ רקיק באמצעות סכין גילוח להרים קצה (היקף שלם) 1.
12. משוך בעדינות את PDMS באמצעות מלקחיים בתוך אמבטיה אתנול 70% נזהרים שלא לקרוע יציקת גומי סיליקון.
13. אגרוף את הפרט תבניות PDMS באמצעות ניקוב חורים 14 מ"מ. קוטר זה נועד להתאים את ההגדרה של 24 גם צלחת.

2. הפקה של פתרון ממשי

1. להביא 2 ליטר של מים מזוקקים (DH ₂ O) לרתיחה בתוך הכוס זכוכית ^7.
2. חותכים 5 גרם של Bombyx פקעות מורי תולעת המשי לשלישים.
3. השלך את פקעות מזוהמים באופן נרחב כפי שצוין על ידי ציפוי חרק חלקיקים מוגברת פני המעטפת הפנימית.
4. למדוד 4.24 גרם של סודיום קרבונט.
5. הוסף סודיום קרבונט לאט רותחים DH ₂ נפח O למנוע רותחים על מים, ולאפשר פירוק מוחלט לפני שתמשיך.
6. להוסיף חתיכות המעטפת כדי ד"ה רותחים
7. לאחר הרתיחה, בזהירות לנקז DH ₂ O לתוך הכיור וטבעת את תמצית משי ביד כדי להסיר עודפי מים.
8. לשטוף משי לחלץ שלוש פעמים במשך 20 דקות. כל 1 ליטר של DH ₂ O בכוס מעבדה, ולהשתמש בר ומערבבים להפיץ נפח בתוך הכוס.
9. לאחר הכביסה, טבעת את תמצית משי בעבודת יד ומשי במקום תמצית סיבים בתוך מכסה המנוע הכימי, כדי לאפשר ייבוש במשך 12 שעות. נקודה.
10. למחרת, לשקול את סיבי משי יבשים, שהוא בדרך כלל ~ 3.5 גר ': ___________-G
11. להכין 9.3 פתרון M LiBr לפתרון w / v 20% משי. לנצל את המשוואות הבאות כדי לחשב את משקל הדרוש כרכים:
    1. (תמצית משי משקל משלב 10) x (4) = ___________-מ"ל בסך הכל פתרון 9.3 LiBr M
    2. [(807.705) x (נפח LiBr מחלק 11.a)] / 1000 = ___________ גרם LiBr להוסיף DH ₂ O
    </ Li>
12. הוספת משקל LiBr נמדד לתוך כוס זכוכית של נפח הבאה DH O _2:
    1. (0.8) x (נפח לחשב צעד 11.a) = ___________ מ"ל של DH ₂ O
13. יוצקים את הפתרון הזה לתוך בגודל המתאים סיימה גליל, ולהביא פתרון עד נפח הסופי כפי שחושב בחלק 11.a.
14. מניחים את תמצית משי לתוך הכוס ויוצקים פתרון LiBr על סיבי משי ולוודא סיבי משי שקועים בתוך פתרון LiBr באמצעות מרית במעבדה.
15. מניחים את המשי התמוססו 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך שעה 4:
    שעת התחלה: ___________
    שעת סיום: ___________
16. באמצעות מזרק בגודל המתאים להכין 12 מ"ל של פתרון ממשי. הצב מחט 18G על סוף המזרק, ואז מזריקים לתוך פתרון casette דיאליזה (3500 coutoff MW, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). לאחר מילוי את הקלטת, לצייר את האוויר שנותר מתוך קלטת עם מזרק מרוקן.
17. מקום Fiדיאליזה קלטת lled בתוך L 1 של DH ₂ א '
18. שנה DH ₂ נפח O אחרי 1 שעות, 4 שעות, 8 שעות ואז כל שעה 12 3x עבור סכום כולל של 6 שינויים:
    1. בגין: ___________
    2. 1 שעות: ___________
    3. 4hr: ___________
    4. 8 שעות: ___________
    5. 12 שעות: ___________
    6. 12 שעות: ___________
    7. 12 שעות: ___________
    8. סיום: ___________
19. אחרי דיאליזה, לאט לאסוף את הפתרון משי קלטות עם מזרק. במקום הפתרון לתוך צינורות 10,000 גרם בדירוג צנטריפוגות.
20. בצנטריפוגה פתרון פעמיים גרם 10000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד. לאחר supernatant כל צנטריפוגה המקום לתוך צינור חדש.
21. חנות thr פתרון ממשי במקרר 4 ° C.
22. פיפטה 2 דוגמאות של פתרון 0.5 משי מ"ל לתוך צלחת משקל קטן, מקום לשקול מנות בתוך 60 מעלות בתנור יבש במשך 12 שעות או עד מתייבש פתרון ממשי.
23. לשקול את הסרט הנותרים משי מוצקה בוטדגימות H כדי למדוד פתרון ממשי במשקל אחוז ריכוז החלבון נפח:
    1. משקל בשילוב של 2 סרטים דגימות משי: ___________ מ"ג
    2. (משקל של 23.a) x (100) = ___________% משי

3. הכנת סרטי משי מערכת ההתקנה תרבות

1. להכין משטחים PDMS הליהוק על ידי ניקוי עם קלטת ברורה להסרת אבק.
2. PDMS מצעים נקיים על ידי טבילה EtOH 70% ולשטוף שלוש פעמים עם DH ₂ א '
3. מקום 14 מ"מ תבניות PDMS לצלחת המחזיק, שהוא בדרך כלל מכסה 24 הצלחת היטב.
4. כדי לייצר 50 מיקרומטר סרט עבה, להפיץ 70 μls של פתרון ממשי 8% על תבניות PDMS באמצעות כלי להפצת הנוזל הוא בדרך כלל 1 מ"ל במזרק טיפ ^2.
5. אפשר את הסרטים משי לייבוש שנחשפו על ספסל נקי פועל זרימת אוויר בלחץ של אבא 150 לתקופה של 90 דק 'או עד סרטים יבשות.
6. פעם הסרטים הם מקום יבש כל קבוצה של סרטים, כולל PDMS מ 'בני, אל חדר מים חישול עבור> 4 שעות כדי להפיק סרט מסיס במים. זה בדרך כלל תא תא ייבוש ריקה עם מים בחלקו התחתון של אגן משך ואקום 25 kPa ^15.
7. הסר סרטי משי מחדר מים חישול במקום על ספסל נקי.
8. להכין אמבטיה EtOH 70% בתוך צלחת פטרי 35 מ"מ, בקרת מקום מצעים (כלומר זכוכית או משטחי פלסטיק) וטבעות נירוסטה בתוך בארות דקות לפחות 10 לעקר.
9. הסר סרטי משי מתבניות PDMS באמצעות מלקחיים, לטבול אותם EtOH 70%, ואת המקום לתוך צלחת מדגם 24-prefilled גם עם 1 מ"ל של EtOH 70% ביצוע בצד בדוגמת בטוח הוא פונה כלפי מעלה, כדי לאפשר הידבקות התא.
10. לאחר ביצוע כל מדגם הסרט משי לתוך מקבילה גם מקום פלדה אל חלד משקולות טבעת (11.65 מ"מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 15.45 מ"מ, 1.18 מ"מ עובי) על גבי.
11. אפשר דגימות עם טבעות כדי לדגור במשך 10 דקות על מנת להבטיח סטריליות.
12. רמויש EtOH ולשטוף כל מדגם 3x עם 1 מ"ל של PBS. בואו לשטוף את זה לשבת במשך 5 דקות, כדי לאפשר דיפוזיה מלאה.
13. הסר PBS באמצעות פיפטה זכוכית aspirating, תוך הקפדה להסיר מרבית בועות מתחת דגימות סרט משי.
14. הכן את הקו הסלולרי של זריעת. לדוגמה, אדם trypsinize הקרנית-limbal קו אפיתל (HCLE) תא עם טריפסין 0.25% וחומצה פתרון ethylenediaminetetraacetic (EDTA) דקות-7. בטל טריפסין שימוש 1:01 נפח שונה Dulbecco הנשרים בינוני (DMEM) מדיה המעבר עם FBS 10% נוסף. סרכזת תאים HCLE trypsinized, להוסיף 8-מ"ל של keratinocyte-בסרום תקשורת חופשית (K-SFM) לתא גלולה, בעדינות להתסיס לפזר HCLEs, וליצור מספר התא.
15. 500 מדגם μL ההשעיה HCLE לכל גם בדרך כלל באמצעות 10,000 תאים / ס"מ ² צפיפות.
16. תרבויות מקום בתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו להפעיל פרוטוקול הניסוי הרצוי.

4. נציג תוצאות

<בכיתה P = "jove_content">
1. תרשים זרימה תרשים הממחיש סיכם 10 שלבים בתהליך של ייצור משי הסרט ואת מערכת הכנה התרבות.

איור 2 (א) 21 צבע מערך של פני השטח בדוגמת topographies קו המיוצרים על פרוסות סיליקון בקוטר 90 מ"מ סטנדרטי העסקת טכניקות תחריט photolithographic ויבש. (ב) סרטי משי לשמור על התכונות המקוריות שורות מקבילות בדוגמת לאחר הליהוק על משטחים PDMS דפוס. (ג) סכמטי הוכחת גודל עיצוב תכונה נבחר כדי לקדם את יישור התאים. (ד ') חתך של סרט משי הממחישות שמרו על משטח מרופד בדוגמת במקביל.

איור 3. סריקה micrographs אלקטרונים של קו תא HCLE עמידה (א) בדוגמתו (ב) סרטי משי שטוחה יום 2 בתרבות. תרבויות HCLE ממשיכים להתרבות עד המפגש ב (ג) בדוגמת (ד) משטחים שטוחים ביום 8 בתרבות.

איור 4. (A, D, G) בדוגמת (B, E, H) סרטים שטוחים משי תרבות HCLE תאים יחסית עד (C, F, I) שליטה מצעים הזכוכית היום (AC) 1, (DF) יום 4, ו (GI) יום 8 בתרבות. (י) חומצה CyQuant תוכן גרעין (K) (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) מטבוליות assay פעילות נתונים הוכחת הכדאיות HCLE בשני בדוגמת ושטוח הסרט מצעים משי בהשוואה שליטה משטחי זכוכית לאורך זמן (ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר).

וידאו 1. זמן לשגות שלב לעומת זאת הדמיה של תאים HCLE נודדות על פני השטח בסרט משי בדוגמת במהלך שעות 18. פרק זמן. התאים היו זרע בצפיפות ² 10k/cm ותרבותיים עבור שעה 2. לפני הדמיה. לחץ כאן לצפייה בסרט .

וידאו 2. זמן לשגות שלב לעומת זאת הדמיה של תאים HCLE נודדים על פני TCP שטוח שליטה במהלך שעות 18. פרק זמן. התאים היו זרע בצפיפות ² 10k/cm ותרבותיים עבור שעות 2. לפני הדמיה. לחץ כאן לצפייה בסרט .

Discussion

השימוש סרטי משי שהתחדשו כמו המצע של תרבית תאים צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשל אפיון נרחב של תכונות החומר של חלבון זה והגדילה הבנה של השירות שלה ביולוגי ^3,8. מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה הרומן במערכת בדיקות במבחנה להערכת אינטראקציות פני התא על משי בדוגמת הסרט ביולוגי מצעים ^7. המערכת מאפשרת ניתוח מעמיק של אינטראקציות הסלולר לאורך זמן, כי ניתן לאמץ בקלות איסוף נתונים תפוקה גבוהה. זו מתאפשרת בעיקר בגלל סרטי משי בעל מספר תכונות מתכונן ביולוגי כי ניתן לשנות באופן ישיר להשפיע על תפקוד התא ^8,9,12, כולל: שליטה על פני מיקרו / ננו משטח הטופוגרפיה ^7; chemistries השטח שונים באמצעות שינוי קוולנטי או ספיחה ביולוגית של מולקולות פעילות ^13; הנדסת חזקיםתכונות anical ^15,16; בקרה של hydrophilicity חומר / hydrophobicity ^16, טוען רוב תרכובות ביולוגיות לשחרור ^4,8,17 וכן פירוק מבוקר / שיעורי השפלה אנזימטיות באמצעות שליטה על המבנה המשני (תוכן גיליון בטא) ^11,18,19 .

השקיפות של סרטי משי מושגת באמצעות חישול הסרטים לתקופה של זמן תחת ואקום בנוכחות אדי מים ^7,15. גישה זו מאפשרת עיבוד ליצירת מבנה β גיליונות משני, טיפוח insolubility של החומר במים תוך מתן אפשרות עקיפה מינימלית של אור ^15. זו השקיפות של הסרטים הוא המפתח המאפשר הדמיה ישירה בשידור חי תאים שיכולים להיות מועסקים תחת מספר שיטות הדמיה (כלומר רחב שדה הקרינה) באמצעות מספר רב של מערכות מיקרוסקופ ^12,20. בנוסף הדמיה חיה תאים, סרטי משי ניתן להסיר בקלות מן התרבות מערכת הדואר, כדי לאפשר ניתוח קיבוע נוסף. לכן, מגוון רחב של הערכות ניסיוניות ישירות כי ניתן לבצע במערכת זו החלות על מגוון רחב של תאים / רקמות מקורות עבור שדות טכניים רבים ^{3,8,9,12,13,21.} את זמן לשגות תוצאות ההדמיה להמחיש כיצד נתונים בזמן אמת תרבות ניתן לאסוף, ובתור דוגמה נוצלו כדי להמחיש עד כמה הטופוגרפיה משטח משפיע על אינטראקציות התא. התוצאות מייצגות להדגים כיצד biomaterials סרט משי יכול להיות מנוצל כדי לתמוך בצמיחה תרבות HCLE, והם amendable למספר התרבות תאים סטנדרטיים מבחני מטבולית (איור 4). בנוסף, התרבויות קבועים ומעובדים לצורך סריקה והדמיה אלקטרונים או פרוטוקולים אחרים (איור 3).

הסרט מצעים משי מיוצרים במעבדה עם איכות גבוהה, עקביות, עם עלות נמוכה יחסית (איור 1). זה מאפשר reproducibility בהגדרת התרבות גם מערכת ותוצאות הניסוי. הוכח כי מים לחשל עיבוד מייצרת משי יציבה הסרט בחומר תרבות הגדיר שיעורי השפלה ממתינים ריכוז של פרוטאזות בתמיסה ^2,15,22. כתוצאה מכך חומרים אלה עשויים לשמש עבור פרקי זמן ארוכים של תרבות ארוכת טווח תאים, או להישאר מושתל במשך חודשים או שנים בהתאם למיקום הפיזיולוגי ^8. בנוסף, העבודה האחרונה הראו כי הן את המבנה של חלבונים תכונות החומר של מים annealed סרטי משי עולים בקנה אחד מתוך אצווה כדי אצווה המאפשר תוצאות תרבות לשחזור כפי שמוצג באמצעות שיטות בדיקה שונות מכניים biophysical ^15,16. בנוסף, פני השטח של החומר הראה נאמנות רבה בקרב קבוצות הסרט כפי שמצוין SEM, כוח אטומי micrscopy (AFM), ואת לימודי התרבות תאים {לורנס: 2008wr, Omenetto: 2008tc, בריי: 2011kq} ^7,23,24. חומר stability ועקביות הוא גורם חשוב איך התא יהיה לחוש את מצע התרבות דרך מסלולים mechanotransduction שונים, ובסופו של דבר לייצר התגובה הרצויה / לא רצויה הסלולר ^25,26.

סטנדרטים היסטוריים מצעים תרבות, כגון פלסטיק רקמת התרבות טיפול או זכוכית, מספקים מצעים מתאימים עבור קובץ מצורף התא. עם זאת, חומרים אלה אינם amendable עבור השירות נוספת in vivo. זה יכול להיות שחזה כי משי הסרט ביולוגי יכול להיות מותאם אישית במבחנה, ופעם הציפיות הניסוי היה להשיג את הסרט מותאם אישית יכול להיות מתורגם ישירות במודל vivo. עיצוב זיווג כזה בין במבחנה ניסויים vivo מציע יתרון גדול על אלה biomaterials משי מושתלת על מצעים אחרים המשמשים שגרתי במבחנה.