Summary
シルクフィルムは、生物医学アプリケーションの配列のために容易にカスタマイズ可能な生体材料の新しいクラスです。提示絹フィルム培養システムは、様々な高度に適応可能です
Abstract
シルクフィルムは、研究室の環境1,2内の高忠実度、経済的に作製することができる有望なタンパク質ベースのバイオマテリアルである。彼らは、高度に制御次元および材料特性を有する細胞接着を生体適合性の促進であるため、これらの材料が望ましいのですが、地形のパターン形成を介して、または化学的に表面を変えることによって変更することができ、薬物送達に関連するアプリケーションのための生物学的に活性な分子のデポとして使用することができます3-8さらに、絹フィルムは、数分以内に溶解またはin vitroまたは in vivo で長年にわたって低下するように設計することができ、カスタム設計するのは比較的簡単であり、自然の中で透明性のイメージングアプリケーション9したがって、非常に適しているという利点を生み出します- 13。ここで紹介する培養システムの方法論は、細胞絹膜表面の迅速な評価のためのスケーラブルなアプローチを表してい相互作用。特に興味深いのアライメント12,14のために細胞増殖と細胞の応答の違いを勉強するための表面パターニングされた絹フィルムの使用である。シード培養物は、マイクロパターンとフラットシルクフィルム基板の両方で培養し、タイムラプス位相コントラストイメージング、走査型電子顕微鏡、および代謝活性と核酸含量の生化学的評価を通じて評価した。要約すると、in vitroの培養系における絹フィルムは、in vivoモデルで最適化した後に翻訳することができる生体材料基板上に細胞表面の相互作用の研究に適したカスタマイズ可能な実験的なセットアップを提供しています。ここで紹介する培養系を用いた観測は、現在、基本的な細胞間相互作用から医療機器の設計に至るまでのアプリケーションを支援するために使用されているため、生物医学分野の広い範囲に関連しています。
Protocol
1。シリコーンゴム金型の作製
- 鋳造の目的の地形面を生成したり、購入してください。このパブリケーションの場合は標準の100ミリメートルエッチングされたシリコンウェハ（ 図1）について説明する。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）（コンポーネント）と購入したキットで提供される1時09分の比率（9グラムポッティングと1グラムの触媒）の触媒（成分B）ソリューションをポッティングを量る。
- 硬化プロセスを開始するために徹底的に解決策を混ぜる。
- 鋳造皿内の場所のシリコンウェーハ表面。
- シリコンウェハ上にPDMS液の4.5グラムを秤量する。
- ウェーハ表面の直径100mmの領域を覆うようにPDMSソリューションを広げる。
- 均等にPDMSソリューションを広めるためにウェハを傾けてください。
- 直径100mmのペトリ皿の蓋でウェハをカバーしています。
- 場所は、硬化が平らな面に行われていることを特定すること、一晩60℃のオーブンにセットアップを鋳造。
- 場所70％エタノールにPDMS /シリコンウエハー硬化削除する前にお風呂。
- 最初のエッジ（全周）を持ち上げるためにカミソリの刃を使用してウエハからPDMSの削除を開始。
- 静かにシリコーンゴム鋳造を引き裂くないように注意して70％エタノール槽内に鉗子を使用してオフにPDMSを引き出します。
- 14ミリメートル穴パンチを使用して、個々のPDMSモールドパンチアウト。この直径は、24ウェルプレートのセットアップに収まるように設計されています。
2。シルクソリューションの生産
- ガラスビーカー7内沸騰蒸留水（のdH 2 O）の2 Lを持参してください。
- 分にカイコ蚕の繭の5グラムをカットします。
- 過度の昆虫微粒子コーティング内側の繭の表面によって示されるように広範囲に汚染された繭を廃棄してください。
- 炭酸ナトリウムの4.24グラムを測定します。
- 水のふきこぼれを防止し、続行する前に完全な溶解を可能にするために沸騰のdH 2 Oボリュームに徐々に炭酸ナトリウムを追加します。
- 沸騰DHに繭の部分を追加します。
- 沸騰した後、慎重に余分な水分を除去するために手でシルクエキスよりシンクとリングにのdH 2 Oを排出する。
- シルクは20分を3回抽出洗浄します。ラボのビーカーでのdH 2 Oの1 Lの各、ビーカー内のボリュームを循環させるために攪拌棒を使用しています。
- 12時間の乾燥を可能にするために、化学フード内側に手と場所絹繊維抽出物による絹のエキスを洗浄した後、リング。期間。
- 次の日、通常は〜3.5 gである乾燥した絹繊維を、重量：___________-G
- シルク20％w / v溶液は9.3 M臭化リチウム溶液を調製します。必要な重量とボリュームを計算するには、次の方程式を利用する：
- （ステップ10からシルクエキスの重量）×（4）=合計9.3 M臭化リチウム溶液の___________-mLの
- [（807.705）×（一部11.AからLiBrのボリューム）] / 1000 = LiBrの___________ gはのdH 2 Oに追加する
- 以下のdH 2 O量のガラスビーカーに測定した臭化リチウムの重量を追加します。
- （0.8）×（ステップ11.Aから計算されたボリューム）= ___________のdH 2 O mLの
- メスシリンダー、一部締めくくりで計算された最後のボリュームにソリューションをもたらす適切なサイズにこのソリューションを注ぐ
- ビーカーに絹のエキスを置き、シルク繊維はラボのスパチュラを用いて臭化リチウム溶液を内に浸漬されていることを確認すること絹繊維上の臭化リチウム溶液を注ぐ。
- 60に溶解した絹を置き°で4時間Cオーブン：
開始時刻：___________
終了時間：___________- 適切なサイズのシリンジを使用すると、シルク液12 mLを策定する。注射器の先端に18G針を配置して、透析カセット（3,500 MWのcoutoff、スライド-Lyzer、サーモサイエンティフィック）に溶液を注入します。カセットを充填した後、空にシリンジでカセットのうち、残りの空気を描画します。
- 場所FIのdH 2 Oの1 L中にlled透析カセット
- 1時間、4時間、8時間後、6変化の合計3倍、12時間後のdH 2 O量を変更します。
- 開始：___________
- 1時間：___________
- 4時間：___________
- 8時間：___________
- 12時間：___________
- 12時間：___________
- 12時間：___________
- 終了：___________
- 透析後、ゆっくりとシリンジを用いてカセットから絹のソリューションを収集します。万グラム定格遠心チューブに配置するソリューションを提供します。
- 20分ごとに4℃で10,000 gで倍溶液を遠心分離します。新しいチューブに上清をそれぞれ遠心分離後の場所。
- 4℃の冷蔵庫で保管してTHRシルク·ソリューションを提供します。
- ピペット2つの小さな計量皿に0.5mLのシルクソリューションのサンプル、および場所は、12時間または絹溶液の乾燥するまで60°C乾燥炉内部に皿の重量を量る。
- ボットから残りの固体絹フィルムの重量を量るhは試料体積のタンパク質濃度に絹溶液の重量パーセントを測定する。
- 合計2の絹フィルムサンプルの重量：___________ミリグラム
- （23.aから重量）×（100）= ___________％シルク
3。シルクフィルムと文化システムのセットアップの準備
- ほこりを削除するには、clearテープでクリーニングしてPDMS鋳造表面を準備します。
- きれいなPDMS基板70％エタノールに浸漬とのdH 2 Oで3回洗浄
- 一般的に24ウェルプレートのふたで押さえ板、上に場所14ミリメートルPDMSモールドを。
- 50μmの厚膜を生成するために、一般的に1 mLのシリンジ先端2は液体拡散ツールを使用して、PDMSモールドに8％の絹溶液を70μlsを広げた。
- シルクフィルムは90分の期間、150 Paの空気の流れの圧力を実行しているクリーンベンチやフィルム乾燥しているまで明らかに乾燥させます。
- かつて映画はPDMS mを含むフィルムの乾燥した場所全体のセットです。歳は、水不溶性のフィルムを製造するために> 4時間水熱処理チャンバ内へ。これは通常、25 kPaの真空15で引っ張ら盆地の底に水と空のデシケーター室です。
- クリーンベンチの上に水熱処理チャンバーと場所から絹フィルムを取り外します。
- 滅菌するために、少なくとも10分間、ウェル内に35ミリメートルのペトリ皿の中で70パーセントエタノール浴を準備し、代わりに制御基板（すなわち、ガラスまたはプラスチックの表面）とステンレス鋼リング。
- 鉗子を用いてPDMSを鋳型から絹フィルムを取り出し、70％エタノールにそれらを浸し、確かにパターニング側を70％エタノール1 mLであらかじめ入力さ24ウェルプレートに配置するサンプルは、細胞接着を可能にするために上を向いている。
- 上に対応するだけでなく場所のステンレス製リングの重み（11.65ミリメートル、内径、15.45ミリメートル、外径、1.18ミリメートルの厚さ）に、それぞれの絹フィルムのサンプルを配置した後。
- リングが付いているサンプルは無菌性を確保するために10分間インキュベートすることができます。
- レモEtOHをveとPBS 1 mLで3倍の各サンプルを洗浄します。各洗浄が完了した拡散を可能にするために5分間放置します。
- シルクフィルムサンプルの下に気泡の大部分を削除することを確認しながら、吸引ガラスピペットを用いてPBSを削除します。
- 播種のセルラインを準備します。例として、7分間0.25％トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液とヒト角膜輪部上皮-（HCLE）細胞株をトリプシン処理。トリプシンは10％FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）通路メディアの1:1のボリュームを使用して無効にするを追加しました。トリプシン処理HCLE細胞を遠心し、細胞ペレットにケラチノサイト無血清培地（K-SFM）の8 mLを加え、穏やかにHCLEsを分散させるために撹拌し、細胞数を生成します。
- よく一般的に10,000細胞/ cm 2の密度を使用して、当たりHCLE懸濁液サンプル500μL。
- 37℃インキュベーター内の場所の文化℃、5％CO 2および所望の実験プロトコルを実行します。
4。代表的な結果
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絹の映画制作と文化システムの準備の要約を示す図1のフローチャートは、10ステップのプロセス。
図2標準的なフォトリソグラフィーとドライエッチング技術を用いた90 ミリメートルの直径のシリコンウエハ上に生成するパターン化されたラインの表面トポグラフィの（A）21染料配列。 （B）シルクフィルムは、PDMSモールドの表面に鋳造した後に元の平行線パターン化の機能を保持します。 （C）回路図デモ機能·サイズ·デザインは、細胞の配置を促進するために選ばれた。 （D）を保持並列並んでパターン化表面を示すシルクフィルムのクロスセクションを参照してください。
図3（）パターンに付着HCLE細胞株の走査電子顕微鏡写真と（B）培養中の2日目でフラットシルクフィルム。 HCLE文化は文化の日8（C）パターンと（D）平らな表面上でコンフルエントになるまで増殖し続けています。
図4（A、D、G）パターニング（B、E、H）フラットシルクフィルム文化HCLE細胞は比較的に（C、F、I）ガラスの制御基板（AC）1日目、（DF）4日目で、文化と（GI）日8。 （J）CyQuant核酸含有量および（K）（3 - パターンとフラットシルクフィルム基板の両方にHCLE可能性を示す（4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）の代謝活性の測定データ時間をかけてガラスのコントロールサーフェス（スケールバー= 100μm）に比較した場合。
ビデオ1で18時間の間にパターニングされた絹フィルム表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
ビデオ2で18時間の間に平らなTCP制御表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
Discussion
細胞培養の基質として再生され絹フィルムの使用は、このタンパク質の材料特性の広範な特性のために過去20年間にわたり人気を獲得し、その生体ユーティリティ3,8の理解を増加しています。ここで説明した培養系は、パターン絹フィルム生体材料基板7上で細胞表面の相互作用を評価するためのin vitro試験系で小説を表しています。システムは、容易に高スループットのデータ収集のために採用することができます時間をかけて細胞間相互作用の詳細な分析で可能になります。共有結合修飾または吸着を介して様々な表面化学、表面の制御マイクロ/ナノ表面形状7：絹フィルムを含むセルに直接関数を8,9,12に影響を与えるように変更することができます調整可能な生体材料のプロパティの数を持っているので、これは主として有効になっています堅牢なメカ、生物学的に活性な分子13のanicalプロパティ15,16、材料の親水性/疎水性16の制御、リリース4,8,17ための生物学的化合物のバルク·ロード、および二次構造の制御により制御された溶解/酵素分解率（βシートの内容）11,18,19 。
絹フィルムの透明度は水蒸気7,15の存在下で真空下で一定の時間アニールを行うことによって実現されます。この処理のアプローチは、光15の最小の回折を可能にしながら水に不溶性の材料を促進、β-シート二次構造の形成が可能になります。映画のこの透明性は、顕微鏡システム12,20は、任意の数を用いた撮像モダリティ（すなわち、広い視野と蛍光）の番号の下に用いることができる直接のライブセルイメージングを実現する上で鍵となります。ライブセルイメージングに加えて、シルクフィルムは容易に目から削除することができます追加の固定および分析を可能にするための電子培養系。したがって、このシステム上で実行することができます直接実験的評価の多種多様な多くの技術分野3,8,9,12,13,21のための細胞/組織、さまざまなソースに適用されます。タイムラプスイメージングの結果は、リアルタイムの培養データを収集する方法を説明し、例として、表面形状が細胞の相互作用をどのように影響するかを説明するために利用された。代表的な結果は、絹フィルムの生体材料がHCLE文化の成長をサポートするために利用することができる方法を示し、標準的な細胞増殖と代謝アッセイ（ 図4）の数に修正可能です。さらに、文化は固定されており、電子イメージングまたは他のプロトコルを（ 図3）スキャンのために処理されます。
シルクフィルム基板は、高忠実性、一貫性、と、比較的低コスト（ 図1）実験室で生産されています。これはreproduciを可能にする文化システムのセットアップと、実験結果の両方でbility。それは水アニール処理は、溶液2,15,22におけるプロテアーゼの濃度保留中の分解速度を定義している文化の中で安定した絹のフィルム材料を生成することが実証されている。その結果、これらの材料は、長期的な細胞培養のために長期間使用してもよいし、あるいは生理的な場所8日に応じて、数ヶ月または数年のために移植されたままになります。さらに、最近の研究は、タンパク質の構造と水アニール絹膜の材料特性の両方をバッチから様々な機械的および生物物理学的試験方法15,16を介して示されるように再現性の培養結果を可能にするバッチに一貫性があることが示されている。 7,23,24 SEM、原子間力micrscopy（AFM）、および細胞培養の研究{：2008wr、Omenetto：2008tc、ブレイ2011kqローレンス}で示されるように加えて、材料の表面は、フィルムバッチの中で偉大な忠実度を示している。材料STABILITYと一貫性は、細胞は様々なメカノ経路を介して培養基板を感知し、最終的には望ましい/望ましくない細胞応答25,26を生成する方法に重要な因子である。
そのような組織培養処理プラスチックやガラスなどの培養基質のための歴史的な基準は、細胞接着のために適切な基質を提供しています。しかしながら、これらの材料は、 生体内でさらにユーティリティの修正可能ではありません。それは絹フィルム生体材料は 、in vitro でカスタマイズすることができ、一度の実験期待がカスタマイズされたフィルムを直接in vivoモデルに変換することができますが達成されている。ことが想定できます。 in vitroおよび in vivo実験での間にそのようなペアのデザインは、日常的にin vitroで使用されている他の基板上にそのような植込み型シルクバイオマテリアルのための大きな利点を提供しています。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
失明のキャリア開発賞、トライ制度幹細胞イニシアティブを防止するためのNIH K08EY015829、R21EY019561、R24EY015656、P41 EB002520、およびR01 EY020856 Researchから資金を調達している。 HCLE細胞株は、博士アイリーンGipsonの礼儀を提供した。著者らは、細胞培養、SEMイメージングにおけるティッシュエンジニアリングリソースセンター（TERC）と彼女の技術支援のための特別な手術のため病院でアンソニーLabissiereで彼女の技術支援とご指導をワイルコーネル医科大学で博士Aihong劉に感謝したいと思います材料開発と技術サポートのためのタフツ大学、シリコンウェーハ製造の支援のためのナノスケール科学技術施設のコーネルセンター（CNF）。
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