Summary
Silk Filme sind eine neue Klasse von Biomaterialien leicht anpassbar für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen. Das vorgestellte Seide Filmkultur System ist sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von
Abstract
Silk Filme sind vielversprechend Protein-basierten Biomaterialien, die mit hoher Wiedergabetreue und wirtschaftlich in einem Forschungslabor Umwelt 1,2 hergestellt werden können. Diese Materialien sind wünschenswert, da sie in hohem Maße steuerbar Abmessungen und Materialeigenschaften, besitzen, sind biokompatibel und zur Förderung der Zelladhäsion, durch topographische Muster oder durch chemische Veränderung der Oberfläche modifiziert werden, und kann als ein Depot für biologisch aktive Moleküle zur Arzneimittelabgabe Anwendungen verwendet werden 8.3. Darüber hinaus sind Filme Seide relativ einfach selbst zu gestalten, können entworfen, um innerhalb von Minuten auflösen oder zersetzen sich über Jahre in vitro oder in vivo werden und sind mit dem zusätzlichen Vorteil des Seins in der Natur transparent und daher sehr gut für Imaging-Anwendungen produzieren 9 - 13. Die Kultur hier vorgestellte System-Methodik stellt einen skalierbaren Ansatz für die schnelle Beurteilung der Zell-Seide FilmoberflächeWechselwirkungen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von strukturierten Oberfläche Seidenfilme Unterschiede bei der Zellproliferation und Antworten von Zellen zur Ausrichtung 12,14 studieren. Gesetzt wurden die Kulturen sowohl auf mikro-strukturierten und flachen Substraten Seide Film kultiviert und dann beurteilt durch Zeitraffer-Phasen-Kontrast-Bildgebung, Rasterelektronenmikroskopie, und biochemische Beurteilung der metabolischen Aktivität und Nukleinsäure-Inhalte. Zusammenfassend bietet die Seide Film in vitro-Kultur-System eine anpassbare Versuchsaufbau geeignet zur Untersuchung von Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen auf einem Biomaterial Substrat, die dann optimiert und anschließend übersetzt werden kann, um in-vivo-Modellen. Beobachtungen mit dem Kultur hier vorgestellte System werden derzeit verwendet werden, um in Anwendungen, die von grundlegenden Zell-Interaktionen auf Design medizinischer Geräte zu unterstützen, und somit relevant sind eine breite Palette von biomedizinischen Bereichen.
Protocol
1. Herstellung von Silikonformen
- Produzieren oder erwerben einen gewünschten topographischen Oberfläche zum Gießen. Für diese Veröffentlichung ein Standard 100 mm Silizium-Wafer geätzt werden beschrieben (Abbildung 1) werden.
- Man wiegt Polydimethylsiloxan (PDMS) Verguss (Komponente A) und Katalysator (Komponente B)-Lösung in einem 1:9 Verhältnis (9 g Verguss und 1 g Katalysator), die in dem Kit gekauft.
- Mischen Sie gründlich, um Lösungen Aushärtung zu initiieren.
- Ort Siliziumwaferoberfläche innerhalb einer Casting Gericht.
- Abwiegen 4,5 g PDMS-Lösung auf Silizium-Wafer.
- Spread-PDMS-Lösung, um eine 100 mm Durchmesser des Wafers zu bedecken.
- Neigen Sie zu Wafer PDMS Lösung gleichmäßig verteilt.
- Abdeckwafers mit 100 mm Durchmesser Petrischale Deckel.
- Platz Gießen Setup in 60 ° C Ofen über Nacht, so dass bestimmte, dass die Aushärtung findet auf einer ebenen Fläche.
- Ort geheilt PDMS / Silizium-Wafer in 70% EthanolBad vor der Entfernung.
- Beginnen Sie das Entfernen von PDMS-Wafer mit Rasierklinge auf Kante (gesamten Umfang) zuerst zu heben.
- Ziehen Sie vorsichtig mit einer Pinzette aus PDMS innerhalb einer 70% igen Ethanol-Bad man aufpassen, nicht zu Silikonkautschuk Gießen reißen.
- Punch out einzelnen PDMS-Gussformen mit 14 mm Lochung. Dieser Durchmesser bestimmt ist, in einer 24-Well-Platte Installation anzupassen.
2. Produktion von Seide Lösung
- Bringt 2 l destilliertem Wasser (dH 2 O) zum Kochen in einem Becherglas 7.
- Schneiden Sie 5 g Bombyx mori Seidenraupenkokons in Drittel.
- Entsorgen kontaminierten ausgiebig Kokons als durch übermäßige Insekten-Partikel Beschichtung der inneren Oberfläche Kokon angegeben.
- Messen 4,24 g Natriumcarbonat.
- In Natriumcarbonat langsam zum Sieden dH 2 O Volumen zu Überkochen von Wasser zu verhindern, und ermöglichen eine vollständige Auflösung bevor Sie fortfahren.
- Fügen Sie Kokon Stücke zum Kochen dH
- Nach dem Kochen sorgfältig abtropfen dH 2 O in Waschbecken und Ring aus dem Extrakt aus Seide von Hand, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Waschen Sie Seide entnommen und dreimal für 20 min. jeweils in 1 l dH 2 O in einem Labor Becher, und verwenden Sie einen Rührstab, um die Lautstärke im Becherglas zirkulieren.
- Nach dem Waschen, Ring aus dem Extrakt Seide von Hand und Ort Seidenfaser Extrakt in einer chemischen Haube zum Trocknen für eine 12 Stunden erlauben. Zeitraum.
- Am nächsten Tag, wiegen die getrockneten Seidenfäden, die typischerweise ~ 3,5 g: ___________-g
- Planen 9.3 M LiBr-Lösung für eine 20% w / v Lösung von Seide. Nutzen Sie folgenden Gleichungen zu nötige Gewicht und Volumen berechnen:
- (Silk Extrakt Gewicht von Stufe 10) x (4) = ___________-ml insgesamt 9,3 M LiBr-Lösung
- [(807,705) x (LiBr Volumen von Teil 11 Teil A)] / 1000 = ___________ g LiBr zu dH 2 O hinzufügen
- Fügen gemessen LiBr Gewicht in ein Becherglas der folgenden dH 2 O Volumen:
- (0,8) x (berechnete Volumen von Schritt 11.a) = ___________ ml dH 2 O
- Gießen Sie die Lösung in eine geeignete Größe Messzylinder, und bring Lösung bis zum Endvolumen wie in Teil 11.a. berechnet
- Legen Sie die Seide Extrakt in das Becherglas und gießen LiBr-Lösung über die Seidenfasern darauf achten die Seidenfasern innerhalb LiBr-Lösung mit einem Spatel Labor eingetaucht sind.
- Setzen Sie den gelösten Seide in 60 ° C Ofen für 4 Stunden:
Startzeit: ___________
Endzeit: ___________- Unter Verwendung eines geeigneten Größe Spritze erarbeiten 12 ml der Lösung Seide. Legen Sie eine 18G Nadel am Ende der Spritze, und dann Injizieren Sie die Lösung in einen Dialyseschlauch Casette (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Nach Füllen der Kassette, um die verbleibende Luft aus der Kassette mit der Spritze geleert.
- Ort fiüssigkeitsgefüllte Dialyse Kassette in 1 l dH 2 O.
- Ändern Sie dH 2 O Volumen nach 1 Std., 4 Std., 8 Std. und dann alle 12 Stunden 3x für insgesamt 6 Änderungen:
- Beginn: ___________
- 1hr: ___________
- 4hr: ___________
- 8 Stunden: ___________
- 12 Stunden: ___________
- 12 Stunden: ___________
- 12 Stunden: ___________
- Ende: ___________
- Nach der Dialyse langsam sammeln die Seide Lösung von Kassetten mit Spritze. Platz-Lösung in 10.000 g rated Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge die Lösung zweimal bei 10.000 g bei 4 ° C für 20-min jeweils. Nach jeder Zentrifugation Ort Überstand in ein neues Röhrchen.
- Shop thr Seide Lösung in 4 ° C Kühlschrank.
- Pipette 2 Proben von 0,5 ml Lösung in kleine Seide wiegen Schale und setzen wiegen Gerichte in einem 60 ° C trocken Ofen für 12 Stunden oder bis die Seide Lösung trocknet.
- Wiegen Sie die verbleibende feste Seide Film von Both Proben auf Seide Lösung Prozent Gewicht zu Volumen Protein-Konzentration zu messen:
- Gehalt an gebundenem 2 Silk Filmproben: ___________ mg
- (Gewicht aus 23.a) x (100) = ___________% Seide
3. Vorbereitung der Silk Films und Kultur des System-Setup
- Bereiten PDMS Gussoberflächen durch eine Reinigung mit durchsichtigem Klebeband, um Staub zu entfernen.
- Saubere PDMS-Substrate durch Einweichen in 70% EtOH waschen und dreimal mit dH 2 O.
- Platz 14 mm PDMS Formen auf Halteplatte, die typischerweise eine Platte mit 24 Vertiefungen Deckel.
- Um eine 50 um dicke Folie zu produzieren, verbreiten 70 μls von 8% Seide Lösung auf PDMS-Gussformen unter Verwendung eines flüssigen Spreizwerkzeug, die typischerweise einer 1 ml Spritze Spitze 2.
- Lassen Sie die Seide Filme zum Trocknen auf einer sauberen Werkbank laufen einen Luftstrom von 150 Pa für einen Zeitraum von 90 min oder bis zum Filmen aufgedeckt sind trocken.
- Sobald Filme sind trocken lagern ganze Reihe von Filmen, darunter PDMS mPferde, in eine Wasser-Glühkammer für> 4 Stunden, um einen wasserunlöslichen Film zu erzeugen. Dies ist typischerweise eine leere Kammer Exsikkator mit Wasser im Boden des Beckens gezogen bei 25 kPa Vakuum 15.
- Entfernen Seide Filme aus Wasser-Glühkammer und Ort auf einer sauberen Werkbank.
- Bereiten Sie eine 70% EtOH Bad innerhalb einer 35 mm Petrischale, und statt Kontrolle Substraten (zB Glas oder Kunststoff-Oberflächen) und Edelstahlringe innerhalb Brunnen für mindestens 10 Minuten zu sterilisieren.
- Entfernen Seide Filme aus PDMS-Gussformen mit einer Pinzette, tauchen sie in 70% EtOH und Ort Probe in 24-Well-Platte mit 1 ml 70% EtOH darauf achten gemusterten Seite vorgefüllt stellt sich für die Zelladhäsion zu ermöglichen.
- Nach der Platzierung jedes Seide Film Probe in einen entsprechenden Platz auch Edelstahlring Gewichte (11,65 mm Innendurchmesser, 15,45 mm Außendurchmesser und 1,18 mm Dicke) an der Spitze.
- Werden die Proben mit Ringen für 10 Minuten, um die Sterilität zu gewährleisten inkubieren.
- Remove EtOH waschen und jede Probe mit 3x 1 mL PBS. Lassen Sie bei jedem Waschen 5 min stehen lassen, um für eine vollständige Diffusion zu ermöglichen.
- Entfernen Sie mit PBS Absaugen Glaspipette, wobei er darauf achtete, um Mehrheit von Blasen unter Seide Film Proben zu entfernen.
- Bereiten Zelllinie für die Aussaat. Als ein Beispiel, trypsinieren menschlichen Hornhaut-Kölbchen (HCLE) Zelllinie, die mit 0,25% Trypsin und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung für 7 min. Deaktivieren Trypsin unter Verwendung von 1:1 Volumen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) Kanal-Medien mit 10% FBS zugegeben. Zentrifugieren trypsinierten HCLE Zellen, fügen Sie 8-ml Keratinozyten-Serum-freien Medien (K-SFM) zu Zellpellet, vorsichtig geschwenkt, um HCLEs zerstreuen und erzeugen Zellzahl.
- Muster 500 ul pro Well HCLE Aufhängung in der Regel unter Verwendung einer 10.000 Zellen / cm 2 Dichte.
- Ort Kulturen innerhalb Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 und führen gewünschte experimentelle Protokoll.
4. Repräsentative Ergebnisse
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Abbildung 1. Flussdiagramm zusammengefasst 10-Schritt-Prozess aus Seide Filmproduktion und Kultursystem Vorbereitung.
Abbildung 2. (A) 21-Farbstoff Anordnung gemusterter Linie Oberflächentopographien auf einen Durchmesser von 90 mm Siliziumwafer Verwendung von Standard-Photolithographie und Trockenätzen Techniken hergestellt. (B) Silk Filme behalten ursprünglichen Linie parallel strukturierten Merkmale nach dem Gießen auf PDMS Formflächen. (C) Schematische demonstrieren Strukturgröße Design gewählt, um zelluläre Ausrichtung zu fördern. (D) Querschnitt der Seide Film illustriert beibehalten parallel aufgereiht gemusterte Oberfläche.
Abbildung 3. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HCLE Zelllinie Einhaltung (A) gemustertund (B) flach Seide Filme am Tag 2 in der Kultur. HCLE Kulturen weiterhin zur Konfluenz vermehren sich auf (C) gemustert und (D) ebene Flächen am Tag 8 in der Kultur.
Abbildung 4. (A, D, G) gemustert und (B, E, H) flach Seidenfilme Kultur HCLE Zellen vergleichsweise zu (C, F, I) Glas-Substrate bei Kontrolle (AC) Tag 1, (DF) Tag 4, und (GI) Tag 8 in der Kultur. (J) CyQuant Nukleinsäure Inhalt und (K) (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay Stoffwechselaktivität Daten, die zeigen HCLE Lebensfähigkeit sowohl auf strukturierten und flachen Substraten Seide Film wenn auf Glas Ruder im Laufe der Zeit (Maßstab = 100 um) verglichen.
Video 1. Zeitraffer Phasenkontrast-Bildgebung von Zellen HCLE Migration über einen gemusterten Seiden Filmoberfläche während einer 18 Stunden. Zeitraum. Die Zellen wurden bei 10k/cm 2-Dichte ausgesät und für 2 Stunden. vor Bildgebung. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Video 2. Zeitraffer Phasenkontrast-Bildgebung von Zellen HCLE Migration über eine flache Oberfläche TCP Kontrolle während eines 18 Stunden. Zeitraum. Die Zellen wurden bei 10k/cm 2-Dichte ausgesät und für 2 Stunden. vor Bildgebung. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Discussion
Die Verwendung von Seide regeneriert Filme als Substrat für die Zellkultur hat in der Popularität in den letzten zwei Jahrzehnten durch umfassende Charakterisierung der Werkstoffeigenschaften dieses Proteins gewonnen und erhöht das Verständnis seiner Biomaterial Dienstprogramm 3,8. Die Kultur hier beschriebene System stellt einen neuartigen In-vitro-Testsystem für die Beurteilung der Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen auf gemusterter Seide Film Biomaterial Substrate 7. Das System ermöglicht eine gründliche Analyse der zellulären Interaktionen im Laufe der Zeit, die leicht für High-Throughput-Datenerhebung angenommen werden kann. Dies ist weitgehend aktiviert, da Seidenfilme eine Reihe von abstimmbaren Biomaterial-Eigenschaften, die modifiziert werden, um unmittelbar auf die Zellfunktion 8,9,12 werden können, einschließlich besitzen: Kontrolle der oberflächlichen / nano-Oberflächentopographie 7; verschiedenen Oberflächenchemie durch kovalente Modifikation oder Adsorption von biologisch aktiven Molekülen 13; robust mechanisch Eigenschaften 15,16; Kontrolle von Material Hydrophilie / Hydrophobie 16; Bulkbeladung von biologischen Verbindungen zur Freigabe 4,8,17; und kontrollierte Auflösung / enzymatischen Abbauraten durch die Kontrolle der Sekundärstruktur (Beta-Faltblatt-Gehalt) 11,18,19 .
Die Transparenz der Seide Filme wird durch Tempern der Filme für einen Zeitraum unter Vakuum in Gegenwart von Wasserdampf 7,15 erreicht. Dieser Ansatz ermöglicht die Verarbeitung für die Bildung von β-Faltblatt-Sekundärstruktur, die Förderung der Unlöslichkeit des Materials in Wasser und ermöglicht minimale Beugung des Lichts 15. Diese Transparenz der Filme ist der Schlüssel in die eine direkte Bildgebung lebender Zellen, die unter einer Reihe von bildgebenden Verfahren (zB Weitwinkel-und Fluoreszenz) mit einer beliebigen Anzahl von Mikroskop-Systeme 12,20 eingesetzt werden können. Neben Live-Cell-Imaging, kann Seide Filme leicht von th entfernt werdenE-Kultursystem für zusätzliche Fixierung und Analyse zu ermöglichen. Somit sind die Vielzahl von direkten experimentellen Untersuchungen, die auf diesem System ausgeführt werden können, anwendbar auf eine Vielzahl von Zellen / Gewebe Quellen für die vielen technischen Bereichen 3,8,9,12,13,21. Die Zeitraffer-Imaging-Ergebnisse zeigen, wie Echtzeit-Kultur Daten gesammelt werden können, und als ein Beispiel verwendet wurden, um darzustellen, wie Oberflächentopographie Zell-Interaktionen beeinflusst. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie Seide Film Biomaterialien verwendet werden können, um HCLE Kulturwachstum zu unterstützen, und änderbare einer Reihe von Standard-Zellproliferation und metabolische Assays (4). Darüber hinaus werden die Kulturen fixiert und für die REM-Bildgebung oder anderen Protokollen (Abb. 3).
Silk Film Substrate werden im Labor mit hoher Genauigkeit, Konsistenz hergestellt, und mit relativ geringen Kosten (Abb. 1). Dies ermöglicht Reproduzierbarkeitkeit sowohl in Kultur das System-Setup und experimentellen Ergebnissen. Es hat sich gezeigt, dass Wasser-Glühen Verarbeitung eine stabile Seide Filmmaterial in der Kultur, die Abbauraten definiert wurde bis zur Konzentration von Proteasen in Lösung 2,15,22 produziert. Als Folge können diese Materialien für längere Zeit für eine langfristige Zellkulturen verwendet werden, oder bleiben für Monate oder Jahre in Abhängigkeit von der physiologischen Lage 8 implantiert. Darüber hinaus haben neuere Arbeiten gezeigt, dass sowohl die Protein-Struktur und Materialeigenschaften von Wasser-geglüht Seide Filme konsistent von Charge zu Charge ermöglicht für reproduzierbare Ergebnisse als Kultur durch verschiedene mechanische und biophysikalische Testmethoden 15,16 dargestellt sind. Darüber hinaus hat der Oberfläche des Materials großer Treue unter Chargen Film gezeigt, wie durch SEM, atomic force micrscopy (AFM), und Untersuchungen an Zellkulturen {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} angegeben 7,23,24. Material stabilITY und Konsistenz ist ein wichtiger Faktor dafür, wie die Zelle die Kultur Substrates durch die verschiedenen Wege Mechanotransduktion zu erfassen, und schließlich ein gewünschter / unerwünschte zelluläre Antwort 25,26.
Historische Standards für Kultur Substrate wie Gewebekultur behandelt Kunststoff oder Glas, für ausreichende Substrate für Zelladhäsion. Allerdings sind diese Materialien nicht für weitere in-vivo-Dienstprogramm geändert werden könnte. Es sollten daher durch ein seidenes Film Biomaterial in vitro konnte den Kundenwünschen angepasst werden, und einmal experimentellen Erwartungen erreicht wurden, die maßgeschneiderte Film kann direkt an ein in vivo Modell übersetzt werden. Solche Design gepaart zwischen in vitro und in vivo Experimenten bietet einen großen Vorteil für derartige implantierbare Biomaterialien Seide über andere Substrate, die routinemäßig in vitro verwendet werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Finanzierung von NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 und R01 EY020856 Forschung zur Erblindung Career Development Award, und Tri-Institutional Stem Cell Initiative verhindern. HCLE Zelllinie zur Verfügung gestellt mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ilene Gipson. Die Autoren danken Herrn Dr. Aihong Liu am Weill Cornell Medical College danken für ihre technische Unterstützung und Beratung mit Zellkultur, Anthony Labissiere am Hospital for Special Chirurgie für ihre technische Unterstützung mit SEM Bildgebung, das Tissue Engineering Resource Center (TERC) bei Tufts University für die technische Unterstützung bei der Materialentwicklung und der Cornell Center for Nanoscale Science and Technology Facility (CNF) um Unterstützung bei der Herstellung von Siliziumwafern.
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