Silk Film Kultur System för In vitro Analys och Biomaterial design

Summary

Silke filmer är en ny klass av biomaterial lätt anpassningsbara för en uppsättning av biomedicinska tillämpningar. Den presenterade siden filmkultur systemet är mycket anpassningsbart till olika

Abstract

Silk filmer är lovande protein-baserade biomaterial som kan tillverkas med hög trohet och ekonomiskt inom ett forskningsområde laboratoriemiljö ^1,2. Dessa material är önskvärda eftersom de besitter mycket kontrollerbar dimensionella och materialegenskaper, är biokompatibla och främja celladhesion, kan modifieras genom topografisk mönstring eller genom att kemiskt förändra ytan, och kan användas som en depå för biologiskt aktiva molekyler för närbesläktade läkemedelsavgivningssystem tillämpningar ^3-8. Dessutom, silke filmer är relativt enkelt att skräddarsy, kan utformas för att upplösas inom minuter eller brytas ned med år in vitro eller in vivo, och är producera med den ytterligare fördelen av att vara transparent i naturen och är därför mycket lämplig för avbildningstillämpningar ^{9 - 13.} Kulturen Systemet metoder som presenteras här är en skalbar metod för snabba bedömningar av cell-siden filmytaninteraktioner. Av särskilt intresse är användningen av ytan mönstrade siden filmer att studera skillnader i cell proliferation och svar från celler för anpassning ^12,14. De seedade kulturerna odlades på både mikro-mönstrade och platta siden substrat film, och sedan bedömas genom time-lapse faskontrast avbildning, svepelektronmikroskopi, och biokemisk bedömning av metabolisk aktivitet och nukleinsyra innehåll. Sammanfattningsvis erbjuder silke filmen in vitro-odlingssystem en anpassningsbar experimentuppställning lämplig för studier av cellyts-växelverkningar på ett biomaterial substrat, som sedan kan optimeras och översätts sedan till in vivo-modeller. Observationer med hjälp av odlingssystemet som presenteras här används för närvarande för att hjälpa i allt från grundläggande cell interaktioner till medicinsk enhet design, och därmed är relevanta för ett brett spektrum av biomedicinska områden.

Protocol

1. Tillverkning av silikongummi mögel

1. Producera eller köpa en önskad topografiska yta för gjutning. För denna publikation en standard 100 mm etsat kiselskiva kommer att beskrivas (figur 1).
2. Väg upp polydimetylsiloxan (PDMS) ingjutning (komponent A) och katalysator (komponent B) lösning i ett 1:9 förhållande (9 g ingjutning och 1 g katalysator) som föreskrivs i den köpta kit.
3. Blanda lösningar noggrant för att initiera härdningsprocessen.
4. Placera kiselskiva yta i en gjutning maträtt.
5. Väg upp 4,5 g av PDMS-lösning på kiselskivan.
6. Spridningen PDMS lösning för att täcka en yta 100 mm: s diameter skivytan.
7. Luta wafer att sprida PDMS lösningen jämnt.
8. Höljesskivan med 100 mm diameter Petri-skål lock.
9. Placera gjutning inställning i 60 ° C ugn över natten, vilket gör säker på att härdningen sker på en plan yta.
10. Ställe härdade PDMS / kiselskiva till 70% etanolbad före borttagning.
11. Börja ta bort PDMS från rånet med hjälp av rakblad för att lyfta kanten (hela omkrets) först.
12. Dra försiktigt PDMS bort med pincett inom en 70% etanol badet var noga med att inte slita silikongummi gjutning.
13. Punch Out enskilda PDMS formar med 14 slag mm hål. Denna diameter är utformad för att passa in i en 24-brunnsplatta konfiguration.

2. Produktion av Silk lösning

1. Bringa 2 L destillerat vatten (dHaO ₂ O) till kokning inom en glasbägare ^7.
2. Klipp 5 g Bombyx mori Silkeskokonger i tredjedelar.
3. Kasta omfattande förorenade kokonger som indikeras av överdriven insekt partiklar beläggning den inre kokong ytan.
4. Mäta 4,24 g natriumkarbonat.
5. Tillsätt natriumkarbonat långsamt till kokning dH ₂ O volym för att förhindra kokning över vatten, och tillåta fullständig upplösning innan den fortsätter.
6. Lägg kokong stycken till kokning dH
7. Efter kokning försiktigt rinna dH ₂ O i vasken och ring ut siden extraktet genom handen för att ta bort överflödigt vatten.
8. Tvätta silke extrahera tre gånger under 20 min. vardera i 1 L av dH ₂ O i ett laboratorium bägare, och använda en omrörarstav för att cirkulera volym inuti bägaren.
9. Efter tvättning, ring ut siden extraktet genom handen och placera siden fiber extrakt inuti en dragskåp för att möjliggöra för torkning för ett 12 timmar. period.
10. Nästa dag, väger de torkade silke fibrerna, vilket är normalt ~ 3,5 g: ___________-g
11. Förbered 9,3 M LiBr lösning för en 20% vikt / volym lösning av silke. Utnyttja följande ekvationer för att beräkna nödvändiga vikt och volymer:
    1. (Silke extrakt vikt från steg 10) x (4) = ___________-ml totalt 9,3 M LiBr lösning
    2. [(807,705) x (LiBr volym från del 11.a)] / 1000 = ___________ g LiBr lägga till dH ₂ O
    </ Li>
12. Tillsätt mätt LiBr vikt till en glasbägare av följande dH ₂ O volym:
    1. (0,8) x (beräknade volymen från steg 11.a) = ___________ ml dH ₂ O
13. Hälla denna lösning till en lämplig storlek mätcylinder, och bringa lösningen till den slutliga volymen som beräknats i del 11.a.
14. Placera siden extraktet till bägare och häll LiBr lösning under de siden fibrerna och se till att silke fibrerna är nedsänkta i LiBr med hjälp av en lab spatel.
15. Placera den upplösta silke i 60 ° C ugn under 4 timmar:
    Starttid: ___________
    Sluttid: ___________
16. Använda en lämplig storlek spruta upprätta 12 ml av silke lösningen. Placera en 18G nål på änden av sprutan och sedan injicera lösningen i en dialys spelare (3.500 MW coutoff, Slide-A-analysatorn, Thermo Scientific). Efter påfyllning kassetten, dra den återstående luften ur kassetten med den tömda sprutan.
17. Placera filled dialys kassett inom 1 liter dH ₂ O.
18. Ändra dH ₂ O volymen efter 1 timme, 4 timmar, 8 timmar och därefter var 12 timmar 3x för totalt 6 förändringar:
    1. Börjar: ___________
    2. 1 timme: ___________
    3. 4h: ___________
    4. 8 h: ___________
    5. 12 hr: ___________
    6. 12 hr: ___________
    7. 12 hr: ___________
    8. Slut: ___________
19. Efter dialys långsamt samla siden lösningen från kassetter med spruta. Placera lösningen i 10.000 g rankade centrifugrör.
20. Centrifugera lösningen två gånger vid 10.000 g vid 4 ° C under 20-minuter vardera. Efter varje centrifugering plats supernatanten till ett nytt rör.
21. Store Thr silke lösning i 4 ° C kylskåp.
22. Pipettera 2 prover av 0,5 ml silk-lösning i små väger skålen och plats väger rätter i en 60 ° C torr ugn i 12 timmar eller tills silke lösningen torkar.
23. Väg kvarvarande fasta siden film från both prov för att mäta silk vikt lösning procent till volym proteinkoncentration:
    1. Vikt av kombinerade 2 prov siden film: ___________ mg
    2. (Vikt från 23.a) x (100) = ___________% silke

3. Beredning av Silk Filmer och kultur System Setup

1. Förbered PDMS gjutning ytor genom rengöring med genomskinlig tejp för att avlägsna damm.
2. Ren PDMS substrat genom blötläggning i 70% EtOH och tvätta tre gånger med dH ₂ O.
3. Ställe 14 mm PDMS formar på hållarplattan, som typiskt är en 24-brunnsplatta lock.
4. För att producera en 50 m tjock film, spred 70 xl 8% silke lösning på PDMS formar med hjälp av en vätska sprids verktyg som är typiskt en 1 ml spruta Tips ^2.
5. Låt silke filmerna för att torka utan täckning på en ren bänk kör en tryck luftflöde på 150 Pa under en period av 90 minuter eller tills filmer är torra.
6. När filmer är torrt hel uppsättning filmer, däribland PDMS måldern, i en vatten-glödgning kammare för> 4 h för att producera en vattenolöslig film. Detta är typiskt en tom kammare exsickator med vatten i botten av bassängen drog i en 25 kPa vakuum ^15.
7. Ta bort siden filmer från vatten-glödgning kammaren och plats på en ren bänk.
8. Förbered en 70% EtOH bad inom en 35 mm petriskål och placera substrat kontroll (dvs glas eller plast ytor) och rostfritt stål ringar i brunnarna minst 10 min för att sterilisera.
9. Ta bort siden filmer från PDMS formar med hjälp av pincett, doppa dem i 70% EtOH, och placera provet i 24-brunnar förifyllda med 1 ml 70% EtOH och se mönstrade sidan är vänd uppåt för att möjliggöra celladhesion.
10. Efter placering av varje prov silke filmen in i en motsvarande och placera rostfritt vikter stålring (11,65 mm innerdiameter, 15,45 mm ytterdiameter och 1,18 mm tjocklek) på toppen.
11. Tillåta prover med ringar för att inkubera under 10 minuter för att säkerställa sterilitet.
12. Remove EtOH och tvätta varje prov 3x med 1 ml PBS. Låta varje tvättning sitta under 5 min för att medge fullständig diffusion.
13. Ta bort PBS med aspirerande glaspipett, och samtidigt se till att ta bort huvuddelen av bubblor under prover siden film.
14. Förbereda cellinje för ympning. Som ett exempel, Trypsinisera humant korneal-limbala epitelial (HCLE) cellinje med 0,25% trypsin och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för 7-min. Deaktivera trypsin med användning av 1:1 volym av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) passage medium med 10% FBS tillsattes. Centrifugera trypsinerade HCLE celler, tillsätt 8-ml keratinocyt-serumfritt media (K-SFM) till cellpelleten, skaka försiktigt för att skingra HCLEs, och generera celltal.
15. Exempel på 500 pl HCLE suspension per brunn normalt med hjälp av en 10.000 celler / cm ² densitet.
16. Ställe kulturer inom inkubator vid 37 ° C och _5% CO2 och kördes önskade försöksprotokoll.

4. Representativa resultat

<p klass = "jove_content">
Figur 1. Flödesschema som illustrerar sammanfattad 10-stegs process av silke filmproduktion och kultur systemet beredning.

Figur 2. (A) 21-färgämne samling av mönstrade kretsmönster line ytan produceras på en 90 mm ​​diameter kiselskiva användning av standardmetoder fotolitografiska och torretsning tekniker. (B) Silk filmer behåller original parallell linje mönstrade funktioner efter gjutning på PDMS gjutning ytor. (C) Schematisk visar karaktäristisk utformning som valts för att främja cellulär anpassning. (D) Tvärsnitt av siden filmen illustrerar kvar parallellt kantad mönstrad yta.

Figur 3. Svepelektronmikrofotografier av HCLE cellinje vidhäftar (A) mönstratoch (B) platta siden filmer på dag 2 i kultur. HCLE kulturer fortsätter att proliferera till konfluens på (C) mönstrad och (D) platta ytor på dag 8 i odling.

Figur 4. (A, D, G) Mönstrad och (B, E, H) platta filmer silkesodling HCLE celler relativt till (C, F, I) glas kontroll substrat på (AC) dag 1, (DF) Dag 4, och (GI) dag 8 i odling. (J) CyQUANT nukleinsyra innehåll och (K) (3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) metabolisk aktivitet analysdata visar HCLE viabilitet på både mönstrade och plana silke substrat film jämfört med glasytor kontroll över tid (Skalstrecken = 100 nm).

Video 1. Time lapse faskontrast avbildning av HCLE celler som migrerar över en mönstrad siden filmytan under en 18 timmar. tidsperiod. Celler såddes vid 10k/cm ² densitet och odlades under 2 h. tidigare bilder. Klicka här för att se filmen .

Video 2. Time lapse faskontrast avbildning av HCLE celler som migrerar över en plan TCP kontroll ytan under en 18 timmar. tidsperiod. Celler såddes vid 10k/cm ² densitet och odlades under 2 timmar. tidigare bilder. Klicka här för att se filmen .

Discussion

Användningen av regenererad siden filmer som substrat för cellodling har vunnit i popularitet under de senaste två decennierna på grund av omfattande karakterisering av materialegenskaper av detta protein och ökad förståelse av dess biomaterial användbarhet ^3,8. Kulturen som beskrivs här är en ny in vitro-testsystem för att bedöma interaktioner cellytan på mönstrade siden filmen biomaterial substrat ^7. Systemet gör det möjligt för en fördjupad analys av cellulära interaktioner över tiden som lätt kan antas för hög genomströmning datainsamling. Detta är till stor del aktiverat eftersom siden filmer har ett antal avstämbara biomaterial egenskaper som kan modifieras för att direkt påverka cellfunktionen ^8,9,12, inklusive: kontroll av ytan mikro / nano-ytans topografi ^7, olika ytor kemiska genom kovalent modifiering eller adsorption av biologiskt aktiva molekyler ^13; robust mekanical fastigheter ^15,16, kontroll av material hydrofilitet / hydrofobicitet ^16, delen lastning av biologiska föreningar för frisläppande ^4,8,17, och kontrollerad upplösning / enzymatiska priser nedbrytning genom kontroll av den sekundära strukturen (beta ark innehåll) ^11,18,19 .

Insynen i siden filmer uppnås genom glödgning filmerna under en tid under vakuum i närvaro av vattenånga ^7,15. Denna behandling tillvägagångssätt medger bildning av β ark sekundär struktur, befrämjade olöslighet av materialet i vatten samtidigt som minimal diffraktion av ljus ^15. Denna öppenhet filmer är nyckeln för att direkt levande cell imaging som kan användas under ett antal avbildningsmetoder (dvs. brett fält och fluorescens) med valfritt antal mikroskop system ^12,20. Förutom live-cell imaging, kan silke filmer lätt tas bort från ee kultur för att möjliggöra ytterligare fixering och analys. Således, den stora variation av direkta experimentella bedömningar som kan utföras på detta system är tillämpliga på en mängd olika celler / vävnader källor för många tekniska områden ^{3,8,9,12,13,21.} De tidsförlopp avbildande resultat illustrerar hur realtid kultur data kan samlas in, och som ett exempel användes för att illustrera hur yttopografi påverkar cell-interaktioner. De representativa resultat visar hur silke film biomaterial kan användas för att stödja HCLE kulturtillväxt och är kan ändras på ett antal standard cellulär proliferation och metaboliska analyser (fig. 4). Dessutom är de kulturer fixerades och bearbetades för svepelektron avbildning eller andra protokoll (fig. 3).

Silk film substrat produceras i labbet med hög trohet, konsekvens och med relativt låg kostnad (Fig. 1). Detta möjliggör reproduciansvar för både kultur systeminstallation och experimentella resultat. Det har visats att vatten-glödgning bearbetning ger ett stabilt material silk filmen inom kultur som har definierat förstöras i väntan på koncentrationen av proteaser i lösning ^2,15,22. Som ett resultat av dessa material får användas under en längre tid för långsiktig cellodling, eller förblir implanteras i månader eller år beroende på den fysiologiska plats ^8. Dessutom har senare arbete visat att både proteinet struktur och materialegenskaper av vatten-glödgad silke filmer är konsekvent från parti till parti möjliggör reproducerbara kultur resultaten som visas genom olika mekaniska och biofysiska testmetoder ^15,16. Dessutom har materialets yta visat stor trohet mellan film partier som indikeras av SEM, Atomic Force micrscopy (AFM) och cellkulturstudier {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Materialet stabiltet och konsistens är en viktig faktor för hur cellen kommer att avkänna odlingssubstratet genom de olika mechanotransduction vägar, och slutligen producera en önskad / oönskad cellulär respons ^25,26.

Historiskt sett för odlingssubstrat, såsom vävnad som behandlas kultur plast eller glas, tillhandahålla adekvata substrat för cellvidhäftning. Emellertid är dessa material inte kan ändras för att ytterligare användbarhet in vivo. Det kan tänkas att en silk film biomaterial kan anpassas in vitro, och när experimentella förväntningar har uppnått anpassade filmen direkt kan översättas till en in vivo-modell. Sådan parade utformning mellan in vitro och in vivo experiment har en stor fördel för sådana implanterbara siden biomaterial över andra substrat som rutinmässigt används in vitro.