Système de culture de la soie du film pour In vitro Analyse et conception des biomatériaux

Summary

Films en soie sont une nouvelle classe de biomatériaux facilement personnalisables pour un large éventail d'applications biomédicales. Le système de soie présenté la culture cinématographique est très adaptable à une variété de

Abstract

Films de la soie sont prometteurs à base de protéines biomatériaux qui peuvent être fabriqués avec une grande fidélité et économiquement dans un environnement de recherche en laboratoire ^1,2. Ces matériaux sont souhaitables car elles possèdent très contrôlables caractéristiques dimensionnelles et matérielles, sont biocompatibles et favoriser l'adhérence des cellules, peuvent être modifiées par un motif topographique ou par modification chimique de la surface, et peut être utilisé comme un dépôt de molécules biologiquement actives pour des applications de livraison liés à la drogue ^3-8. En outre, les films de soie sont relativement simples à la conception personnalisée, peuvent être conçus pour se dissoudre en quelques minutes ou de dégrader au fil des ans in vitro ou in vivo, et sont de produire avec l'avantage supplémentaire d'être transparent dans la nature et donc très adapté pour les applications d'imagerie ^{9 - 13.} La méthodologie présentée ici système de culture représente une approche évolutive pour des évaluations rapides de la surface du film de cellule de soieinteractions. D'intérêt particulier est l'utilisation de films de surface de soie à motifs pour étudier les différences dans la prolifération cellulaire et les réponses des cellules pour l'alignement ^12,14. Les cultures ensemencées ont été cultivées à la fois sur les micro-motifs et plats substrats de films de soie, puis évalué par time-lapse d'imagerie à contraste de phase, microscopie électronique à balayage, et l'évaluation biochimique de l'activité métabolique et la teneur en acide nucléique. En résumé, le film de soie dans le système de culture in vitro offre une configuration personnalisable expérimentale appropriée à l'étude de la surface cellulaire des interactions sur un substrat biomatériau, qui peuvent ensuite être optimisés et ensuite traduit dans des modèles in vivo. Observations à l'aide du système de culture présentées ici sont actuellement utilisés pour aider dans des applications allant des interactions cellulaires de base à la conception de dispositifs médicaux, et sont donc pertinents pour un large éventail de domaines biomédicaux.

Protocol

1. Fabrication de moules en caoutchouc de silicone

1. Produire ou acheter une surface topographique souhaitée pour la coulée. Pour cette publication, une norme de 100 mm plaquette de silicium gravée sera décrite (Figure 1).
2. Peser polydiméthylsiloxane (PDMS) enrobage (composant A) et le catalyseur (composant B) solution dans un rapport de 1:9 (9 g d'empotage et de 1 g de catalyseur) tel que prévu dans le kit acheté.
3. Mélanger soigneusement des solutions pour lancer processus de durcissement.
4. Surface de la plaquette de silicium Lieu dans un plat de coulée.
5. Peser 4,5 g de solution PDMS sur tranche de silicium.
6. Propagation PDMS solution à recouvrir une zone de 100 mm diamètre de la surface de la plaquette.
7. Inclinez plaquette de répandre solution PDMS uniformément.
8. Couvrir plaquette avec 100 mm de diamètre couvercle boîte de Pétri.
9. Lieu de coulée de configuration dans le four à 60 ° C pendant la nuit, ce qui rend certains que le durcissement se déroule sur une surface plane.
10. Lieu guéri PDMS / plaquette de silicium dans l'éthanol à 70%salle de bain avant de les enlever.
11. Commencez à retirer à partir de PDMS plaquette en utilisant une lame de rasoir pour soulever bord (circonférence) en premier.
12. Tirez doucement sur PDMS hors aide d'une pince dans un bain d'éthanol 70% en faisant attention à ne pas déchirer la coulée de caoutchouc de silicone.
13. Punch out moules individuels à l'aide de PDMS 14 mm de perforation. Ce diamètre est conçu pour s'intégrer dans une configuration de plaque de 24 puits.

2. La production de soie Solution

1. Apportez 2 L d'eau distillée (dH ₂ O) à ébullition dans un bécher ^de verre ^7.
2. Couper 5 g de cocons de vers à soie Bombyx mori en trois tiers.
3. Éliminer des cocons largement contaminés, comme indiqué par les insectes particules revêtement de la surface intérieure excessive cocon.
4. Mesurer 4,24 g de carbonate de sodium.
5. Ajouter lentement le carbonate de sodium à l'ébullition dH ₂ O pour empêcher le volume de déborder de l'eau, et de permettre la dissolution complète avant de continuer.
6. Ajouter les morceaux de cocon à ébullition dH
7. Après la cuisson, égoutter soigneusement dH ₂ O dans l'évier et la bague à l'extrait de soie à la main pour enlever l'excès d'eau.
8. Lavez la soie extraire trois fois pendant 20 min. chacun dans 1 L de dH ₂ O dans un bécher de laboratoire, et d'utiliser une barre d'agitation pour faire circuler volume dans le bécher.
9. Après le lavage, la bague à l'extrait de soie à la main et l'extrait de la fibre de soie à l'intérieur lieu une hotte chimique pour permettre le séchage pour un h 12. période.
10. Le lendemain, peser les fibres de soie séchés, ce qui est typiquement ~ 3,5 g: ___________-g
11. Préparer une solution 9,3 M pour une LiBr 20% p / v de la soie. Utiliser les équations suivantes pour calculer le poids nécessaire et volumes:
    1. (Poids d'extrait de soie de l'étape 10) x (4) = ___________ ml de solution 9,3 M au total LiBr
    2. [(807,705) x (volume de LiBr à partir de la pièce 11.a)] / 1000 g = ___________ de LiBr à ajouter à dH ₂ O
    </ Li>
12. Ajouter du poids LiBr mesurée dans un bécher de verre de ce qui suit dH ₂ O du volume:
    1. (0,8) x (volume calculé de l'étape 11.a) = ___________ ml de dH ₂ O
13. Verser cette solution dans une éprouvette graduée de taille appropriée, et apporter une solution au volume final tel que calculé dans le cadre 11.a.
14. Placez l'extrait de soie dans un bécher et verser la solution de LiBr sur les fibres de soie en s'assurant que les fibres de soie sont immergés dans une solution de LiBr aide d'une spatule de laboratoire.
15. Placez la soie dissous dans 60 ° C four pendant 4 heures:
    Heure de début: ___________
    Heure de fin: ___________
16. Utilisation d'une seringue de taille appropriée élaborer 12 ml de la solution de la soie. Placez une aiguille 18G sur la fin de la seringue, puis injecter la solution dans une cassette de dialyse (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Après le remplissage de la cassette, aspirer l'air restant hors de la cassette avec la seringue vidée.
17. Lieu ficassette de dialyse lled dans 1 L de dH ₂ O.
18. Changer dH ₂ O du volume après 1 h, 4 h, 8 h, puis toutes les 12 heures 3x pour un total de 6 changements:
    1. Début: ___________
    2. 1h: ___________
    3. 4h: ___________
    4. 8 h: ___________
    5. 12 h: ___________
    6. 12 h: ___________
    7. 12 h: ___________
    8. Fin: ___________
19. Après la dialyse, lentement recueillir la solution de la soie à partir de cassettes avec une seringue. Placer dans la solution des tubes à centrifuger g 10.000 notés.
20. Centrifuger la solution deux fois à 10000 g à 4 ° C pendant 20 min chacun. Après chaque surnageant de centrifugation lieu dans un nouveau tube.
21. Conserver la solution de soie thr dans le 4 ° C réfrigérateur.
22. Prélever 2 échantillons de 0,5 ml solution de soie en petits peser la capsule, et le lieu pèsent plats dans un four à 60 ° C à sec pendant 12 heures ou jusqu'à ce que la solution ne sèche soie.
23. Peser le film de soie reste solide à partir de both des échantillons pour mesurer pour cent en poids de soie solution à la concentration de protéines de volume:
    1. Poids du combiné 2 échantillons de films de soie: ___________ mg
    2. (Poids du 23.a) x (100) = ___________% soie

3. Préparation de films de soie et d'installation de système de culture

1. Préparer les surfaces de moulage de PDMS par le nettoyage avec du ruban adhésif clair pour enlever la poussière.
2. Clean PDMS substrats par trempage dans de l'EtOH 70% et laver trois fois avec dH ₂ O.
3. Lieu 14 mm sur la plaque de moules PDMS titulaire, qui est généralement un couvercle plaque à 24 puits.
4. Pour produire un film de 50 um d'épaisseur, la propagation de la solution 70 μls soie 8% sur les moules en PDMS en utilisant un outil de liquide répandu qui est typiquement une seringue de 1 ml pointe ^2.
5. Permettre à des films de soie pour sécher non couvert sur un banc propre exécutant une pression d'écoulement d'air de 150 Pa pendant une période de 90 minutes, ou jusqu'à films sont sèches.
6. Une fois que les films sont un endroit sec toute série de films, y compris PDMS mâgés, dans une chambre de l'eau-recuit pendant plus de 4 heures pour produire un film insoluble dans l'eau. Il s'agit généralement d'une chambre vide avec de l'eau dessicateur dans le fond du bassin tiré à un vide de 25 kPa ^15.
7. Retirez les films de soie en provenance de l'eau-de recuit chambre et le lieu sur un banc propre.
8. Préparer un bain EtOH 70% dans un plat de 35 mm de Pétri, et les substrats de contrôle de lieux (de verre ou des surfaces en plastique) et des anneaux en acier inoxydable dans des puits pendant au moins 10 min à stériliser.
9. Retirez les films de soie à partir de moules en PDMS en utilisant une pince, trempez-les dans EtOH à 70%, et l'échantillon lieu dans 24 puits de plaque pré-remplie avec 1 ml d'EtOH à 70% en s'assurant face à dessin est orienté vers le haut pour permettre l'adhésion cellulaire.
10. Après avoir placé chaque échantillon de film de soie dans un lieu qui correspond bien inoxydable poids bague en acier (11,65 mm de diamètre intérieur, 15,45 mm de diamètre extérieur, et de 1,18 mm d'épaisseur) sur le dessus.
11. Laisser les échantillons avec des anneaux à incuber pendant 10 minutes pour garantir la stérilité.
12. Remove EtOH et laver chaque échantillon 3x avec 1 ml de PBS. Que chacun de lavage s'asseoir pendant 5 min pour permettre la diffusion complète.
13. Retirer à l'aide du PBS pipette en verre d'aspiration, tout en veillant à éliminer la majorité des bulles sous échantillons de films de soie.
14. Préparer lignée cellulaire pour l'ensemencement. A titre d'exemple, trypsiniser cornéen humain-limbique ligne cellules épithéliales (HCLE) avec de la trypsine 0,25% et l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour une solution de 7 minutes. Désactiver la trypsine en utilisant 01h01 volume de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) les médias de passage avec FBS 10% ajouté. Centrifuger les cellules trypsinisées HCLE, ajouter 8 mL de kératinocytes milieux exempts de sérum (K-SFM) à culot cellulaire, agiter doucement pour disperser HCLEs, et de générer le nombre de cellules.
15. Échantillon de 500 ul de la suspension HCLE par puits typiquement en utilisant un 10000 cellules / cm ² de densité.
16. Cultures au sein de la Place étuve à 37 ° C et 5% de CO ₂ et d'exécuter souhaité protocole expérimental.

4. Les résultats représentatifs

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Diagramme Figure 1. Illustrant résumé 10-étape du processus de la production cinématographique de soie et de préparation du système de culture.

Figure 2. (A) 21-colorant tableau de topographies de surface à motifs en ligne produites sur une plaquette de silicium de diamètre 90 mm ​​utilisant des techniques standard de gravure de photolithographie et sec. (B) des films de la soie d'origine conservent les caractéristiques de lignes parallèles à motifs après la coulée sur des surfaces de moulage de PDMS. (C) Schéma de conception démontrant dimension de l'élément choisi, pour promouvoir l'alignement cellulaire. (D) de la Croix-section de film illustrant la soie retenu surface parallèle bordée motifs.

Figure 3. Microscope électronique à balayage de la lignée cellulaire HCLE adhérant à (A) à motifset (B) des films de soie plates à jour 2 dans la culture. Cultures HCLE continuent de proliférer au confluent sur (C) à motifs et (D) des surfaces planes dans les 8 jours dans la culture.

Figure 4. (A, D, G) à motifs et (B, E, H) plats films de soie cellules HCLE culture relativement à (C, F, I) des substrats de verre à contrôle (AC) 1 jour, (DF) le jour 4, et 8 jours (IG) dans la culture. (J) contenu CyQuant acide nucléique et (K) (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) métaboliques des données de dosage d'activité prouvant la viabilité HCLE sur deux motifs et plates substrats de film de soie par rapport aux surfaces de contrôle du verre au fil du temps (barres d'échelle = 100 m).

Vidéo 1. Laps de temps d'imagerie à contraste de phase de cellules qui migrent HCLE sur une surface du film de soie à motifs au cours d'une heure 18. période de temps. Les cellules ont été ensemencées à la densité 10k/cm ² et cultivées pendant 2 heures. avant l'imagerie. Cliquez ici pour voir le film .

Vidéo 2. Laps de temps d'imagerie à contraste de phase de cellules qui migrent HCLE sur une surface de contrôle TCP plat au cours d'une heure 18. période de temps. Les cellules ont été ensemencées à la densité 10k/cm ² et cultivées pendant 2 h. avant l'imagerie. Cliquez ici pour voir le film .

Discussion

L'utilisation de films de soie régénérées en tant que substrat pour la culture cellulaire a gagné en popularité au cours des deux dernières décennies en raison de la caractérisation détaillée des propriétés des matériaux de cette protéine et une meilleure compréhension de son utilité biomatériau ^3,8. Le système de culture décrit ici représente un roman dans le système de test in vitro pour évaluer les interactions de surface cellulaire sur soie à motifs film de substrats biomatériau ^7. Le système permet une analyse en profondeur des interactions cellulaires au cours du temps qui peut être facilement adoptées pour haut-débit de collecte de données. Ceci est en grande partie parce que les films ont permis de soie possèdent un certain nombre de propriétés des biomatériaux accordables qui peut être modifié pour influer directement sur ​​la fonction des cellules ^8,9,12, y compris: le contrôle de la surface de micro / nano-topographie de la surface ^7; chimies de surface différents grâce à la modification covalente ou par adsorption de molécules biologiquement actives ^13; robuste mechpropriétés anical ^15,16, le contrôle du matériel hydrophilie / hydrophobie ^16; chargement en vrac de composés biologiques pour la libération ^4,8,17, et la dissolution contrôlée / taux de dégradation enzymatique par le contrôle de la structure secondaire (contenu feuillet bêta) ^11,18,19 .

La transparence de films de soie est obtenu grâce à un recuit des films pendant une période de temps sous vide en présence de vapeur d'eau ^7,15. Cette approche de traitement permet à la formation de β-feuille de la structure secondaire, en favorisant l'insolubilité de la matière dans l'eau tout en permettant de diffraction de la lumière minimale ^15. Cette transparence est la clé de films en permettant directe imagerie des cellules vivantes qui peuvent être employés en vertu d'un certain nombre de modalités d'imagerie (c.-à-grand-champ et de la fluorescence) en utilisant un certain nombre de systèmes de microscopes ^12,20. En plus de l'imagerie des cellules vivantes-, films de soie peut être facilement retiré de eSystème de culture pour permettre e pour la fixation et une analyse supplémentaires. Ainsi, la grande variété de directs des évaluations expérimentales qui peuvent être effectuées sur ce système sont applicables à une grande variété de cellules / tissus sources pour de nombreux domaines techniques ^{3,8,9,12,13,21.} Les résultats d'imagerie time-lapse d'illustrer comment les données de la culture en temps réel peuvent être recueillis, et à titre d'exemple ont été utilisés pour illustrer la façon dont la topographie de surface influe sur les interactions cellulaires. Les résultats représentatifs démontrer comment biomatériaux films de soie peut être utilisée pour soutenir la croissance de la culture HCLE, et sont modifiables à un certain nombre de prolifération cellulaire standard et tests métaboliques (Fig. 4). En outre, les cultures sont fixées et traitées à balayage électronique d'imagerie ou d'autres protocoles (fig. 3).

Substrats de films de la soie sont produites dans le laboratoire avec une grande fidélité, la cohérence, et avec un coût relativement faible (fig. 1). Cela permet la reproductibilitébilité à la fois dans la configuration du système de la culture et les résultats expérimentaux. Il a été démontré que l'eau-de recuit de traitement produit un tissu de soie stable film dans la culture qui a défini les taux de dégradation en attendant la concentration de protéases en solution ^2,15,22. En conséquence, ces matériaux peuvent être utilisés pendant de longues périodes de temps pour la culture cellulaire à long terme, ou rester implanté depuis des mois ou des années en fonction de l'emplacement physiologique ^8. En outre, des travaux récents ont montré que la structure des protéines et les propriétés des matériaux de films de soie de l'eau-recuits sont compatibles d'un lot à permettre des résultats de culture reproductibles comme le montre par le biais de diverses méthodes d'essais mécaniques et biophysiques ^15,16. En outre, la surface du matériau a montré une grande fidélité parmi les lots de films, comme indiqué par SEM, atomique micrscopy vigueur (AFM), et les études de culture cellulaire {Laurent: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. La stabilité des matériauxlité et la cohérence est un facteur important de la façon dont la cellule sentira le substrat de culture à travers les voies mécanotransduction différents, et finissent par produire une réponse désirée / indésirable cellulaire ^25,26.

Normes historiques pour substrats de culture, comme le plastique de culture tissulaire traitée ou en verre, des substrats adéquats pour la fixation des cellules. Toutefois, ces matériaux ne sont pas amendables pour cause d'utilité encore in vivo. Il peut être envisagé que la soie du film biomatériau peuvent être personnalisés in vitro, et une fois les attentes expérimentales ont été réalisées le film personnalisé peut être directement convertis en un modèle in vivo. Une telle conception jumelé entre données in vitro et l'expérimentation in vivo présente un grand avantage pour ces biomatériaux implantables de soie sur des substrats autres qui sont couramment utilisés in vitro.