Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) som ett verktyg för att visualisera mikroinjiceras molekyler och deras Eukaryota Sub-cellulära mål

Summary

Den FÖRHUNGRA Tekniken har anpassats för att analysera ultrastrukturella morfologi av membran, organeller och subcellulära strukturer som berörs av mikroinjicerade molekyler. Denna metod kombinerar de kraftfulla tekniker för mikromanipulering / mikroinjektion, konfokal fluorescensmikroskopi, och elektronmikroskopi att tillåta millimeter till flera nanometer upplösning. Denna teknik är mottaglig för en mängd olika tillämpningar.

Abstract

Den eukaryota cellen bygger på komplexa, starkt reglerad, och funktionellt distinkta membranbundna fack som bevarar en biokemisk polaritet nödvändig för korrekt cellulär funktion. Förstå hur enzymer, proteiner och cytoskelettala komponenter styr och upprätthåller denna biokemiska segregering är därför av största vikt. Användningen av fluorescerande taggade molekyler att lokalisera och / eller störa subcellulära fack har gett en mängd kunskap och avancerade vår förståelse av cellulär reglering. Avbildningstekniker såsom fluorescerande och konfokalmikroskopi gör fastställa positionen för en fluorescent märkt liten molekyl relativt okomplicerad, är dock upplösningen av mycket små strukturer begränsad ^1.

Å andra sidan, har elektronmikroskopi avslöjade detaljer om subcellulär morfologi vid mycket hög upplösning, men dess statiska karaktär gör det svårt att mäta mycket dynamisk proprocesser med precision ^2,3. Sålunda ger kombinationen av Ijusmikroskopi med elektronmikroskopi av samma prov, benämnd Korrelat ljus-och elektronmikroskopi (FÖRHUNGRA) ^4,5, de dubbla fördelarna med ultrasnabb fluorescerande avbildning med hög upplösning av elektronmikroskopi ^6. Denna kraftfulla teknik har genomförts för att studera många aspekter av cellbiologi ^5,7. Sedan starten har detta förfarande ökat vår förmåga att skilja subcellulära arkitekturer och morfologier med hög upplösning.

Här presenterar vi en strömlinjeformad metod för att utföra en snabb mikroinjektion följt av FÖRHUNGRA (Fig. 1). Mikroinjektion FÖRHUNGRA Förfarandet kan användas för att införa särskilda mängder av små molekyler och / eller proteiner direkt in i eukaryota cellens cytoplasma och studera effekterna av millimeter till flera nanometer upplösning (Fig. 2). Tekniken är baserad på microinjectingceller odlas på laser etsat glas rutindelade täckglas som sitter på undersidan av levande celler rätter och bildhantering med både konfokal fluorescerande och elektronmikroskopi. Lokalisering av cellen (er) av intresse underlättas av rutnätsmönstret, som lätt överförs, tillsammans med cellerna av intresse, till Epon harts som användes för immobilisering av prover och sektionering före elektronmikroskopi analys (fig. 3). Överlagring av fluorescerande och EM bilder låter användaren bestämma subcellulära lokalisering samt eventuella morfologiska och / eller ultrastrukturella förändringar inducerade av mikroinjicerade molekylen av intresse (bild 4). Denna teknik är mottaglig för tidpunkter varierande från ≤ 5 s upp till flera timmar, beroende på typen av mikroinjicerade provet.

Protocol

1. Däggdjurscellkultur

1. Normal råttnjure (NRK), immortaliserade livmoderhalscancer (HeLa), eller andra lämpliga däggdjurscellinjer odlas vid 37 ° C, 5% CO _2, på fotoetsade glas rutindelade täckglas anbringas på levande cell rätter (se tabell 1 för varje reagens eller apparat som används i detta protokoll) i DMEM + 10% FBS och 1% Pen / Strep. Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att upprätthålla en steril miljö när du arbetar med odlade däggdjursceller.
2. Beroende på din experimentella tidslinje (0-5 timmar vs 1-2 dagar efter injektion) den konfluens av celler bör justeras till ~ 50% eller ~ 25%, respektive.

2. Mikroinjektion

1. Förbered önskat protein, DNA, eller små molekyler i ditt val av buffert, beroende på dess mottaglighet för cellulär kultur, till en slutlig volym av ~ 50 | il. Inerta fluorescerande färgämnen såsom Texas Red eller Cascade Blueingår i för att markera de mikroinjicerade celler, val av injektion färg och fluorescerande prob bör ha icke-överlappande excitations-och emissionsvåglängder. Koncentrationen av din molekyl av intresse som behövs för mikroinjektion bör bestämmas empiriskt, och de fluorescerande färgämnena spårning används vanligen vid 0,5-1,0 mg / ml. Typiskt rodamin eller annan fluorofor kovalent bunden till molekylen av intresse med användning av ett kommersiellt kit, men andra metoder för detektering kan användas beroende på känslighet. För mer information, se kritiska överväganden nedan.
2. Filtrera injiceringsmedlet (~ 50 | il) genom en 0,22 fim centrifugalfilter. Centrifugalfilter föredras framför vakuum och / eller spruta filtrering som har associerade dödvolymer.
3. För att generera mikroinjektion nål är borosilikatglas pipetter dras med en flammande-Brown mikropipett Puller följande tillverkare riktlinjer. Alternativt, mikroinjektionnålar kan köpas från leverantörer inklusive Eppendorf som gör nålar femtotip mikroinjektion.
4. Försiktigt pipettera 4 pl injiceringsmedlet in oantastade änden av mikroinjektion nål med Eppendorf 20 Femtotips. Se till att inga bubblor finns i drog mikroinjektion nål. Ladda mikroinjektion nål i mikromanipulator arm Eppendorf FemptoJet Injectman fäst till ett inverterat mikroskop. För en bra genomgång av mikroinjektion förfarande, läsaren till ett tidigare Journal of visualiseras experiment artikel ^8.
5. Placera levande celler skålen med inrutade täckglas och odlade celler i skålen innehavaren av det inverterade Zeiss mikroskop. Hitta celler som växer i en fotoetsade galler och notera galler alfanumerisk identifierare kommer detta att användas i alla efterföljande steg. Helst lokalisera celler i mitten av täckglaset som efterföljande steg kommer att begränsa provöverföring vid kanterna av täckglaset.
6. Manuellt lägre injektion armen på plats över täckglas och använda mikromanipulator joystick och kontroller, lägre injektionsnål tills spetsen vidrör ytan av de odlade cellerna och tryck på 'Limit att förhindra förflyttning av nålen bortom denna punkt och därmed bryta den bräckliga drog borsilikatglas. Alla andra aspekter av cellens mikroinjektion utförs enligt Eppendorf FemtoJet InjectMan bruksanvisning. Mikroinjektion tekniken användes nyligen för att förstå enskilda utsöndrade virulens proteiner från bakterier ^9.
7. Microinject varannan cell i det valda nätet. Med celler odlas vid ~ 50% konfluens, kan man förvänta ~ 80 celler per 600 ^ m ² rutnät (exemplet som visas i fig.. 3A). Därför, på fluorescens-och elektronmikroskopi inspektion, kommer det att finnas en n ~ 30-40 experimentella och celler kontroll.
8. Placera levande celler maträtt tillbaka till däggdjurscellkultur inkubator för önskadtid dikteras som av experimentuppställning. Alternativt kan man gå direkt från mikroinjektion till tidsförlopp mikroskopi analys för att invänta uppträdandet av vissa subcellulära strukturer av intresse före fixering.

3. Fluorescensmikroskopi

1. Om så önskas, uppträda live-cell tidsförlopp fluorescensmätningar av mikroinjicerade celler, varefter ersätta media med 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert (pH 7,4) och inkubera i 10 min vid rumstemperatur. Men, om levande cell mätningar inte krävs, kassera celltillväxtmedium och fixera cellerna med 5 ml 3,7% formaldehyd i 1 x PBS vid rumstemperatur under 10 minuter. Kasta fixativ och ersätt med 5 ml 1 x PBS, gå vidare till steg 3,2. Obs: Det är viktigt att inte lägga glutaraldehyd förrän fluorescensmikroskopi är klar.
2. Placera levande celler skålen med fotoetsade inrutade täckglas i ett fluorescerande mikroskop (är konfokal inte för this steg) och samla 5-10 ljusfält och fluorescerande bilder av önskad fyrkant att dokumentera arrangemanget av celler (fig. 4A). Identifiera de celler som har mikroinjicerade använda excitations-och emissionsvåglängder av den inerta injektionen färgämnet (figur 4B). Det är viktigt att få bilder med olika förstoringar (t.ex. 10x och 65x) för att underlätta identifieringen av mikroinjicerade celler i efterföljande steg involverar elektronmikroskopi.
3. Med hjälp av en konfokalt fluorescensmikroskop, samla en Z-stapel av mikroinjicerade celler i rutnätet identifierats i steg 2,5 ovan. Hög förstoring (100x) behövs för att korrelera fluorescerande bilder med subcellulära strukturer som kommer att identifieras i elektronmikroskopi.
4. Täckglasen tas bort från botten av de levande cell rätter med kommersiellt tillgängliga täckglas bort vätska och placeras cell uppåt i ett orört cellodling skål innehållande 5 ml1 x PBS. Täckglaset bearbetas sedan för elektronmikroskopi såsom anges nedan.

4. Transmissionselektronmikroskopi

1. Ersätt 1 x PBS-buffert med 2 ml 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert (pH 7,4) och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter. Längre inkubation, medan inte nödvändigt, kommer att underlätta i underhåll av subcellulära strukturer. Obs: formaldehyd enbart är inte tillräckligt fixativ för EM-analys.
2. Avlägsna fixativ och fläcken celler med tillsats av 2 ml 1% osmiumtetroxid i 0,1 M kakodylat-buffert under 30 min följt av tre tvättningar med kakodylatbuffert och slutligen ersätta alla buffert med DDH ₂ O
3. Efter standard EM-protokoll, torkar provet i en graderad (70% till 100%) serie av etanol. Förbered Epon-harts och täckglas plats cell-sidan nedåt ovanpå en Epon-harts-fyllda rör. Tillåt polymerisation under 24 h vid 60 ° C. Genom att placera fotoetsade inrutade täckglas cell-sida görwn på Epon hartset, är båda cellerna av intresse liksom rutmönster överförs till Epon hartset under polymerisationen (exempel som visas i fig.. 3B).
4. Avlägsna täckglas från Epon-harts genom att snabbt nedsänkning i flytande kväve och / eller kokande vatten. Inspektera ytan av hartset under en kikare dissektion omfattning att lokalisera nätet av intresse (notera: nätet smattra överför som en spegelbild). Använd en steril rakblad eller skalpell, trimma Epon block ner så att endast gallret av intresse är vid spetsen av Epon harts blocket.
5. Använda en ultramikrotom förvärva seriella sektioner av trimmade blocket vid önskad tjocklek (~ 70 nm tjocklek för konventionell TEM och ~ 250 nm tjocklek för tomografisk TEM). Kontrast sektionerna med uranylacetat och blycitrat följa standardprotokoll.

5. Korrelat ljus-och elektronmikroskopi

1. Flytta celler av intresse ielektronmikroskopet använder bilder som erhållits i tidigare steg. När mikroinjicerade celler av intresse har lokaliserats, använd högupplösta konfokala fluorescerande bilder för att identifiera områden inom cellen som var av intresse. Bild dessa vid hög upplösning med TEM. Använd landmärken som cellen periferi och kärnhöljet att avgöra vilka fluorescerande z-stack bild motsvarar EM skiva.
2. Använda Imaging valfritt program (t.ex. Bild J, Adobe Photoshop, etc.), minska opaciteten för den fluorescerande bilden till 50% och överdraga den på TEM bild som den korrelerar. Rikta bilderna genom att justera skalan (kom ihåg att begränsa proportionerna) och rotationen av den konfokala bilden för att matcha den TEM-bilden. Finjusteringar kontrast, skärpa, etc. i den fluorescerande bilden kan hjälpa inriktningen. Obs: Vi har funnit att heterokromatin, kärnhöljet, och cellen periferi utgör en utmärkt landmärken att hjälpai orienteringen av de två bilderna.

6. Kritiska Överväganden

1. Att kraftigt underlätta lokalisering av injicerade liten molekyl, kan en fluorescerande markör, såsom rodamin eller fluorescein fästas kovalent med användning av kommersiellt tillgängliga kit. Ytterligare information fås genom ektopiskt uttrycka ett fluorescerande subcellulär proteinlokalisering markör före mikroinjektion. Därför är valet av fluoroforer och inert mikroinjektion spårning dye viktigt.
2. Välja celler för mikroinjektion som vidhäftar nära centrum av täckglas och undvika att välja ett galler nära kanten. Detta kommer att presentera den största sannolikheten att celler av intresse överförs till Epon harts som används för elektronmikroskopi.
3. Konfluens av celler iär viktigt, eftersom en helt sammanflytande platta gör identifiering av mikroinjicerade celler i elektronmikroskop mycket svårt. Snarare, frö celler så att de når ~ 50% konfluens på dagen för en kort experiment eller ~ 25% konfluens på dagen för en längre (1-2 dagar) experimentet. Använd positionen och formen av cellerna samt "tomrum som landmärken för att orientera elektronmikroskopi bilden.
4. Konfokala optisk snittjocklek bör anpassas till behoven hos experimentet och bör därför bestämmas empiriskt ^10.
5. Den fixativ formaldehyd och glutaraldehyd bör vara av högsta kvalitet som finns tillgänglig. Formaldehyd kommer fixera cellerna, ändå bevara de fluorescensegenskaper hos både proteiner och små fluorescerande molekyler (såsom rodamin eller FITC). Det kommer dock bevarar inte strukturerna för att medge hög EM upplösning. Glutaraldehyd bevarar membran och subcellulära strukturer i hög grad för EM analysersis, men kommer betydligt hindra fluorescens. Därför är två steg fixering kritiskt för både fluorescens och EM mikroskopi. Formaldehyd fixering steget kan utelämnas om uppträda live-cell mätningar som slutlig fixering kan utföras av glutaraldehyd behandling.

7. Representativa resultat

Detta förfarande ger möjligheten att leverera en molekyl av intresse direkt i eukaryota cellulära cytoplasman och övervaka dess lokalisering och / eller effekter på cellulär och organeller arkitektur från millimeter till flera nanometer upplösning. En schematisk illustration av den experimentella inställning och procedur visas i figur 2. Denna teknik bygger på mikroinjektion av celler odlade på en laser etsat glas inrutade täckglas (fig. 3A), som efter konfokalmikroskopi, kan överföra både cellerna av intresse liksom rutnätsmönstret till Epon hartset (fig.3B).

En typisk mikroinjektion FÖRHUNGRA förfarande ger fluorescens bilder och elektronmikrofotografier, som när korrelerade, tillåter både subcellulär lokalisering och ultrastrukturell analys. Celler odlade på en fotoetsad glas rutnät täckglas är mikroinjiceras med en molekyl av intresse, varefter ljusa fältbilder erhålles (fig. 4A). Ett inert spårning färgämne införlivas att särskilja mikroinjicerade celler från icke-mikroinjicerade celler (Fig. 4B). Konfokala z-stackar erhålles med användning av en fluorofor eller annan identifierare bifogas mikroinjicerade lilla molekylen av intresse (fig. 4C). Provet fixeras med glutaraldehyd och bearbetades för elektronmikroskopi. Elektronmikrofotografier erhålls och överlagras på de celler som de motsvarar (Fig. 4D). Områden hyser fluorescerande signaler inspekteras närmare vid högre förstoring (Fig. 4E

Figur 1. Timeline av mikroinjektion FÖRHUNGRA förfarande. Beroende på experimentuppställning kan mikroinjektion och fluorescensmätningar utföras på samma dag. Preparering av provet för elektronmikroskop är mest tidskrävande på grund av långa inkubationer steg och kommer att pågå 2-3 dagar. TEM-analys och korrelera fluorescenssignaler med elektronmikroskopiska bilder kan utföras på en dag.

Figur 2 Allmän illustration av mikroinjektion FÖRHUNGRA proceduren Steg 1:.. Leta celler som växer på laser etsat glas inrutade täckglas och microinject molekyl av intresse Steg 2:.. Fånga både ljusa fält bilder och konfokala fluorescerande z-staplar av mikroinjicerade celler Steg 3: Förberedtäckglas för EM analys och bädda in Epon harts. Använda överförda rutmönster, trimma blockera så att celler av intresse är vid spetsen Steg 4:. Skär seriella sektioner med ultramikrotom Steg 5:. Korrelera fluorescerande bilder med EM bilder.

. Figur 3 rutmönster underlättar identifiering av celler av intresse Panel A visar mikroinjektion av celler odlade till ~ 50% konfluens,. Observera gallret identifierare AK. Skala bar är 100 um. Panel B visar det överförda rutnätsmönstret från täckglaset på polymeriserade Epon hartset block som kommer att vara sektionerad seriellt efter gallret av intresse identifieras i en dissektion mikroskop. Fält C visar den överförda rutmönster i förberedelse för snittning . Observera att den överförda nätet smattra i omvänd på hartset blocket, skalbare bar är 1200 nm.

.. Figur 4 Representativa resultat från mikroinjektion korrelativ ljus-och elektronmikroskopi Panel A visar ljusfält mikroskop av NRK-celler växer på en laser etsat glas inrutade täckglas, pilar indikerar två celler som är visualiseras genom FÖRHUNGRA i paneler CD Panel B visar den fluorescens. av det inerta färgämnet spårning, i detta fall Cascade Blue, används för att identifiera celler som mikroinjicerade. Panel C visar överlagring av ljusa fält och fluorescens undertecknande av ett rodamin-märkt liten molekyl. De två cellerna som visas här indikeras med pilar i paneler A & B. Panel D representerar FÖRHUNGRA av ljust fält, fluorescerande och elektronmikroskopi,. Pilspets indikerar fluorescerande puncta avbildas vid högre förstoring i panel E Scale barer är som följande: Paneler A och B, 100 nm, C & D, 50 um, E, 100 nm.

Discussion

Den metod som presenteras här möjliggör direkt leverans av renade proteiner, nukleinsyror, eller små molekyler till eukaryota cytoplasman och ger extremt hög upplösning analys genom korrelationen av fluorescerande och elektronmikroskopi. Användningen av denna metod är enkel men robust och kan utföras i egen regi med många befintliga core faciliteter och / eller med lämplig utrustning elektron laboratorier mikroskopi. Tekniken är också mottaglig för levande celler, så att användaren kan övervaka dynamiken i fluorescerande taggade molekyler i realtid och därmed kan användas med time-lapse mikroskopi och korreleras till tomografisk elektronmikroskopi.

Preliminära empiriska studier bör genomföras i alla skeden av försöket för att bestämma optimala konfluens, mikroinjektion effektivitet och leverans av lämpliga mängder injiceringsmedlet, optimering av fluoroforer och injektion / spårning färgämne (er) och tillgänglighet och / eller expertis för elektron MICRoscopy analys. Placering av injicerade cellen i alla steg i FÖRHUNGRA förfarandet är avgörande för detta protokoll, och därför rekommenderas att celler som växer i en alfanumerisk rutnät nära centrum av täckglaset väljas för att öka sannolikheten för att provet kommer att dokumenteras både i konfokal och elektronmikroskopi. För att underlätta lokalisering celler av intresse, bör de relativa positionerna för närliggande celler användas som landmärken för att underlätta lokalisering den mall under EM-analys. Slutligen bör snittjocklek anpassas till önskad mätning. En seriell sektion av ~ 70 nm tjocklek rekommenderas för TEM medan en tjockare sektion (~ 250-300 nm) rekommenderas för EM tomografi.

Mikroinjektion FÖRHUNGRA Tekniken används främst i vårt laboratorium för att simulera leverans av typ III utsöndrade bakteriella effektor proteiner och analysera deras effekter på den subcellulära ultrastruktur den eukaryota cellen. Emellertid plasticitet och ease av användning av mikroinjektion följt av FÖRHUNGRA ger många andra vägar för utredning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phot–tched Coverslip and Live-cell Plate	MatTek Corp.	P35G-2-14-CGRD
Texas Red	Invitrogen	D3329
Cascade Blue	Invitrogen	D7132
Rhodamine Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53002
0.22 μm centrifugal filtration unit	EMD Millipore	UFC30GV00
Borosilicate Glass Pipettes	Sutter Instrument Co.	BF100-50-10
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Use program #4 after performing ramp test
FemtoJet Microinjection System	Eppendorf	Injectman NI2
Coverslip Removal Fluid	MatTek Corp.	PDCF OS 30
Technai Transmission Electron Microscope	FEI	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	Leica Microsystems	EM UC6