Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

Summary

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Abstract

De eukaryote cel steunt op complexe, sterk gereguleerd en functioneel verschillende membraan gebonden compartimenten die een biochemische polariteit noodzakelijk te bewaren voor een goede cellulaire functie. Begrijpen hoe de enzymen, eiwitten, en het cytoskelet componenten besturen en onderhouden van deze biochemische scheiding is dan ook van het grootste belang. Het gebruik van fluorescent gelabeld moleculen te lokaliseren en / of verstoren subcellulaire compartimenten heeft een schat aan kennis en ons begrip van cellulaire regelgeving. Beeldvormingstechnieken zoals fluorescente confocale microscopie en maakt bepaling van de positie van een fluorescent gelabeld kleine molecule relatief eenvoudig, is echter de resolutie van zeer kleine beperkt ^1.

Anderzijds heeft elektronenmicroscopie details bekend van subcellulaire morfologie bij zeer hoge resolutie, maar de statische aard is het moeilijk te meten zeer dynamische proprocessen met precisie ^2,3. Dus de combinatie van lichtmicroscopie met elektronenmicroscopie van hetzelfde monster, genoemd Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) ^4,5, biedt de dubbele voordelen van ultrasnelle fluorescente beeldvorming met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie ^6. Deze krachtige techniek is geïmplementeerd om vele aspecten van celbiologie ^5,7 bestuderen. Sinds haar oprichting heeft deze procedure vergroot ons vermogen om subcellulaire architecturen en morfologie met een hoge resolutie te onderscheiden.

Hier geven we een gestroomlijnde werkwijze voor het uitvoeren snel gevolgd door micro-injectie CLEM (Fig. 1). De microinjectie CLEM procedure kan worden gebruikt om bepaalde hoeveelheden kleine moleculen en / of eiwitten rechtstreeks in de eukaryote cel cytoplasma en onderzoeken de effecten van millimeter tot meerdere nanometer resolutie (Fig. 2). De techniek is gebaseerd op microinjectingcellen gekweekt op laser geëtst glas gerasterde dekglaasjes aan de onderkant van levende cellen gerechten en imaging zowel confocale fluorescente en elektronenmicroscopie. Lokalisatie van de cel (len) plaats wordt vergemakkelijkt door het rasterpatroon, dat gemakkelijk wordt, overgebracht samen met de cellen van belang, de EPON hars gebruikt voor immobilisatie van monsters en snijden voor elektronenmicroscopie analyse (Fig. 3). Overlay van fluorescerende en EM foto laat de gebruiker toe om de subcellulaire lokalisatie alsmede morfologische en / of ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door de microgeïnjecteerde molecule plaats (Fig. 4). Deze techniek is ontvankelijk voor tijdstippen van ≤ 5 s tot enkele uren, afhankelijk van de aard van de microgeïnjecteerde monster.

Protocol

1. Mammalian Cell Culture

1. Normale Rat Kidney (NRK), onsterfelijk baarmoederhalskanker (HeLa) of andere geschikte zoogdiercellijnen worden gekweekt bij 37 ° C, _5% CO2 op Photoetched glazen dekglaasjes grid aangebracht cel schotels leven (zie tabel 1 voor reagens of inrichting in dit protocol) in DMEM + 10% FBS en 1% Pen / Strep. Er dienen voorzorgsmaatregelen te worden genomen om een ​​steriele omgeving te houden bij het werken met gekweekte zoogdiercellen.
2. Let op experimentele tijdlijn (0-5 uur vs 1-2 dagen na injectie) de confluentie van cellen moet worden aangepast aan ~ ~ 50% of 25%, respectievelijk.

2. Micro-injectie

1. Bereid gewenste eiwit, DNA of kleine moleculen in het kiezen van buffer, afhankelijk van de ontvankelijkheid voor cellulaire cultuur, een eindvolume van 50 pi ~. Inert fluorescerende kleurstoffen zoals Texas Red of Blue Cascadeopgenomen om de microgeïnjecteerde cellen markeren, keuze van injectie kleurstof en fluorescente probe zou niet overlappende excitatie en emissie golflengtes. De concentratie van de molecule plaats nodig voor micro-injectie moet empirisch worden bepaald en het fluorescerende kleurstoffen volgen vaak gebruikt op 0,5-1,0 mg / ml. Kenmerkend wordt rhodamine of andere fluorescerende covalent aan een molecuul van belang met een commerciële kit, maar andere methoden van detectie kan worden gebruikt afhankelijk van gevoeligheid. Voor meer informatie, zie onderstaande kritische beschouwingen.
2. Filter de geïnjecteerde (~ 50 pi) door een 0,22 urn filter centrifugale. Centrifugale filters de voorkeur boven vacuüm en / of spuit filtratie die verbonden dode volumes.
3. Om de micro-injectie naald te genereren, zijn borosilicaatglas pipetten getrokken met behulp van een Flaming-Brown Micropipet Puller volgende fabrikanten richtlijnen. Als alternatief, micro-injectienaalden kunnen worden gekocht bij leveranciers waaronder Eppendorf die femtotip micro-injectie naalden maakt.
4. Zorgvuldig pipetteer 4 pl van geïnjecteerde in de ongehinderd einde van de micro-injectie naald met behulp van Eppendorf 20 Femtotips. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen de getrokken micro-injectie naald. Plaats micro-injectie naald in de arm van de micromanipulator Eppendorf FemptoJet Injectman aan een omgekeerde microscoop. Voor een goede evaluatie van de micro-injectie procedure wordt de lezer gericht op een eerdere Journal of Experiments Gevisualiseerde artikel ^8.
5. Plaats levende cellen schotel met gerasterde dekglaasje en gekweekte cellen in de schotel houder van de omgekeerde Zeiss microscoop. Zoek cellen groeien binnen een Photoetched rooster en let op de roosters alfanumerieke identificator, wordt deze gebruikt worden in alle volgende stappen. Idealiter lokaliseren cellen in het midden van het dekglaasje als volgende stappen sample overdracht beperken tot de randen van het dekglaasje.
6. Handmatig lagere injectie arm op zijn plaats over het dekglaasje en het gebruik van de micromanipulator joystick en controles, lagere injectienaald naar beneden totdat de punt zachtjes raakt het oppervlak van de gekweekte cellen en druk op 'Beperk tot verplaatsing van de naald voorbij dit punt te voorkomen en dus het breken van de breekbare getrokken borosilicaat glas. Alle andere aspecten van cel microinjectie worden uitgevoerd volgens Eppendorf FemtoJet InjectMan handleiding. De micro-injectie techniek werd onlangs gebruikt om individuele uitgescheiden virulentie eiwitten begrijpen van bacteriën ^9.
7. Microinject iedere andere cel binnen de gekozen raster. Met cellen gekweekt bij ~ 50% confluentie, kan men verwachten ~ 80 cellen per 600 ^pm2 rooster (voorbeeld getoond in Fig. 3A). Derhalve op fluorescentie en elektronenmicroscopie inspectie zal er een n van ~ 30-40 experimentele en controle cellen.
8. Terug te plaatsen live-cell gerecht in zoogdiercelculturen incubator voor de gewenstetijd bepaald door de experimentele opzet. Als alternatief kan men direct doorgaan van micro-injectie naar time-lapse microscopie analyse om het uiterlijk van bepaalde subcellulaire structuren plaats wachten voor fixatie.

3. Fluorescentiemicroscopie

1. Desgewenst live-cell time-lapse fluorescentie metingen van microgeïnjecteerde cellen, waarna de media vervangen met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat buffer (pH 7,4) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Echter, als levende cellen niet zijn vereist, ontdoen celgroei media en vast de cellen met 5 ml 3,7% formaldehyde in 1xPBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi fixatief en te vervangen door 5 ml 1xPBS, gaat u verder met stap 3.2. Opmerking: het is niet essentieel glutaraldehyde voegen nadat fluorescentiemicroscopie is voltooid.
2. Plaats de live-cell schaal met Photoetched gerasterde dekglas in een fluorescentiemicroscoop (confocale is niet vereist voor this stap) en verzamel 5-10 helderveld en fluorescerende beelden van het betreffende raster de rangschikking van de cellen (Fig. 4A) documenteren. Identificeren die cellen die zijn microgeïnjecteerd met de excitatie-en emissiegolflengten van de kleurstof inerte injectie (Fig. 4B). Het is belangrijk om beelden te verkrijgen bij verschillende vergrotingen (bijvoorbeeld 10x en 65x) om identificatie van microgeïnjecteerde cellen vergemakkelijken gepaard gaat elektronenmicroscopie.
3. Met een confocale fluorescentiemicroscoop, verzamel een Z-stapel microgeïnjecteerde cellen in het raster bepaald in stap 2.5 hierboven. Hoge vergroting (100x) nodig om fluorescerende beelden correleren met subcellulaire structuren die worden omschreven in elektronenmicroscopie.
4. De dekglaasjes worden verwijderd uit de onderkant van het cel gerechten handel verkrijgbare vloeibare en verwijdering dekglaasje geplaatst cel naar boven in een maagdelijk celkweekschaal met 5 ml1xPBS. Het dekglaasje wordt dan verwerkt voor elektronenmicroscopie zoals hieronder uiteengezet.

4. Transmissie Elektronen Microscopie

1. 1xPBS buffer vervangen met 2 ml 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaat buffer (pH 7,4) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Langere incubatietijd, hoewel niet noodzakelijk, zal helpen bij behoud van subcellulaire structuren. Opmerking: formaldehyde alleen is niet voldoende fixeermiddel voor EM analyse.
2. Verwijder fixatief en vlek cellen met de toevoeging van 2 ml 1% osmiumtetroxide in 0,1 M cacodylaat buffer gedurende 30 minuten gevolgd door drie wassingen met cacodylaat buffer en uiteindelijk alle buffer vervangen ddH ₂ O.
3. Na standaard EM-protocollen, gedehydreerd het monster in een gegradeerde (70% tot 100%) reeks van ethanol. Bereid EPON hars en plaats dekglaasje cel-kant naar beneden op de top van een Epon hars gevulde buis. Toestaan ​​polymerisatie gedurende 24 uur bij 60 ° C. Door het plaatsen van de Photoetched gerasterde dekglaasje cel-kant te doenwn op de EPON hars wordt zowel de cellen van belang en het rasterpatroon naar de EPON hars tijdens de polymerisatie (in Fig. 3B).
4. Verwijderen dekglaasjes van EPON hars door snel onderdompelen in vloeibare stikstof en / of kokend water. Controleer het oppervlak van de hars onder een binoculair dissectie ruimte om het rooster van belang (let op: het raster babbel zal overdragen als een spiegelbeeld) te vinden. Met behulp van een steriele scheermesje of scalpel, trim de EPON blok naar beneden, zodat alleen het rooster van belang is bij de top van de EPON hars blok.
5. Met een ultramicrotoom verwerven seriële secties van de afgesneden blok op de gewenste dikte (~ 70 nm dikte en conventionele TEM ~ 250 nm dikte tomografische TEM). Contrast de secties met uranylacetaat en loodcitraat volgens standaard protocollen.

5. Correlatieve Licht en Electron Microscopy

1. Verplaatsen de cellen van belang inde elektronenmicroscoop gebruik van beelden uit eerdere stappen. Zodra gemicroinjecteerd cellen van belang zijn gevestigd, gebruik maken van de hoge-resolutie confocale fluorescente beelden naar regio's te identificeren binnen de cel die van belang waren. Afbeelding deze met een hoge resolutie met behulp van TEM. Gebruik bezienswaardigheden, zoals de cel periferie en de nucleaire envelop om te bepalen welke fluorescerende z-stack beeld komt overeen met de EM snijden.
2. Met behulp van het grafische programma van uw keuze (bijvoorbeeld Afbeelding J, Adobe Photoshop, enz.), vermindering van de opaciteit van de fluorescerende beeld tot 50% en overlay op de TEM-opname waarmee het correleert. Lijn de beelden door het aanpassen van de schaal (vergeet niet om verhoudingen) en de rotatie van de confocale afbeelding om de TEM-beeld overeenkomen. Kleine wijzigingen aanbrengen in contrast, scherpte, etc. in de fluorescerende beeld kan helpen bij de uitlijning. Opmerking: we hebben gevonden dat heterochromatin, de nucleaire envelop, en de cel periferie een uitstekende verstuurd naar steun vertegenwoordigenin de oriëntatie van de twee beelden.

6. Kritische beschouwingen

1. Om een ​​grote hulp bij het lokaliseren van de geïnjecteerde kleine molecule, kan een fluorescerend label, zoals Rhodamine of fluoresceïne covalent worden bevestigd met behulp van in de handel verkrijgbare kits. Aanvullende informatie wordt verkregen door een fluorescerende ectopisch tot expressie subcellulaire lokalisatie merkereiwit voor micro-injectie. Vandaar keuze van fluoroforen en inert microinjectie volgen kleurstof is belangrijk.
2. Kiezen voor micro-injectie cellen die dicht bij het midden van het dekglaasje hechten en voorkomen kiezen van een raster dicht bij de rand. Dit zal de grootste kans dat de cellen van belang worden overgedragen aan de EPON hars voor elektronenmicroscopie.
3. Confluentie van cellen iis belangrijk, als volledig confluente plaat zal identificatie van microgeïnjecteerde cellen maken in de elektronenmicroscoop moeilijk. Veeleer zaad cellen zodanig dat ze bij ~ 50% confluentie op de dag van een kort experiment of -25% confluentie op de dag van een langer (1-2 dagen) experiment. Gebruik de positie en vorm van de cellen en de lege ruimte verstuurd naar het oriënteren elektronenmicroscopie beeld.
4. Confocale optische plakdikte moet worden afgestemd op de behoeften van het experiment en derhalve empirisch bepaald ^10.
5. De fixatieven formaldehyde en glutaaraldehyde moet van de hoogste kwaliteit beschikbaar zijn. Formaldehyd stellen de cellen, maar behouden de fluorescentie-eigenschappen van beide eiwitten en kleine fluorescente moleculen (zoals Rhodamine of FITC). Het zal echter bewaart de structuren hoge resolutie EM toe. Glutaraldehyde behoudt membranen en subcellulaire structuren in hoge mate voor EM analysis, maar zal aanzienlijk belemmeren fluorescentie. Zijn beide stappen fixatie is essentieel voor zowel fluorescentie microscopie en EM. De formaldehyde fixatie stap kan worden weggelaten indien het uitvoeren van levende cellen metingen als definitieve fixatie kan worden uitgevoerd door behandeling glutaraldehyde.

7. Representatieve resultaten

Deze procedure biedt de mogelijkheid om een ​​molecuul van belang direct in de eukaryote cellulaire cytoplasma en toezien op de lokalisatie en / of effecten op cellulaire en organeller architectuur van millimeter tot meerdere nanometer resolutie. Een schematische weergave van de experimentele opstelling en procedure is weergegeven in figuur 2. Deze techniek berust op micro-injectie van cellen gekweekt op een laser geëtst glas gerasterde dekglaasje (Fig. 3A), die na confocale microscopie, kan zowel de cellen van belang en het rasterpatroon dragen aan de EPON hars (Fig.3B).

Een typisch micro-injectie CLEM procedure levert fluorescentie beelden en electronenmicroscoop, dat wanneer gecorreleerd, toestaan ​​zowel subcellulaire lokalisatie en ultrastructurele analyse. Cellen gekweekt op een Photoetched glazen dekglaasje gerasterde worden microgeïnjecteerd met een molecuul van belang waarna helderveld beelden worden verkregen (Fig. 4A). Een inert volgen kleurstof opgenomen om microgeïnjecteerde cellen onderscheiden van niet-microgeïnjecteerde cellen (Fig. 4B). Confocale z-stacks worden verkregen met een fluorofoor of andere identificatie aan de microgeïnjecteerde kleine molecule plaats (Fig. 4C). Het monster wordt met glutaraldehyde en verwerkt voor elektronenmicroscopie. Electronenmicroscoop worden verkregen en overlay op de cellen waarop zij corresponderen (Fig. 4D). Gebieden herbergen fluorescerende signalen worden geïnspecteerd in meer detail bij hogere vergroting (Fig. 4E

Figuur 1. Chronologie van micro-injectie CLEM procedure. Afhankelijk van de experimentele opstelling kan microinjectie en fluorescentie metingen op dezelfde dag. Voorbereiding van het monster voor elektronenmicroscopie is het meest tijdrovend vanwege de lange incubatie stappen en duurt 2-3 dagen. TEM analyse correleren fluorescentiesignalen met elektronenmicroscopie beelden kan op een dag.

Figuur 2 Algemeen illustratie van de micro-injectie CLEM procedure Stap 1:.. Zoek cellen groeien op laser geëtst glas gerasterde dekglaasje en microinject molecuul van belang. Stap 2:. Capture zowel helderveld beelden en confocale fluorescente z-stapels microgeïnjecteerde cellen Stap 3: bereidendekglaasje voor EM analyse en in te bedden in EPON hars. Met behulp van overgedragen rasterpatroon, trim blokkeren zodanig dat cellen van belang zijn bij de top. Stap 4: Snijd seriële secties met ultramicrotoom Stap 5:. Correleren fluorescerende beelden met EM beelden.

. Figuur 3 Grid patroon vergemakkelijkt de identificatie van cellen van belang Panel A toont de micro-injectie van cellen gegroeid tot ~ 50% confluentie,. Let op de rooster identificatie AK. Scale bar is 100 um. Paneel B toont de overgedragen rasterpatroon van het dekglaasje op de gepolymeriseerde EPON hars blok dat serieel zal zijn coupes na het rooster van belang is geïdentificeerd in een dissectie microscoop. Paneel C toont de overgedragen rasterpatroon in voorbereiding voor het snijden . Merk op dat de overgedragen rooster babbel is in omgekeerde op de hars blok; scale bar is 1200 pm.

.. Figuur 4 Representatieve resultaten van microinjectie gecorreleerde licht-en elektronenmicroscopie Panel A toont de helderveld microscoop van NRK cellen groeien op een laser geëtst glas gerasterde dekglaasje; pijlen twee cellen die worden gevisualiseerd door CLEM in panels CD Panel B toont de fluorescentie. volgen van de inerte kleurstof, in casu Cascade Blue, gebruikt om cellen die werden gemicroinjecteerd identificeren. Panel C toont de overlay van helderveld en de fluorescentie ondertekening van een Rhodamine-gelabeld kleine moleculen. De twee cellen hier zijn aangegeven met pijlen in panels A & B. Panel D vertegenwoordigt CLEM van helderveld, fluorescerende en elektronenmicroscopie;. Pijlpunt geeft fluorescent puncta afgebeeld bij een grotere vergroting in Panel E Scale bars zijn als volgtdieptepunten: Panelen A & B, 100 micrometer; C & D, 50 pm, E, 100 nm.

Discussion

Werkwijze hier gepresenteerde maakt de directe levering van gezuiverde eiwitten, nucleïnezuren of kleine moleculen van de eukaryote cytoplasma en biedt ultrahoge resolutie analyse door de correlatie van fluorescerende en elektronenmicroscopie. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust en kan worden uitgevoerd in eigen huis met veel bestaande kern faciliteiten en / of op de juiste wijze voorzien van elektronenmicroscopie labs. De techniek is ontvankelijk voor levende cellen, zodat de gebruiker de dynamiek van fluorescent gemerkte moleculen in real time monitoren en kan dus worden gebruikt met time-lapse microscopie en gecorreleerd aan tomografische elektronenmicroscopie.

Een voorlopige empirische studies moeten worden uitgevoerd in alle fasen van het experiment om een ​​optimale confluentie, micro-injectie efficiëntie en de levering van de juiste hoeveelheden geïnjecteerde, optimalisatie van fluoroforen en injectie / het bijhouden van kleurstof (fen), en de beschikbaarheid en / of deskundigheid voor elektronen micr bepalenoscopy analyse. Locatie van de geïnjecteerde cel in alle stappen van de CLEM procedure is essentieel voor dit protocol, en daarom wordt aanbevolen dat cellen groeien in een alfanumeriek raster nabij het centrum van het dekglaasje worden gekozen om de waarschijnlijkheid dat de specimen wordt beschreven stijging van zowel confocale en elektronenmicroscopie. Om te helpen bij het vinden van cellen belang dient de relatieve posities van omringende cellen worden gebruikt oriëntatiepunten om te helpen bij het vinden van de juiste monster tijdens EM analyse. Tenslotte moet snijdikte worden afgestemd op de gewenste meting. Een seriële sectie van ~ 70 nm dikte wordt aanbevolen voor TEM, terwijl een dikkere gedeelte (~ 250 tot 300 nm) wordt aanbevolen voor EM tomografie.

De micro-injectie CLEM techniek wordt voornamelijk gebruikt in ons laboratorium aan de levering van het type III gesecreteerde bacteriële effector eiwitten te simuleren en de effecten daarvan te analyseren op de subcellulaire ultrastructuur van de eukaryote cel. Echter, de plasticiteit en ease van het gebruik van micro-injectie, gevolgd door CLEM biedt vele andere wegen van onderzoek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phot–tched Coverslip and Live-cell Plate	MatTek Corp.	P35G-2-14-CGRD
Texas Red	Invitrogen	D3329
Cascade Blue	Invitrogen	D7132
Rhodamine Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53002
0.22 μm centrifugal filtration unit	EMD Millipore	UFC30GV00
Borosilicate Glass Pipettes	Sutter Instrument Co.	BF100-50-10
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Use program #4 after performing ramp test
FemtoJet Microinjection System	Eppendorf	Injectman NI2
Coverslip Removal Fluid	MatTek Corp.	PDCF OS 30
Technai Transmission Electron Microscope	FEI	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	Leica Microsystems	EM UC6