Summary
En 3D-odlingssystem för hematopoies beskrivs med humant navelsträngsblod och leukemiska benmärgsceller. Metoden baseras på användningen av en porös syntetisk polyuretan byggnadsställning belagd med extracellulära matrisproteiner. Detta ställningen är anpassningsbar för att rymma en mängd olika celler.
Abstract
Hematopoietiska stamceller kräver en unik mikromiljö för att upprätthålla bildning blodkroppar 1; den benmärg (BM) är en komplex tredimensionell (3D) vävnad vari hematopoies regleras genom att spatialt anordnade cellulära mikromiljöer benämnd nischer 2-4. Organisationen av BM nischer är avgörande för funktionen eller dysfunktion av normal eller malign BM 5. Därför är en bättre förståelse för in vivo mikromiljön med hjälp av en ex vivo mimicry skulle hjälpa oss klarlägga molekylära, cellulära och microenvironmental bestämningsfaktorer leukemogenesis 6.
För närvarande är hematopoetiska celler odlas in vitro i tvådimensionella (2D) vävnadsodlingskolvar per brunn-plattor 7 som kräver antingen samodling med allogena eller xenogena stromaceller eller tillsats av exogena cytokiner 8. Dessa betingelser är artificiella och skiljer sig från in vivo- 9,10.
Häri presenterar vi ett nytt 3D-ben-systemet benmärg kultur som simulerar in vivo 3D tillväxt miljön och stöder multilinjär hematopoes i avsaknad av exogena tillväxtfaktorer. Det mycket porösa byggnadsställning som används i detta system tillverkat av polyuretan (PU), underlättar hög densitet celltillväxt över en högre specifik ytarea än den konventionella monolagerkultur i 2D 11. Vårt arbete har visat att denna modell stöds av tillväxten av humant navelsträngsblod (CB) mononukleära celler (MNC) 12 och primära leukemiceller i frånvaro av exogena cytokiner. Denna nya 3D mimicry ger en livskraftig plattform för utveckling av en människa experimentell modell för att studera hematopoes och att utforska nya behandlingar för leukemi.
Protocol
1. Scaffold Tillverkning och Bio-funktionalisering av byggnadsställningar
- Att tillverka PU ställningar (porstorlek 100-250 mm, porositet 90-95%) i form av Petri-skålen skivor använder termiskt inducerad fasseparation 13 processen genom att framställa en polymer-lösning (5 vikt-% i dioxan) följt av frysning och efterföljande Lösningsmedlet sublimering (figur 1A).
- Skär ställningen disken i tärningar på 0,5 x 0,5 x 0,5 mm före beläggning med ECM-proteiner (Figur 1B).
- Pre-våta skeletten genom nedsänkning i etanol (70%) under 1 min och därefter överföra till fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 20 minuter. Centrifugera sedan i 10 minuter vid 3630 xg och tillsätt proteinet lösningen.
- Centrifugera byggnadsställningar i proteinlösningen vid 1420 xg under 20 min.
- För att avblockera ytporerna och tillåta cellerna såddes att penetrera djupare in i byggnadsställningen, centrifugera stödstrukturer en gång vid 910 x g under 10 minuteri PBS.
- Sterilisera ställningar med en kombination av 8 min exponering vid 230 V, 50 Hz, 0,14 A, UV-lampa, med nedsänkning under 2 timmar i etanol (70%). Därefter tvättas de ställningar två gånger i PBS före tillsats av Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) med tillsats av 30% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin och streptomycin (P / S). Placera de ställningar i en befuktad inkubator i 3 dagar vid 37 ° C och 5% CO2 före användning. Sterila byggnadsställningar placeras i en 24 brunn-vävnadsodlingsplattor (en byggnadsställning per brunn).
2. Mononukleär cellisolering och Ställning Seeding
- Utdrag människa MNC från navelsträngsblod eller leukemiska benmärgsprov, med hjälp av Ficoll-Paque densitetsgradientcentrifugering (35 min vid 1500 rpm) (Figur 1C).
- Återsuspendera MNC i IMDM innehållande 30% FBS och 1% P / S.
- Seed 100 ^ MNC suspension (2 x 10 6 celler / byggnadsställning) på ställningar med en mikro-pipett.
- Inkubera ympade ställningar vid 37 ° C under 5% CO2 under 10 minuter för cellerna att sedimentera till skeletten.
- Fylla varje brunn med 1,5 ml av IMDM innehållande 30% FBS och 1% P / S och plats brunnsplattor i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 under hela experimentet.
- De seedade ställningar genomgår dagligt byte av alla medier.
3 In situ celltillväxt och morfologi. MTS, SEM och cytospins
- MTS-analys: Ta bort från kulturen en FN-seedade och två seedade byggnadsställningar och lägg i en ren ny 24 väl plattan. Tillsätt 1 ml medium och 200 | il av MTS-lösning och inkubera under 3 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta 8 x 100 pl prov från supernatanten; ställe i en 96-brunnsplatta och mått absorbansen vid 490 nm med användning av en mikroplattläsare.
- Svepelektronmikroskopi (SEM): Vid olika tidpunkter i: tee kultur, bort ställningar ympade med MNC från media, och fäst med 2,5% PBS-buffrad glutaraldehyd lösning för 40 minuter vid 4 ° C, tvätta sedan två gånger med PBS.
- Dehydratiserad de ställningar i en graderad serie av etanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 och 100%), vardera under 10 minuter och torka i en aseptisk miljö i 4 timmar.
- § prover och sedan sputter-belägga dem med guld i argonatmosfär i 2 min före SEM utvärdering använder en acceleration spänning på 20 kV.
- Cytospins: Samla 2,0 x 10 4 celler / glider genom att aspirera cellerna från ställningen vid olika tidpunkter i kulturen.
- Centrifugera cellerna på ett objektglas under 3 min vid 1500 varv per minut.
- Färga glasen med Wright-Giemsa Ändrad Bets och observera med hjälp av ett optiskt mikroskop. F-view Soft Imaging System kan användas för att ta bilder.
- Tvätta glider före mikroskop observation.
- M ultiphoton analys: Fix byggnadsställningar vid olika tidpunkter med etanol ånga (70%) över natten och sedan torrt och förvara vid -20 ° C tills vidare analys. Före visualisering med multiphoton mikroskopsektionen ställningen i 30 m tjocka bilder och blöta med PBS.
- Blockera den ympade byggnadsställningar i PBS med 10% fetalt bovint serum under 30 min vid rumstemperatur.
- Inkubera ställningar natten vid 4 ° C i mörker med en 1:50 spädning av primär monoklonal antikropp: mus anti-human CD71.
- Tvätta prover tre gånger i PBS och färga med den sekundära antikroppen: anti-mus Alexa Fluor 488 under 1 h vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta prover tre gånger med PBS och observera med ett konfokalt mikroskop med användning av en vatten utsläpp lins x60 objektiv.
- Fluoroforen Alexa Fluor 488 exciteras vid 488 nm av pulserande laser. Volocity 5.3.2 programvara kan användas för efterföljande bildanalys.
- Innan cellulär analys i flödescytometern (FC), märka de celler av intresse med motsvarande immunofluorescens antikroppar för detektion. Ett antal prover framställdes i enlighet med de valda antikropparna för detektion. För MNC detektering följande kombination av antikroppar användes: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Aspirera cellerna från ställningen vid olika tidpunkter och centrifugera. Upplösa en cellpellet av omkring 1x10 6-celler i 100 | il FC-buffert (PBS + 0,1% natriumazid) och tillsätt 10 | il av varje antikropp fluorescens-färgämne. Inkubera cellerna under 30 min vid 4 ° C, tvätta två gånger med PBS och slutligen åter-suspendera i FC-buffert.
- Fyll på provet i flödescytometer färgade med isotypkontroll att ställa in "negativitet" av antikroppen uttryck och kalibrera upptäckt kanalerna med flödescytometern kontrollen.
- Läs w provet färgade te de tre olika antikroppar och slutligen representerar data i med användning av WinList mjukvara.
5. Representativa resultat
Ett exempel på hematopoietiska cellulära tillväxtfaktorer kinetik utan tillsats av exogena tillväxtfaktorer, visas i figur 2. På grund av den heterogena karaktären av hematopoes, två olika celler: normala och onormala hematopoetiska celler illustreras. I figur 2A är cellulär proliferation av humana CBMNC uppenbart efter 28 dagar i odling. Figur 2B visar tillväxtegenskaperna kinetiken i mimikry med användning av humana primära leukemiceller. Cellproliferation bedöms med hjälp av MTS-analys som mäter cellulär metabolisk aktivitet i relation till absorbans. I båda fallen cellerna prolifererade och etablerade i modellen. Skillnader i tillväxt kinetik iakttas, normala hematopoetiska celler etablera kulturen snabbare än leukemiceller.
_content "> Morfologin av de skördade cellerna och med efter 28 dagars odling i frånvaro av exogena tillväxtfaktorer var typiska för normala hematopoietiska celler (figur 3A) och leukemiska celler (figur 3B). centrala delarna av de ställningar analyserades genom SEM efter de ställningar togs bort från kulturen och visade spridningen av de sådda cellerna hela ställningen, att etablera sig i kluster och "nisch-liknande" strukturer (Figur 3A '& B). visar figur C porstorlek och distribution i en oympade byggnadsställning som användes som kontroll. multiphoton mikroskopi efter 28 dagar har använts för att markera fördelningen av cellerna i 3D ställningen in situ och den visade närvaron av erytroid öar i centrala delarna av byggnadsställningen (figur 4) genom uttrycket av markören CD71 som är positivt i erytroblaster. Detta bevisar vikten av att mogna och mognande cellerna during erytropoes. Slutligen visar flödescytometriska grafer över cellerna före sådd skillnaden i fenotypen av hematopoietiska celler, där fig. 5A representerar normala hematopoietiska celler: mänskliga CBMNCs och figur 5B visar onormala hematopoietiska celler: primära leukemiceller. Halterna av CD235a + och CD45 + motsvarande erytrocyter och leukocyter respektive är högre i den normala prov än i leukemiska belysa hemoblastic karaktär leukemier.
Figur 1. Illustration av de processer som är involverade i PU ställning tillverkning och bio-funktionalisering. A) PU löses i dioxan (5 vikt%) och av termiskt inducerad fasseparation och efterföljande lösningsmedel sublimering ställningen produceras, såsom beskrivs av Safinia et al 13. B) Ställningen disken skärs sedan into kuber av 0,5 x 0,5 x 0,5 mm och därefter beläggas med hjälp av centrifugering med extra cellulära matrisen (ECM)-proteiner. C) MNC utvinns från människa navel CB eller BM aspiration använda densitetsgradientcentrifugering och såddes (2x10 6 celler / byggnadsställning) i PU ställningar med en mikropipett.
. Figur 2 Cellulär proliferation mätt med MTS-analys: A) med humant multinationella navelsträngsblod, B) med hjälp av humana primära leukemiceller. Staplarna visar tillväxten av celler över tiden när ympades i PU ställningar utan tillsats av exogena cytokiner.
Figur 3: Cell morfologi och distribution runt byggnadsställningar med cytospins, scanning elektronmikrofotografier. (AB) Representativa Wright-Giemsa färgade cytospins av A) mononukleära navelsträngsblod som samlats in från PU ställningar efter 28 dagars kultur, och B) ben aspirerade leukemiska celler samlas in från PU ställningar efter 14 dagars odling. Båda experimenten utfördes i cytokin fritt tillstånd. (A'-B ') Representativa centrala delarna av de PU ställningsdelar SEM-mikrofotografier av A') med frö navelsträngsblod MNC och B ') leukemiska celler efter att ha odlats i 28 dagar, och C) kontroll byggnadsställning utan celler.
Figur 4. Multiphoton mikrograf av en PU byggnadsställning ympades med navelsträngsblod multinationella efter 28 D i kultur och färgades med erytroid markören CD71.
Figur 5. flödescytometrisystem 3D dot-tomter färgas för CD45, CD71 och CD235a ytmarkörer uttryck. Den isotyp-kontroll uppnås presenteras också för jämförelse av den relativa fluorescensintensiteten. Panel A visar humant navelsträngsblod mononukleära celler positiva för de ovan markörer; Panel B visar humana primära leukemiceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo 3D odlingssystemet som presenteras här ger oss möjlighet att skapa en 3D-biomimicry av hematopoes som rekapitulerar den ursprungliga BM arkitekturen och cellulära fenotyp oberoende av exogena cytokiner. 3D-modellen ger strukturen och mikromiljön som möjliggör normala och onormala hematopoietiska celler att proliferera under förhållanden som liknar de som påträffas in vivo.
Valet av det polymera byggnadsställningsmaterial representeras ett kritiskt steg i biomimicry konstruktionen. Viktiga fördelar med biomaterial har lett till ett ökat intresse i polymerer som efterliknar in vivo miljön genom att ge den önskade arkitekturen, strukturella egenskaper och nödvändiga biosignaler. De polymerer måste uppfylla minimikrav som är väsentliga för deras tillämpning inom biomedicin, eftersom de alltid är i direkt kontakt med levande celler, som är känsliga för sin närmiljö. I allmänhet ett idel ställningen skall vara biokompatibla, mycket porösa, med tillräcklig mekanisk hållfasthet för att upprätthålla en definierad 3D-struktur, hög ytarea per volym-förhållande och reproducerbar tillverkning. PU omfattar alla fastigheter tillsammans, även om hög porositet och mekanisk hållfasthet kan anpassas och ändras beroende på kylning temperatur under TIPS processen. Som ett resultat kan detta biomimicry anpassas till andra typer av celler genom att öka eller minska porositet och porstorlek som behövs.
Ställningen i detta experiment är belagd med ECM-proteinet kollagen typ I, detta protein, båda tillsammans med andra ECM-proteiner testades tidigare i vår 3D-modell 11. Detta visade att kollagen typ I påskyndas celladhesion och valdes av den anledningen. Beläggningen kan modifieras genom användning av olika ECM-proteiner beroende på typen av celler som studeras. Fördelen att införliva de ECM-proteiner med den syntetiska stödstrukturer iar som inte bara de ger den cell-bindande sekvensen för celladhesion, men erbjuder även sekundära interaktioner med andra ECM-proteiner och växelverkan med tillväxtfaktorer som stabiliserar bindning av cellerna vilket kommer att öka celladhesionen, vilket resulterar i bättre celltillväxt och-mognad.
Ett flertal studier har gjorts på ex vivo hematopoes med både 2D-och 3D-system, och alla av dem omfattar tillsättning av onormalt höga koncentrationer av exogena cytokiner. Dessa studier har bidragit till att belysa molekylära faktorer som blodbildningen, men de cellulära och microenvironmental element integrerade i denna process har varit svårt att dechiffrera baserat på begränsningar av samma tekniker.
Den metod som beskrivs här, gjorde en biomimicry av BM av ett mycket poröst polymer Ställningen i kombination med ECM beläggning är optimal för att upprätthålla och stabilisera tillväxten av normal och onormal hematopoes utanbehovet av någon tillsats av cytokiner. Den mimicry stöder multi-linjära hematopoies gör systemet lämpligt för användning som en plattform för läkemedelsutveckling och vetenskapliga studie mekanismer för normal och onormal hematopoes ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Richard Thomas Leukemi fonden, Lady Tata Memorial Trust, Northwick Park Hospital Leukemi Research Trust Fund och National Institute of Health Research (NIHR), Storbritannien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N. Methods in Cell Biology. Prescott, D. 14, Academic Press Inc. New York. 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
