Summary
一种新型的高通量方法使单个细菌细胞，使用锁定的核酸探针和流式细胞仪荧光检测和小分子RNA和mRNA表达的相对定量描述
Abstract
荧光原位杂交（FISH）是一个强大的技术，用于检测和定位在蜂窝环境特定的核酸序列。为了增加吞吐量，鱼可以用流式细胞仪（流FISH）相结合，使数以千计的单个细胞的有针对性的核酸序列检测。因此，流鱼超过裂解/合奏基于核酸检测方法提供了一个独特的优势，因为每一个细胞都被视为一个独立的观察，从而允许强大的统计分析和方差分析。这些属性有提示的鱼和流量鱼的方法，在不同的应用程序的使用和端粒长度的测定1,2，细胞识别和基因表达的3,4已经成功地展示了这些方法的效用，监测病毒的乘法感染的细胞和细菌群落分析和枚举6。
传统上，鱼和流FISH方法的特异性DNA寡核苷酸探针传授。然而，最近增加鱼和流FISH探针的核酸类似物的DNA寡核苷酸探针更换由于每种技术的灵敏度和特异性较高的熔融温度，这些类似物 （T米）7,8自然核酸。锁核酸（LNA）探针是一个类型的核酸类似物，含有低噪声放大器（LNA）核苷酸添加整个DNA或RNA序列9,10。当与流动FISH相结合的LNA探针先前已被证明优于传统的DNA探针7,11，并已成功地用于检测5哺乳动物细胞真核生物mRNA的12和病毒RNA。
在这里，我们扩大这种能力和描述一个LNA流鱼方法，该方法允许在细菌细胞中的RNA特异性检测S（ 图1）。具体来说，我们有兴趣在检测小的非编码调控RNA（SRNA）在过去几年获得相当大的兴趣，因为他们已经发现，作为在许多关键的13细胞过程中的关键调控元件。然而，有限的工具来研究sRNAs和检测在细菌细胞斯尔纳的挑战，部分是由于规模相对较小（通常为50-300个核苷酸）和低丰度斯尔纳分子以及一般的工作难度较小的生物细胞与不同的细胞膜。在此方法中，我们描述的固定和permeabilzation条件，保护细菌细胞的结构和允许的LNA探针的渗透以及信号放大的步骤，使低丰度斯尔纳的具体检测（图2）。
Protocol
1。 LNA的探测和实验设计
- 设计的LNA探针，是您的转录斯尔纳/ mRNA的反向补充或他们的自定义设计 www.exiqon.com 。如果使用自定义的设计选项，你会知道的顺序，但不低噪声放大器（LNA）扣球模式。此外，在增加的T 之间米到每个LNA残留的DNA或RNA寡核苷酸结果两个10 ° C的低噪声放大器- RNA杂交双工 14 。理想的情况下，设计低噪声放大器（LNA）探头应20-25个核苷酸（较长的探头更难以合成） 之间的85-90之间的Tm ° C的RNA的杂交。
- 设计序列后，利用高炉http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi或探针序列比较本地数据库，以确保探头是只对特定的斯尔纳/ mRNA的利益。
- 订货时的LNA探针，LNA的寡核苷酸的5'端添加生物素甘醇修改。生物素是杂交后用链霉亲和染料共轭染色所需。它可以添加此修改的3'端，如果有必要，但另外的5'端更便宜，并应导致更高的收益率。
- 应包括三个阴性对照的方法：（一）“无LNA的控制，在其中LNA探头没有添加在杂交步骤，（二）”无染“控制的LNA探针杂交目标斯尔纳但杂交事件是没有检测到荧光染色的情况下，（三）“非表示斯尔纳/，表达”的控制，采用了低噪声放大器探头的目标是为了不存在或不表达斯尔纳监控非特异性杂交。
- 具体LNA探针这里是相辅相成的斯尔纳CsrB和序列5' -生物素- TEG - gTccAttTccCgtCctTagCagC - 3'（LNA的单体大写字母）。
- 在收到冻干低噪声放大器，在10-20微升等分无核酸酶水悬浮在-20 ° C至50微克/毫升和存储
解决方案
- paraformaldehye 8％，10％的乙酸在PBS（PFA）：混合1 mL 32％的煤灰，400μL乙酸，400μL10X PBS，pH = 7.4的，2.2毫升无核酸酶水。对于冻结等分，冻结在-20 ° C情况下使用醋酸等分单。
- 60％的硫酸葡聚糖溶液：添加6.0克硫酸葡聚糖50 mL锥形管，并加水至终体积10毫升。这种混合物加热至65 ° C水浴中溶解，直到硫酸葡聚糖（可能需要1-2小时）。的增溶过程中保持10毫升量增加，可能需要更多的水。分装在60％硫酸葡聚糖解决方案，并在-20 ° C储存，直到使用。
2。固定
- 收获1 × 10 8个细胞的生物发光
- 球离心五分钟在2300 XG的细菌细胞。倒掉上清，吹打在400μL1 × PBS重悬细胞。
- 这种混合物，添加400μLparaformaldehye 8％（PFA）和1X磷酸10％的醋酸缓冲液（1X PBS）的解决方案，拌匀，并孵育10分钟，在25 °彗星搅拌一次五分钟后。在加热管的持有人，除非另有说明，所有孵化执行。的煤灰的解决方案应准备新鲜或冷冻分装后用醋酸此外。多聚甲醛是一种交联固色剂的H电子学习产品，以维持细胞的形态和保留细胞内的RNA。
- 离心沉淀细胞从这种混合物在4500 XG两分钟，吹打除去上清液。所有需要离心未来步骤应该使用相同的设置（7K，2分钟）。重要的是要注意以下的离心上清应吹打，而不是调迁。
- 两次用400μL1 × PBS清洗细胞和悬浮在400μL1 × PBS最后的细胞沉淀。现在，这些细胞是固定的，并可以保存在4 ° C在400μL1 × PBS为七天。
3。焦碳酸二乙酯处理
- 准备400μL1X PBS（400μL该解决方案需要为每个样品进行测试，以便规模相应）0.1％的焦碳酸二乙酯（DEPC）解决方案。从残留的DEPC股票应准备新鲜的DEPC处理的解决方案。 DEPC处理可灭活carbethoxylation核糖核酸酶和减少背景信号。
- 加入400μL0.1％DEPC解决每一个固定的细菌细胞样本，并拌匀吹打。这种混合物在25 ° C孵育12分钟。清洗细胞两次与400μL1 × PBS，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。
4。通透
- 溶菌酶添加1.0毫克，1.0 mg / mL的溶液1毫升的Tris - EDTA缓冲液（10毫米的Tris，1 mM的EDTA，pH值8.0）。该解决方案应准备新鲜。添加800μL1 mg / mL的溶菌酶溶液的细胞，调匀吹打，并培育25 ° C时30分钟，偶尔搅拌。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。溶菌酶行为水解细菌细胞壁的肽聚糖目前作为一个通透试剂。
- 准备在TE缓冲液中的蛋白酶K 3.0微克/ mL的溶液。从20 mg / mL的蛋白酶K的股票是储存在-20 ° C，这一解决方案应准备新鲜蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，消化各种蛋白质，并有助于的RNA的探针和试剂的可访问性。
- 加入800μL的3.0微克/ mL蛋白酶K溶液细胞沉淀，调匀吹打。在25 ° C孵育15分钟，中途通过孵化与涡旋。
- 颗粒细胞（7K，2分钟），取出上清液，用400μL1 × PBS洗细胞一次。取出后洗净上清，400μL1 × PBS重悬细胞，并添加到四个新的1.5 ml离心管100μL的再悬浮。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。
5。杂交
- 准备每个样品100μL杂交缓冲液（HB）。高亮度的50％甲酰胺，按量，按重量的10％右旋糖酐硫酸（添加16.7μL的60％硫酸葡聚糖溶液，每100μL，），1X登哈特的解决方案，50 mM磷酸钠pH值7.0，2X柠檬酸钠（SSC），20微克剪切鲑鱼精子DNA（SSSD）和20微克酵母tRNA。
- 高亮度的组成部分，每个人都有不同的目的。甲酰胺降低核酸，从而帮助双链RNA的变性和减少细胞损伤的熔融温度。硫酸葡聚糖是作为一个体积不包括聚合物集中探头和提高杂交率。 Denhardts解决方案，酵母tRNA和SSSD作为一个阻断剂，以减少非特异性结合。
- 再悬浮含1.5毫升离心管，在每个细胞中添加95μLHB和5.0斯尔纳/μL，表达特定的LNA或水（没有LNA的阴性对照）[20 pmol具体LNA终浓度]。例如：
- 管1 - 95μL，HB + 5.0μL，斯尔纳/ mRNA的特异性探针
- 管2 - 95μLHB + 5.0μL，斯尔纳/ mRNA的特异性探针（“不染”阴性对照）
- 管3 - 95μL，HB + 5.0μL，斯尔纳/基因探针（“非表示斯尔纳/ mRNA的阴性对照）
- 管4 - 95μL，HB + 5.0μL水（“没有LNA的”阴性对照）
- 所有四个样品在60℃孵育60分钟。杂交温度取决于LNA的探针（S） 的 Tm，并应设置约30 ° C以下，预测的RNA退火米T为。高架杂交温度，并在HB甲酰胺确保斯尔纳或利益的mRNA的二级结构变性。
6。后杂交洗
- 杂交后，添加0.1％吐温20（SSCT）1.0毫升0.1X SSC杂交混合物。这是必要的，允许粘性杂交液中取出的细胞从。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。
- 加入200μL50％甲酰胺，2X SSC，0.1％Tween - 20的细胞沉淀，调匀和incub30分钟吃65 ° C的加热块。
- 加入1 ml 0.1X SSCT的混合物，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。
- 加入500μl的0.1X SSCT悬浮细胞和一个加热块40分钟，65℃孵育。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。
7。阻塞和染色
- 准备封闭液（BB）和链霉菌染色解决方案。从5倍的股票（市售，见试剂），准备一个1X BB的解决方案。对于每四个管子，准备1.2毫升1X BB。
- 加入200μl1X的BB，重悬细胞沉淀，孵育30分钟，25 ° C。
- 一个链霉亲和共轭染料是用来检测的生物素标记的低噪声放大器（LNA）探针。同时阻止，准备2微克/毫升DyLight 488链霉亲和素或1X为30分钟（三个样品，使300μL）BB共轭染料 - 亲你想要的解决方案。
- 后incubATION与1X BB，颗粒细胞（7K，2分钟），去除上清。加入50μL的链霉亲和染液细胞沉淀，调匀，孵育12分钟，25 ° C恒定混合旋涡，或在thermomixer。 “不染”的控制，只添加50μL的1X封闭液。对于其余的协议，保护使用铝箔的光管。
- 用500μl的0.1X SSCT缓冲洗细胞一次，一次400μL1X PBS 0.1％吐温20（PBST）。沉淀细胞（7K，2分钟），去除上清。
- 继最初的链霉亲和共轭染色，信号被放大，引入生物素标记的抗链霉亲和抗体的链霉亲和染料的共轭，然后染色与链霉亲和染料从而增加每LNA的探针杂交信号输出（图2）第二次。
- 加入100μL1微克/毫升的生物素化的抗 - 亲和抗体1X PBS，resuspend的细胞，孵育在25℃30分钟，偶尔搅拌彗星。颗粒细胞（7K，2分钟），取出上清液400μL1X PBST洗两次。
- 加入50μL的2微克/毫升链霉菌细胞染液，调匀，孵育12分钟，25 °恒定混合旋涡，或在thermomixer C。 “不染”的控制，只添加50μL的1X封闭液。
- 清洗细胞一次用500μl的0.1X SSCT缓冲区，一旦与400μL1X PBST。
- 细胞重悬于200μL1X PBST和储存于4 ° C，直到准备流式细胞仪分析。对于规模较小的细菌细胞集流速缓慢下降的核心大小。此外，与前向散射阈值截断流式细胞仪，截止必须尽可能低，以确保小细菌细胞检测。
- DyLight 488检测，流式细胞仪应配备一个488 nm激光和标准排放过滤为FITC标记。应收集事件至少2X10 4。与流式细胞仪配备不同的激光器兼容，其他的链霉亲和共轭荧光团可用于本议定书。
8。代表性的成果
例如，有效固定和通透的细胞在流式细胞仪散点图图 3A所示。使用通透描述了上述条件时，细胞的人口是小和同质表明一些细胞聚集。当溶菌酶浓度较高（5毫克/毫升）的使用，细胞更容易聚集并显示增加向前的分散值，表明较大的颗粒（ 图3B） 。流式细胞仪从一个成功的LNA流FISH实验数据的一个例子是如图4所示。直方图表明，随着三个阴性对照的具体目标斯尔纳检测。“不染”阴性对照，产生最少的荧光，“没有低噪声放大器”和“非表示斯尔纳阴性对照。最后，特定SRNA - LNA探针与样品产生最大的荧光。一旦以这种方式进行验证，方法和LNA探针，可以进行更多的试验旨在监视斯尔纳信号的变化，随着时间的推移，在应对突变或不同的文化条件等
图1描绘了一个LNA流鱼的细菌斯尔纳检测试验总体方案。
图2。染色和LNA的流动FISH信号放大。 A）生物素化的LNA探针杂交。 B）染色与荧光DyLight 488链霉亲和共轭。 C）的生物素化抗- S绑定treptavidin抗体DyLight 488链霉。抗体可以通过其抗原结合位点结合的链亲和素或可通过其生物素残留链霉亲和约束。 D）进一步荧光DyLight 488链霉亲和共轭染色的信号放大。
图3流式细胞仪检测点图显示侧散射结果与A）1 mg / mL的溶菌酶，3微克/ mL的蛋白酶K通透和B）5毫克/毫升溶菌酶，3μg/ ml的蛋白酶K通透。
图4。直方图分析LNA流FISH结果。从每个样品产生的荧光信号是由四个痕迹所示：黑色 - 具体SRNA - LNA探针;红色 - “非表示斯尔纳”阴性对照;蓝色 - “没有LNA的”阴性对照;紫色 -“不染阴性对照。
Discussion
LNA流鱼这里介绍的方法是用来检测革兰氏阴性的海洋弧菌campbellii的表达先前已确认通过芯片为基础的表达谱和逆转录聚合酶链反应16 SRNA的表达。到目前为止，我们已经利用这种方法来监视多种RNA分子（如跨编码斯尔纳，斯尔纳调节蛋白质的活性，核糖开关，和mRNA）的表达。因此，我们有信心，该方法的适应性和可用于检测任何斯尔纳或mRNA的目标，在任何细菌的物种或细胞类型，可使用修改。如果本协议的修改是必要的其他类型的细胞中，最重要的变量要考虑操纵的通透性一步。例如，当修改这里描述的通透条件，溶菌酶和蛋白酶K的浓度变化，应进行测试。我们发现，加倍或三倍量的溶菌酶和蛋白酶K在LNA流FISH结果导致了重大变化。此外，在测试时附加的通透条件，细胞应为聚集，细胞的损失，并获得最好的信号背景荧光比分析。细胞聚集程度可以通过显微镜和/或流式细胞仪进行测试。流式细胞仪，细胞团块，目前正向与侧向散射散点图和正确的通透性方法的尾巴，将最大限度地减少这种拖尾效果。可以添加额外的LNA与其他半抗原，如地高辛标记的探针在杂交步骤，然后与抗地高辛抗体和二级抗体荧光基团共轭检测，这种方法也适合复所描述的协议没有重大修改，斯尔纳检测。目前，唯一的限制，我们用这种方法遇到的是它无法产生足够的信号从弱前按下斯尔纳物种和正在努力，以确定检测阈值（每个单元格的绝对拷贝数）。
总体而言，低噪声放大器（LNA）的流FISH方法提供了机会，测量单细胞高通量地为客户提供一个斯尔纳物种的存在和相对丰度和其表达变化在何种程度上的见解级细菌斯尔纳或mRNA表达在人群中。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由海军研究办公室通过美国海军研究实验室的核心资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Applied Biosystems | AM9625 | |
| Nuclease-free water | Applied Biosystems | AM9932 | (not DEPC treated) |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15714 | Ethanol free |
| Acetic acid | Acros Organics | 327290010 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | Keep desiccated |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L2879 | |
| Proteinase K (20 mg/mL) | Applied Biosystems | AM2546 | |
| Formamide | Applied Biosystems | AM9342 | Deionized, aliquot and freeze |
| Dextran sulfate MW > 500,000 | Sigma-Aldrich | D8906 | Aliquot 60% solution and freeze |
| Denhardt’s solution 50X concentrate | Sigma-Aldrich | D2532 | Aliquot and freeze |
| Sodium citrate buffer 20X | Applied Biosystems | AM9770 | |
| Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL | Applied Biosystems | AM9680 | Aliquot and freeze |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | Life Technologies | 15401-011 | Aliquot and freeze |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 5X in situ hybridization blocking solution | Vector Laboratories | MB-1220 | |
| DyLight 488 streptavidin | Vector Laboratories | SA-5488-1 | |
| Biotinylated anti-streptavidin | Vector Laboratories | BA-0500 | Aliquot and freeze |
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