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Immunology and Infection

Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

Published: January 10, 2012 doi: 10.3791/3655
Automatic Translation
1, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

Summary

Un romanzo ad alta produttività metodo è descritto che consente il rilevamento e la quantificazione relativa di RNA di piccole e di espressione di mRNA da singole cellule batteriche con bloccate le sonde di acidi nucleici e di citometria a flusso fluorescenza

Abstract

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una potente tecnica che viene utilizzata per rilevare e localizzare specifiche sequenze di acido nucleico in ambiente cellulare. Al fine di aumentare il throughput, FISH può essere combinato con citometria a flusso (flow-FISH) per consentire il rilevamento di mirate sequenze di acidi nucleici in migliaia di singole celle. Di conseguenza, il flusso-FISH offre un netto vantaggio rispetto lisato / ensemble basati su acidi nucleici metodi di rilevamento in quanto ogni cellula viene trattato come un osservazione indipendente, consentendo in tal modo più forte le analisi statistiche e varianza. Questi attributi hanno spinto l'uso di metodi FISH e flusso-FISH in un certo numero di applicazioni diverse e l'utilità di questi metodi è stato dimostrato con successo nel determinare la lunghezza dei telomeri 1,2, identificazione cellulare e genica 3,4, il monitoraggio moltiplicazione virale in cellule infette 5 e analisi di comunità batteriche e di enumerazione6.

Tradizionalmente, la specificità dei metodi di FISH e flusso-FISH è stata impartita da sonde di oligonucleotidi DNA. Recentemente, tuttavia, la sostituzione delle sonde di DNA oligonucleotide con gli analoghi degli acidi nucleici come sonde FISH e flusso-FISH ha aumentato sia la sensibilità e la specificità di ogni tecnica a causa delle temperature di fusione più elevato (T m) di questi analoghi naturali per acidi nucleici 7,8 . Chiuso acido nucleico (LNA) sonde sono un tipo di acido nucleico analogico che contengono nucleotidi LNA a spillo durante una sequenza di DNA o RNA 9,10. Quando accoppiato con flusso-FISH, sonde LNA hanno già dimostrato di sovraperformare sonde di DNA convenzionali 7,11 e sono stati utilizzati con successo per rilevare l'mRNA eucariotico 12 e RNA virale nelle cellule dei mammiferi 5.

Qui espandere questa capacità e descrivere un flusso-FISH LNA metodo che permette di rilevare specifiche di RNA in cellule batteriches (Figura 1). In particolare, siamo interessati a rilevare piccole non codificanti regolamentazione RNA (Srna), che hanno raccolto un notevole interesse negli ultimi anni in quanto sono stati trovati a servire come chiave di elementi regolatori in molti processi cellulari fondamentali 13. Tuttavia, ci sono strumenti limitati per lo studio sRNAs e le sfide di rilevare Srna nelle cellule batteriche è in parte dovuto alle dimensioni relativamente piccole (tipicamente 50-300 nucleotidi di lunghezza) e l'abbondanza di molecole a basso Srna e la generale difficoltà nel lavorare con piccole cellule biologiche con differenti membrane cellulari. In questo metodo, si descrivono le condizioni di fissazione e permeabilzation che conservano la struttura delle cellule batteriche e permettere la penetrazione di sonde LNA, nonché alle fasi di amplificazione del segnale che consentono il rilevamento specifico di abbondanza Srna basso (Figura 2).

Protocol

1. Sonde LNA e disegno sperimentale

  1. Disegno sonde LNA che sono il complemento inverso del vostro Srna trascritto / mRNA o li hanno progettati su misura a www.exiqon.com . Se si utilizza l'opzione personalizzata di progettazione, si conosce la sequenza, ma non il modello spiking LNA. L'aggiunta di ogni residuo LNA in un DNA o RNA oligonucleotide risultati in un aumento della T m tra i due ei 10 ° C per un LNA-RNA duplex ibridazione 14. Idealmente, le sonde LNA progettato deve essere di 20-25 nucleotidi di lunghezza (più sonde sono più difficili da sintetizzare) e hanno una T di m tra 85-90 ° C per l'RNA ibridazione.
  2. Dopo aver progettato la sequenza, l'uso BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi o confrontare la sequenza della sonda al database locale per assicurare la sonda è specifica solo per il tuo Srna / mRNA di interesse.
  3. Al momento dell'ordine la sonda LNA, aggiungere un biotina-TEG modifica per porre fine alla 5 'del oligonucleotide LNA. Il biotinilazione è necessario per la post-ibridazione colorazione con un streptavidina coniugato con il colorante. E 'possibile aggiungere questa modifica al 3', se necessario, ma l'aggiunta al 5 'è meno costoso e deve portare a rendimenti più elevati.
  4. Tre controlli negativi dovrebbero essere inclusi nel metodo: (i) un 'no LNA' di controllo, in cui una sonda LNA non viene aggiunto durante l'ibridazione, (ii) un controllo 'non colorante' in cui la sonda LNA è ibridato al bersaglio Srna, ma l'evento di ibridazione non viene rilevato per l'assenza della macchia fluorescente, e controllo (iii) 'mRNA non espresso Srna /' uno che utilizza una sonda LNA che si rivolge a un Srna inesistente o non espresso in ordine di monitorare non specifici ibridazione.
  5. La sonda specifica LNA qui è complementare al CsrB Srna e ha la sequenza 5'-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(monomeri di LNAlettere maiuscole).
  6. Dopo aver ricevuto liofilizzato LNA, risospendere con acqua priva di nucleasi a 50 mg / mL e conservare in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C.

Soluzioni

  • 8% paraformaldehye (PFA), 10% di acido acetico in PBS: Mix 1 ml 32% pfa, 400 microlitri acido acetico, 400 microlitri di PBS 10X, pH = 7,4, e 2,2 ml acqua priva di nucleasi. Per le aliquote congelate, congelare in aliquote uso singola a -20 ° C senza acido acetico.
  • 60% la soluzione di solfato di destrano: aggiungere 6,0 g di solfato di destrano in una provetta da 50 ml conica e aggiungere acqua ad un volume finale di 10 ml. Questa miscela di calore a 65 ° C a bagnomaria fino a quando il solfato di destrano è sciolto (potrebbe durare 1-2 ore). Acqua che potrebbe essere necessario aggiungere tutto il processo di solubilizzazione di mantenere un volume di 10 ml. Aliquota del 60% destrano la soluzione di solfato e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

2. Fissazione

  1. Harvest 1x10 8 celle di bioluminescenti
  2. Agglomerare le cellule batteriche per centrifugazione a 2300 xg per cinque minuti. Scartare il surnatante pipettando e risospendere le cellule in 400 ml di PBS 1X.
  3. A questa miscela, aggiungere 400 ml di uno paraformaldehye 8% (PFA) e il 10% di acido acetico in soluzione salina tamponata con fosfato 1X (1X PBS) soluzione, mescolare bene e incubare per 10 minuti a 25 ° C mescolando una volta dopo cinque minuti. Tutte le incubazioni, salvo diversa indicazione, sono eseguite in un supporto tubo riscaldato. La soluzione pfa deve essere preparato fresco o usato da aliquote congelati dopo l'aggiunta di acido acetico. Paraformaldeide è un fissativo reticolazione che hPEL di conservare la morfologia cellulare e mantenere l'RNA intracellulare.
  4. Agglomerare le cellule da questo miscuglio per centrifugazione a 4500 xg per due minuti e rimuovere il surnatante pipettando. Tutti i passaggi futuri che richiedono centrifugazione dovrebbe usare le stesse impostazioni (7K, 2 min). E 'importante notare che dopo la centrifugazione surnatanti dovrebbe essere rimosso pipettando e non decantazione.
  5. Lavare le cellule due volte con 400 microlitri di PBS 1X e risospendere il pellet cellulare finale in 400 microlitri di PBS 1X. Le cellule sono fissi e possono essere conservati a 4 ° C in 400 microlitri di PBS 1X per un massimo di sette giorni.

3. Dietil pirocarbonato trattamento

  1. Preparare 400 ml di una soluzione 0,1% del dietil pirocarbonato (DEPC) in 1X PBS (400 ml di questa soluzione è necessario per ogni campione da analizzare in modo scala di conseguenza). La soluzione DEPC deve essere preparato fresco da uno stock DEPC. Trattamento DEPC inattiva RNasi da carbethoxylation e diminuisce ildel segnale di fondo.
  2. Aggiungere 400 microlitri della soluzione del 0,1% DEPC ad ogni campione fisso di cellule batteriche e mescolare bene pipettando. Incubare la miscela a 25 ° C per 12 minuti. Lavare le cellule due volte con 400 microlitri di PBS 1X, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.

4. Permeabilizzazione

  1. Aggiungere 1,0 mg di lisozima a 1 ml di tampone Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) per un mg / mL di soluzione 1.0. Questa soluzione deve essere preparato fresco. Aggiungere 800 microlitri della mg / 1 ml soluzione di lisozima alle cellule, mescolare accuratamente pipettando e incubare a 25 ° C per 30 minuti mescolando di tanto in tanto. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. Lisozima agisce come reagente permeabilizzazione idrolizzando peptidoglicano presente nella parete cellulare batterica.
  2. Preparare un 3,0 mg / ml soluzione di proteinasi K nel buffer TE. Questa soluzione deve essere preparato fresco da un mg / ml 20 magazzino proteinasi K che viene conservato a -20 ° C.Proteinasi K è una serina proteasi che digerisce una varietà di proteine ​​e aiuta l'accessibilità delle sonde e reagenti per l'RNA.
  3. Aggiungere 800 microlitri della 3,0 mcg / ml soluzione proteinasi K al pellet e mescolare bene pipettando. Incubare a 25 ° C per 15 minuti con vortex a metà incubazione.
  4. Agglomerare le cellule (7K, 2 min), rimuovere il surnatante e lavare le cellule una volta con 400 microlitri di PBS 1X. Dopo aver rimosso il surnatante lavaggio, risospendere le cellule in 400 microlitri di PBS 1X e aggiungere 100 microlitri della risospensione in quattro nuove da 1.5 mL microcentrifuga. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.

5. Ibridazione

  1. Preparare 100 ml di buffer di ibridazione (HB) per ogni campione. L'HB è composto da 50% formammide in volume, il 10% di solfato di destrano in massa (aggiungere 16,7 ml di soluzione al 60% del solfato di destrano microlitri per ogni 100), soluzione 1X Denhardt, a 50 mM fosfato di sodio pH 7.0,Sodio citrato 2X (SSC), 20 mg di DNA salmone tranciati spermatozoi (SSSD) e 20 tRNA di lievito mcg.
  2. Ognuno dei componenti della HB ha uno scopo diverso. Formammide abbassa la temperatura di fusione di duplex acidi nucleici contribuendo così con denaturazione del RNA e minimizzare i danni cellulari. Solfato di destrano è usato come un volume esclusi-polimero per concentrare la sonda e aumentare il tasso di ibridazione. Soluzione Denhardts, lievito e SSSD tRNA fungono da agenti di blocco per ridurre legame non specifico.
  3. In ognuno di cella risospensione contenenti provette da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 95 microlitri e microlitri HB 5.0 del Srna / mRNA specifico LNA [20 pmol di concentrazione specifico LNA finale] o acqua (per la LNA alcun controllo negativo). Per esempio:
    1. Tubo 1-95 microlitri HB + 5,0 microlitri Srna / mRNA-sonda specifica
    2. Tubo 2-95 microlitri HB + 5,0 microlitri Srna / mRNA-sonda specifica (controllo negativo 'no dye')
    3. Tubo 3-95 microlitri HB + Srna 5,0 microlitri/ MRNA sonda ('non espresso Srna / mRNA' di controllo negativo)
    4. Tubo 4-95 microlitri HB + acqua 5,0 microlitri ('no LNA' controllo negativo)
  1. Incubare tutti e quattro i campioni a 60 ° C per 60 minuti. La temperatura di ibridazione dipende dalla sonda LNA (s) T m e dovrebbe essere fissata a circa 30 ° C al di sotto del predetto T m per ricottura RNA. Sia l'elevata temperatura di ibridazione e formammide in HB garantisce la denaturazione di struttura secondaria della Srna o mRNA di interesse.

6. Post-ibridazione lava

  1. Dopo l'ibridazione, aggiungere 1,0 mL 0,1 X. SSC con 0,1% di Tween-20 (SSCT) alla miscela di ibridazione. Ciò è necessario per consentire alle cellule di essere rimosso dalla soluzione di ibridazione viscoso. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.
  2. Aggiungere 200 ml di 50% formammide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 per il pellet cellulare, mescolare accuratamente e incubmangiò per 30 minuti a 65 ° C su una piastra riscaldante.
  3. Aggiungere 1 ml 0,1 X. SSCT alla miscela, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.
  4. Aggiungere 500 microlitri SSCT 0,1 X. per risospendere le cellule e incubare per 40 minuti a 65 ° C in un blocco di calore. Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.

7. Blocco e colorazione

  1. Preparare il tampone di bloccaggio (BB) e la streptavidina-dye soluzione colorante. Preparare una soluzione 1X BB da uno stock 5X (disponibile in commercio, vedi reagenti). Per ogni serie di quattro tubi, preparare 1,2 ml 1X BB.
  2. Aggiungere 200 ul 1X BB al pellet cellulari, risospendere e incubare per 30 minuti a 25 ° C.
  3. Un streptavidina coniugata con colorante è utilizzato per rilevare le sonde LNA biotinilato. Mentre il blocco, preparare una soluzione di 2 mg / mL DyLight 488 streptavidina o il vostro desiderato dye-streptavidina coniugato in 1X BB per 30 min (per tre campioni, fanno 300 mL).
  4. Dopo incubzione con 1X BB, agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 microlitri della streptavidina-colorante soluzione al pellet cellulare, mescolare accuratamente, e incubare per 12 minuti a 25 ° C con miscelazione costante in un vortice o in un Thermomixer. Per il controllo 'no dye', aggiungere 50 microlitri di buffer 1X blocco solo. Per il resto del protocollo, proteggere i tubi di luce utilizzando un foglio di alluminio.
  5. Lavare le cellule una volta con 500 microlitri di buffer SSCT 0,1 X. e una volta con 400 microlitri 1X PBS con 0,1% di Tween-20 (PBST). Agglomerare le cellule (7K, 2 min) e rimuovere il surnatante.
  6. Dopo l'iniziale coniugato streptavidina-colorazione, il segnale viene amplificato introducendo un biotinilato anti-streptavidina anticorpi alla streptavidina coniugato con il colorante e poi colorazione una seconda volta con la streptavidina-dye aumentando così l'uscita del segnale per ibridato LNA sonda (Figura 2) .
  7. Aggiungere 100 ml di 1 mg / mL biotinilato anti-streptavidina anticorpi in PBS 1X, resuspend le cellule e incubare a 25 ° C per 30 minuti mescolando con occasionali. Agglomerare le cellule (7K, 2 min), rimuovere il surnatante e lavare due volte con 400 microlitri PBST 1X.
  8. Aggiungere 50 microlitri della 2 mcg / ml streptavidina-dye soluzione per le cellule, mescolare accuratamente, e incubare per 12 minuti a 25 ° C con miscelazione costante in un vortice o in un Thermomixer. Per il controllo 'no dye', aggiungere 50 microlitri di buffer 1X blocco solo.
  9. Lavare le cellule una volta con 500 microlitri di buffer SSCT 0,1 X. e una volta con 400 microlitri PBST 1X.
  10. Risospendere le cellule in 200 microlitri PBST 1X e conservare a 4 ° C fino al momento per l'analisi di citometria a flusso. Per le piccole cellule batteriche impostare la velocità di flusso per rallentare per ridurre le dimensioni del nucleo. Inoltre, per citofluorimetri con tagli in avanti la soglia scatter, il taglio deve essere quanto più basso possibile per garantire le piccole cellule batteriche vengono rilevati.
  11. Per DyLight 488 rilevamento, il citofluorimetro deve essere dotato di un laser a 488 nm e standard di emissionefiltri per FITC. Almeno 2x10 4 eventi dovrebbero essere raccolti. Per la compatibilità con citofluorimetri dotati di laser differenti, altri streptavidina coniugata con fluorofori possono essere utilizzati per questo protocollo.

8. Rappresentante risultati

Un esempio di cellule che sono fissi e permeabilizzate è mostrato efficace nel dot plot di citometria a flusso in figura 3a. Quando si utilizzano le condizioni di cui sopra per permeabilizzazione, la popolazione cellulare è aggregati indicando piccola e omogenea delle cellule pochi. Se è superiore (5 mg / ml) concentrazioni di lisozima sono usate, le cellule hanno maggiori probabilità di aggregare e mostrare una maggiore dispersione dei valori in avanti, indicativo di particelle più grandi (Figura 3B). Un esempio di citometria a flusso di dati da un flusso di successo LNA-FISH è riportato in Figura 4. L'istogramma mostra la rilevazione specifica di un bersaglio Srna insieme a tre controlli negativi.Il controllo negativo 'no colorante' produce meno fluorescenza, seguito dal 'no LNA' e 'non espresso Srna' controlli negativi. Infine, il campione con il Srna-specifica sonda LNA produce il massimo di fluorescenza. Una volta che il metodo e le sonde LNA sono convalidati in questo modo, ulteriori esperimenti possono essere progettati per monitorare le variazioni nel segnale di Srna nel corso del tempo, in risposta alle mutazioni o condizioni di coltura varia, ecc

Figura 1.
Figura 1. Rappresentazione dello schema generale di un flusso-FISH esperimento LNA per il rilevamento di Srna batterica.

Figura 2.
Figura 2. Colorazione e l'amplificazione del flusso-FISH segnale LNA. a) Ibridazione della sonda biotinilato LNA. b) con la colorazione fluorescente DyLight 488 coniugato streptavidina. c) Il legame del biotinilato anti-streptavidin anticorpi al DyLight 488 streptavidina. L'anticorpo può legarsi streptavidina attraverso il suo sito di legame antigene o può essere vincolato da streptavidina attraverso i suoi residui di biotina. d) L'amplificazione del segnale dalla colorazione ulteriormente con la fluorescente DyLight 488 coniugato streptavidina.

Figura 3.
Figura 3. Trame dot citometria a flusso che mostrano in avanti rispetto ai risultati dispersione laterale per a) 1 mg / ml lisozima, 3 mg / ml proteinasi K permeabilizzazione e b) 5 mg / ml di lisozima, 3 mcg / ml proteinasi K permeabilizzazione.

Figura 4.
Figura 4. Istogramma analisi del flusso-FISH risultati LNA. Il segnale di fluorescenza generata da ciascun campione è mostrato dalle quattro tracce: nero - Srna specifici LNA sonda; rosso - controllo negativo 'non espresso Srna'; blu - controllo negativo 'no LNA'; viola -'No colorante' di controllo negativo.

Discussion

Il flusso-FISH LNA metodo presentato qui è stato utilizzato per rilevare l'espressione di un Srna da Gram-negativi marino batterio Vibrio campbellii la cui espressione è già stata confermata mediante microarray a base di profili di espressione e di invertire la reazione della polimerasi a catena della trascrizione 16. Fino ad oggi, abbiamo utilizzato questo metodo per monitorare l'espressione di una varietà di RNA (es. trans-codifica Srna, Srna che modulano l'attività della proteina, riboswitches, e mRNA). Come tale, siamo certi che il metodo è adattabile e può essere utilizzato per rilevare eventuali bersaglio Srna o mRNA e può essere modificato per l'uso in tutte le specie batteriche o tipo di cellula. Se la modifica di questo protocollo è necessario per altri tipi di cellule, la variabile più importante da considerare la manipolazione è il passo permeabilizzazione. Per esempio, quando si modificano le condizioni di permeabilizzazione qui descritte, i cambiamenti nelle concentrazioni di lisozima e proteinasi K dovrebbe essere testato. Abbiamo scoperto che raddoppiando otriplicando la quantità di lisozima e proteinasi K portato a grandi cambiamenti nel flusso-FISH risultati LNA. Inoltre, quando le condizioni di prova permeabilizzazione aggiuntive, le cellule devono essere analizzati per aggregazione, perdita di cellule, e il miglior segnale ottenibile rapporto fluorescenza di fondo. Il grado di aggregazione delle cellule possono essere testati per al microscopio e / o di citometria a flusso. Mediante citometria di flusso, grumi di cellule sono presenti, come le code in avanti rispetto scatter plot parte punti e il metodo di permeabilizzazione corretto ridurre al minimo questo effetto tailing. Questo metodo è anche suscettibile di rilevazione Srna multiplex senza grosse modifiche al protocollo descritto come ulteriori sonde LNA etichettati con apteni altri come digossigenina potrebbero essere aggiunte durante l'ibridazione e poi rilevata con un anticorpo anti-digossigenina e secondario coniugato anticorpo-fluoroforo. Attualmente, l'unica limitazione che abbiamo incontrato con questo metodo è la sua incapacità di generare sufficiente segnale da debolmente exspecie Srna pressato e gli sforzi sono in corso per determinare la soglia di rilevazione (in numero di copie in assoluto per cella).

Nel complesso, il flusso-FISH LNA metodo offre la possibilità di misurare Srna batterica o espressione di mRNA a singolo livello di cella in un modo un elevato throughput di fornire uno sguardo sulla presenza e abbondanza relativa di una specie Srna e il grado in cui la sua espressione varia in una popolazione.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory fondi core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Applied Biosystems AM9625
Nuclease-free water Applied Biosystems AM9932 (not DEPC treated)
32% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15714 Ethanol free
Acetic acid Acros Organics 327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 Keep desiccated
Lysozyme Sigma-Aldrich L2879
Proteinase K (20 mg/mL) Applied Biosystems AM2546
Formamide Applied Biosystems AM9342 Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000 Sigma-Aldrich D8906 Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate Sigma-Aldrich D2532 Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X Applied Biosystems AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL Applied Biosystems AM9680 Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL) Life Technologies 15401-011 Aliquot and freeze
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
5X in situ hybridization blocking solution Vector Laboratories MB-1220
DyLight 488 streptavidin Vector Laboratories SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin Vector Laboratories BA-0500 Aliquot and freeze

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References

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