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Immunology and Infection

Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

Published: January 10, 2012 doi: 10.3791/3655
Automatic Translation
1, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

Summary

Una novela de alto rendimiento se describe el método que permite la detección y cuantificación relativa de los pequeños ARN y la expresión del ARNm de las células bacterianas individuales usando sondas de ácido nucleico cerrado y citometría de flujo fluorescente

Abstract

Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una poderosa técnica que se utiliza para detectar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en el entorno celular. Con el fin de aumentar el rendimiento, el pescado puede ser combinado con citometría de flujo (flow-FISH) para permitir la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicos en miles de células individuales. Como resultado, el flujo de-pescado ofrece una clara ventaja sobre lisado / conjunto de métodos basados ​​en la detección de ácidos nucleicos, ya que cada célula es tratada como una observación independiente, lo que permite mayor análisis estadísticos y la varianza. Estos atributos han impulsado el uso de métodos FISH y el flujo de pescado en un número de diferentes aplicaciones y la utilidad de estos métodos se ha demostrado con éxito en la determinación de los telómeros de longitud 1,2, identificación celular y la expresión de genes 3,4, el seguimiento de multiplicación viral en 5 células infectadas, y el análisis de la comunidad bacteriana y la enumeración de6.

Tradicionalmente, la especificidad de los métodos FISH y el flujo de FISH-ha sido impartida por las sondas de oligonucleótidos de ADN. Recientemente, sin embargo, la sustitución de las sondas de oligonucleótidos de ADN con análogos de ácidos nucleicos como sondas de FISH y el flujo de FISH-ha aumentado la sensibilidad y la especificidad de cada técnica debido a las temperaturas de fusión más alto (T m) de estos análogos de ácidos nucleicos naturales 7,8 . De ácido nucleico cerrado (LNA) sondas son un tipo de análogo de ácido nucleico que contienen nucleótidos LNA disparó a través de una secuencia de ADN o ARN 9,10. Cuando se combina con el flujo-FISH, sondas LNA han sido previamente demostrado para superar las sondas convencionales de ADN 7,11 y se han utilizado con éxito para detectar ARNm eucariotas 12 y el ARN viral en células de mamíferos 5.

Aquí ampliar esta capacidad y describir un LNA de flujo PESCADO método que permite la detección específica del ARN en la célula bacterianas (Figura 1). En concreto, estamos interesados ​​en la detección de los pequeños no codificante ARN regulador (sRNA), que han cosechado un considerable interés en los últimos años, ya que se ha encontrado que sirven como elementos reguladores clave en muchos procesos celulares críticos 13. Sin embargo, hay pocas herramientas para estudiar sRNAs y los desafíos de la detección de sRNA en las células bacterianas se debe en parte al tamaño relativamente pequeño (normalmente 50-300 nucleótidos de longitud) y la baja abundancia de las moléculas de sRNA, así como la dificultad general en el trabajo con pequeñas células biológicas con diferentes membranas celulares. En este método, se describen las condiciones de fijación y permeabilzation que conservan la estructura de las células bacterianas y de permitir la penetración de las sondas LNA así como los pasos de amplificación de señal que permiten la detección específica de baja abundancia Srna (Figura 2).

Protocol

1. LNA sondas y diseño experimental

  1. Diseño de sondas LNA que son el complemento reverso de su sRNA transcripción / ARNm o hacer diseño personalizado en www.exiqon.com . Si se utiliza la opción de diseño personalizado, se conoce la secuencia, pero no el patrón de presión LNA. La adición de cada residuo LNA en un ADN o ARN resultados de oligonucleótidos en un aumento de la T m de entre dos y 10 ° C durante un dúplex de hibridación LNA-ARN 14. Lo ideal sería que las sondas LNA diseñado debe ser entre 20 a 25 nucleótidos de longitud (ya las sondas son más difíciles de sintetizar) y tiene un T m de entre 85-90 º C para el ARN de hibridación.
  2. Después de diseñar la secuencia, el uso de BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi o comparar la secuencia de la sonda a su base de datos local para asegurarse de la sonda es específica sólo para su sRNA / ARNm de interés.
  3. Al pedir la sonda de LNA, añade una modificación de biotina-TEG al extremo 5 'de los oligonucleótidos de LNA. La biotinilación es necesario para la tinción de post-hibridación con un conjugado de estreptavidina-dye. Es posible añadir esta modificación para el extremo 3 'si es necesario, pero la adición al extremo 5' es menos costosa y debería resultar en mayores rendimientos.
  4. Tres controles negativos deben ser incluidos en el método: (i) un 'no LNA "control en el que una sonda LNA no se agrega durante el paso de hibridación, (ii) un control" ningún tinte "en el que la sonda se hibrida LNA a la sRNA objetivo, pero el caso de la hibridación no se detecta debido a la ausencia de la tinción fluorescente, y el control (iii) 'ARNm no expresado sRNA /' a que utiliza una sonda de LNA que se dirige a un sRNA no existen o no expresado, con el fin de para vigilar el cumplimiento específico de la hibridación.
  5. La sonda específica LNA aquí es complementaria a la CsrB sRNA y tiene la secuencia 5'-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(monómeros LNA enletras mayúsculas).
  6. Tras la recepción de liofilizado LNA, resuspender con agua libre de nucleasa a 50 mg / ml y almacenar en el 10-20 alícuotas a -20 ° C.

Soluciones

  • 8% paraformaldehído (PFA), 10% de ácido acético en PBS: Mezclar 1 ml de 32% de PFA, 400 de ácido acético l, 400 l de 10X PBS, pH = 7,4, y 2,2 mL de agua libre de nucleasa. De alícuotas congeladas, congelar en alícuotas de un solo uso a -20 ° C sin ácido acético.
  • 60% de solución de sulfato de dextrano: añadir 6,0 g de sulfato de dextrano a un tubo de 50 ml y añadir agua hasta un volumen final de 10 ml. Llevar esta mezcla a 65 º C en un baño de agua hasta que el sulfato de dextrano se disuelve (puede tomar 1-2 horas). Agua adicional puede ser necesario añadir en todo el proceso de solubilización de mantener un volumen de 10 ml. Alícuota del 60% de solución de sulfato de dextrano y almacenar a -20 ° C hasta su uso.

2. Fijación

  1. Cosecha de 1x10 8 células de bioluminiscentes
  2. Que sedimenten las células bacterianas por centrifugación a 2300 xg durante cinco minutos. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender las células en 400 l de PBS 1X.
  3. A esta mezcla, añadir 400 l de un 8% paraformaldehído (PFA) y el 10% de ácido acético en solución salina tamponada con fosfato 1X (1X PBS), mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 25 ° C la mezcla una vez después de cinco minutos. Todas las incubaciones, a menos que se indique lo contrario, se llevan a cabo en un soporte de tubo se calienta. La solución de PFA deben estar preparados frescos o usado de alícuotas congeladas después de la adición de ácido acético. Paraformaldehído es un fijador de reticulación que hELPS para preservar la morfología celular y conservar el ARN intracelular.
  4. Que sedimenten las células de esta mezcla por centrifugación a 4500 xg durante dos minutos y retirar el sobrenadante con pipeta. Todos los pasos futuros que requieren centrifugación debe utilizar la misma configuración (7K, 2 min). Es importante señalar que después de la centrifugación los sobrenadantes se debe quitar con la pipeta y la decantación no.
  5. Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X y volver a suspender el final de pellet de células en 400 l de PBS 1X. Las células están fijas y se pueden almacenar a 4 ° C en 400 l de PBS 1X durante un máximo de siete días.

3. Dietil tratamiento pirocarbonato

  1. Prepare 400 l de una solución al 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC) en 1X PBS (400 l de esta solución es necesaria para cada muestra a analizar para la escala en consecuencia). La solución de DEPC debe estar recién a partir de un stock DEPC. Tratamiento con DEPC inactiva las RNasas por carbetoxilación y disminuye laseñal de fondo.
  2. Añadir 400 l de la solución al 0,1% DEPC a cada muestra de células bacterianas fija y mezclar bien con la pipeta. Incubar la mezcla a 25 º C durante 12 minutos. Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.

4. Permeabilización

  1. Añadir 1,0 mg de lisozima a 1 ml de Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) para un 1,0 mg / ml solución. Esta solución debe prepararse fresca. Añadir 800 l de 1 mg / ml solución de lisozima a las células, mezclar bien con la pipeta e incubar a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. La lisozima actúa como un reactivo de permeabilización por hidrólisis de la presente peptidoglicano de la pared celular bacteriana.
  2. Prepare un 3,0 mg / ml solución de proteinasa K en buffer TE. Esta solución debe prepararse fresca de un 20 acciones mg / ml de proteinasa K que se almacena a -20 ° C.Proteinasa K es una serina proteasa que digiere una variedad de proteínas y ayuda a la accesibilidad de las sondas y reactivos para el ARN.
  3. Añadir 800 l de 3,0 mg / ml de proteinasa K solución para el pellet de células, y mezclar bien con la pipeta. Se incuba a 25 ° C durante 15 minutos con agitación la mitad de la incubación.
  4. Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y se lavan las células una vez con 400 l de PBS 1X. Después de retirar el sobrenadante de lavado, resuspender las células en 400 l de PBS 1X y añadir 100 ml de la resuspensión en cuatro nuevos tubos de 1,5 mL microcentrífuga. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.

5. Hibridación

  1. La preparación de 100 l de buffer de hibridación (HB) para cada muestra. La HB se compone de 50% de formamida en volumen, 10% de sulfato de dextrano en masa (añadir 16,7 l de la solución de sulfato de dextrano 60% por cada l 100), solución 1X de Denhardt, sodio 50 mM de fosfato de pH 7,0,Citrato de sodio 2X (SSC), 20 ug de ADN de esperma de salmón cortado (SSSD) y 20 g de levadura tRNA.
  2. Cada uno de los componentes de la HB tiene un propósito diferente. Formamida baja la temperatura de fusión del ácido nucleico dúplex facilitando así la desnaturalización del ARN y minimizar el daño celular. Sulfato de dextrano se usa como un volumen, excluidos los polímeros para concentrar la investigación y aumentar la tasa de hibridación. Solución Denhardts, tRNA de levadura y SSSD servir como agentes bloqueantes para reducir la unión no específica.
  3. En cada una de las células que contienen la resuspensión 1,5 tubos de microcentrífuga ml, agregar 95 l HB y 5,0 l de la sRNA / ARNm específicos LNA [20 pmol de concentración específicos LNA final] o el agua (para el control LNA no negativo). Por ejemplo:
    1. Tubo de 1 a 95 l HB + 5.0 sRNA l / ARNm específicos de la sonda
    2. Tubo de 2 a 95 l HB + 5.0 l sRNA / ARNm específicos de la sonda (control negativo "ningún tinte")
    3. Tubo de 3 a 95 l HB + sRNA 5,0 l/ ARNm de la sonda ('no expresado sRNA / ARNm "control negativo)
    4. Tubo de 4 a 95 l HB + 5,0 l de agua (control negativo "no LNA)
  1. Incubar las cuatro muestras a 60 ° C durante 60 minutos. La temperatura de hibridación depende de la LNA sonda m (s) T y debe ser, aproximadamente, a 30 ° C por debajo de la predicción de T m para el recocido de RNA. Tanto la temperatura de hibridación elevada y formamida en el HB asegura la desnaturalización de la estructura secundaria de la sRNA o ARNm de interés.

6. Hibridación posterior a la lava

  1. Tras la hibridación, agregar 1,0 ml 0.1X SSC con el 0,1% Tween-20 (SSCT) a la mezcla de hibridación. Esto es necesario para permitir que las células se retira de la solución de hibridación viscoso. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.
  2. Añadir 200 l de formamida al 50%, 2X SSC, 0,1% de Tween-20 a los gránulos de las células, mezclar bien y incubcomió durante 30 minutos a 65 ° C en un calentador.
  3. Añadir 1 mL 0.1X SSCT a la mezcla, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.
  4. Añadir 500 SSCT 0.1X l para volver a suspender las células y se incuba durante 40 minutos a 65 ° C en un bloque de calor. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.

7. El bloqueo y la tinción

  1. Preparar el tampón de bloqueo (BB) y la solución de tinción estreptavidina-dye. Prepare una solución 1X BB de una reserva de 5 veces (disponible en el mercado, ver los reactivos). Por cada juego de cuatro tubos, preparar 1,2 mL 1X BB.
  2. Añadir 200 l 1X BB a los gránulos de las células, se resuspenden y se incuban durante 30 minutos a 25 ° C.
  3. Un tinte con estreptavidina conjugada se utiliza para detectar las sondas LNA biotina. Si bien el bloqueo, prepare una solución de 2 mg / ml DyLight estreptavidina 488 o el tinte deseado-estreptavidina conjugada en 1X BB durante 30 minutos (para tres muestras, hacer 300 L).
  4. Después de incubción con 1X BB, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de la solución de estreptavidina-colorante a la celda de pellets, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control "ningún tinte", se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente. Para el resto del protocolo, proteger los tubos de la luz con papel de aluminio.
  5. Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l de PBS 1X con 0,1% Tween-20 (PBST). Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante.
  6. Después de la inicial de estreptavidina conjugada manchas, la señal se amplifica mediante la introducción de un anti-biotina estreptavidina anticuerpo al conjugado estreptavidina-dye y manchas por segunda vez con la estreptavidina-dye lo que aumenta la salida de la señal por hibridación LNA de la sonda (Figura 2) .
  7. Añadir 100 ml de 1 mg / ml anti-biotina estreptavidina anticuerpos en PBS 1X, resuspend las células y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y lavar dos veces con 400 l 1X PBST.
  8. Añadir 50 l de los dos mg / ml de estreptavidina-dye solución a las células, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control "ningún tinte", se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente.
  9. Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l 1X PBST.
  10. Resuspender las células en 200 l 1X PBST y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para el análisis de citometría de flujo. Para los más pequeños de células bacterianas establecer la velocidad de flujo para reducir para reducir el tamaño del núcleo. Además, para los citómetros de flujo hacia adelante con cortes de dispersión límite, el límite debe establecerse lo más bajo posible para asegurar que las células bacterianas se detectan pequeñas.
  11. Para DyLight 488 de detección, el citómetro de flujo debe estar equipado con un láser de 488 nm y la norma de emisionesfiltros para FITC. Por lo menos 2x10 4 eventos se deben recoger. Por razones de compatibilidad con citómetros de flujo equipados con láseres diferentes, otros estreptavidina conjugada con fluoróforos se pueden utilizar para este protocolo.

8. Los resultados representativos

Un ejemplo de las células que son fijos y permeabilized efectivamente se muestra en el diagrama de flujo de citometría de punto en la Figura 3. Al utilizar las condiciones descritas anteriormente para la permeabilización de la población celular es pequeño y homogéneo que indica algunos agregados de células. Cuando más alto (5 mg / ml), las concentraciones de lisozima se utilizan, las células son más propensas a agregar y mostrar un aumento de los valores de dispersión hacia adelante, indicativo de las partículas más grandes (Figura 3B). Un ejemplo de los datos de citometría de flujo de una exitosa LNA flujo PESCADO experimento se muestra en la Figura 4. El histograma muestra la detección específica de un sRNA objetivo, junto con tres controles negativos.El control negativo "ningún tinte" produce la menor fluorescencia, seguido por el 'no LNA "y" no expresado sRNA "controles negativos. Finalmente, la muestra con la sonda específica de sRNA LNA produce la mayor fluorescencia. Una vez que el método y las sondas LNA son validados de esta manera, experimentos adicionales pueden ser diseñados para monitorear los cambios en la señal de sRNA lo largo del tiempo, en respuesta a las mutaciones o diversas condiciones culturales, etc

Figura 1.
Figura 1. Representación de la estructura general de un LNA de flujo PESCADO experimento para la detección de sRNA bacteriana.

Figura 2.
Figura 2. Tinción y amplificación de la LNA flujo PESCADO señal. a) La hibridación de la sonda biotinilada LNA. b) La tinción fluorescente con la DyLight 488 conjugado de estreptavidina. c) La unión de la biotina anti-streptavidin anticuerpos contra la estreptavidina DyLight 488. El anticuerpo puede unirse estreptavidina través de su sitio de unión al antígeno o puede estar sujeto a través de sus residuos estreptavidina biotina. d) La amplificación de la señal mediante la tinción fluorescente con la más DyLight 488 conjugado de estreptavidina.

Figura 3.
Figura 3. Flow que muestra gráficos de puntos de citometría de avance frente a los resultados de una dispersión lateral) 1 mg / ml de lisozima, g 3 / ml de proteinasa K permeabilización y b) 5 mg / ml de lisozima, 3 mg / ml de proteinasa K permeabilización.

Figura 4.
Figura 4. Histograma análisis de la LNA PESCADO flujo de los resultados. La señal fluorescente generada a partir de cada muestra se muestra en las cuatro trazas: negro - sRNA específicos LNA sonda, rojo - control negativo "no expresa sRNA; azul - control negativo" no LNA; púrpura -Control negativo "ningún tinte.

Discussion

El LNA flujo PESCADO método que aquí se presenta se utilizó para detectar la expresión de un sRNA de los Gram-negativos marinos bacteria Vibrio campbellii cuya expresión ha sido previamente confirmado a través de perfiles de expresión de microarrays basados ​​en la polimerasa con transcripción inversa y reacción en cadena de 16. Hasta la fecha, hemos utilizado este método para controlar la expresión de una variedad de ARN (por ejemplo, trans-codificados sRNA, sRNA que modulan la actividad de la proteína, riboswitches y ARNm). Como tal, estamos seguros de que el método es adaptable y puede ser utilizado para detectar cualquier objetivo o sRNA ARNm y pueden ser modificados para su uso en cualquier especie o tipo de célula bacteriana. Si la modificación de este protocolo es necesario para otros tipos de células, la variable más importante a considerar es la manipulación de la etapa de permeabilización. Por ejemplo, al modificar las condiciones de permeabilización se describe aquí, los cambios en las concentraciones de lisozima y proteinasa K debe ser probado. Hemos encontrado que la duplicación otriplicar la cantidad de lisozima y proteinasa K dio lugar a cambios importantes en la LNA PESCADO flujo de los resultados. Además, cuando las pruebas condiciones adicionales permeabilización, las células deben ser analizados por aglutinación, la pérdida de células, y obtener la mejor señal al cociente de la fluorescencia de fondo. El grado de aglutinación celular puede ser probada por microscopía y / o citometría de flujo. Por citometría de flujo, grupos de células están presentes en las colas en un avance frente a dispersión lateral gráfico de puntos y el método de permeabilización correcto minimizar este efecto de relaves. Este método también es susceptible de detección múltiple sRNA sin grandes modificaciones en el protocolo descrito como sondas LNA adicionales etiquetados con otros haptenos como digoxigenina podrían añadirse durante la etapa de hibridación y detecta con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado y secundaria de anticuerpos fluoróforo. En la actualidad, la única limitación que nos hemos encontrado con este método es su incapacidad para generar suficiente señal débil de expresionado especies sRNA y se están realizando esfuerzos para determinar el umbral de detección (en número de copias por célula absoluta).

En general, el flujo de LNA-PESCADO método ofrece la oportunidad de medir sRNA bacteriana o la expresión del ARNm de la célula única a nivel de un alto rendimiento para proporcionar información sobre la presencia y abundancia relativa de especies sRNA y el grado en que su expresión varía en una población.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigación Naval Naval de los EE.UU. a través de los fondos básicos del Laboratorio de Investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Applied Biosystems AM9625
Nuclease-free water Applied Biosystems AM9932 (not DEPC treated)
32% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15714 Ethanol free
Acetic acid Acros Organics 327290010
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 Keep desiccated
Lysozyme Sigma-Aldrich L2879
Proteinase K (20 mg/mL) Applied Biosystems AM2546
Formamide Applied Biosystems AM9342 Deionized, aliquot and freeze
Dextran sulfate MW > 500,000 Sigma-Aldrich D8906 Aliquot 60% solution and freeze
Denhardt’s solution 50X concentrate Sigma-Aldrich D2532 Aliquot and freeze
Sodium citrate buffer 20X Applied Biosystems AM9770
Salmon sperm DNA (sheared) 10 mg/mL Applied Biosystems AM9680 Aliquot and freeze
Yeast tRNA (10 mg/mL) Life Technologies 15401-011 Aliquot and freeze
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
5X in situ hybridization blocking solution Vector Laboratories MB-1220
DyLight 488 streptavidin Vector Laboratories SA-5488-1
Biotinylated anti-streptavidin Vector Laboratories BA-0500 Aliquot and freeze

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