Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מבחני כדאיות התא ביטוי הקרינה באמצעות Cytometer תמונה מבוסס טלי.
Abstract
תא בודד ומידע האוכלוסייה מתקבלים בדרך כלל או על ידי זרימת cytometry או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אלה שתי שיטות לספק מידע שונים. Cytometry זרימה נותן מידע כמותי רב פרמטרית על מאפיינים פיזיים מכתים או ביטוי, אבל אינו מאפשר ראיה. עצמאיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספקת נתונים חזותיים, אך אינו מאפשר מדידה כמותית פשוטה 1.
תמונה מבוססי cytometry מגשר על הפער בין שתי השיטות, המאפשר הדמיה מהירה ניתוח כמותי סימולטני של אלפי תאים אוכלוסיות הטרוגניות 2. כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע כדאיות התא ירוק ניאון (GFP) חלבון מבחני ביטוי באמצעות Cytometer טלי מבוסס תמונה 3. המכשיר טלי היא פלטפורמה 3 ערוצים (שדה בהיר, ירוק פלואורסצנטי, אדום פלואורסצנטי) benchtop assay כי offers מספר יתרונות על פני cytometry זרימת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Cytometer טלי פחות יקר, תופס ספסל פחות, דורש פחות תחזוקה, ואת זרימת העבודה הופשטה, כך פעולת ניתוח הרבה יותר פשוט ומהיר. Cytometer טלי הוא מסוגל לבצע מגוון של תא המבוססת על מבחני ההשעיה, כולל ה-GFP ואדום ביטוי ניאון (RFP) חלבון, אפופטוזיס 4-6 ו כדאיות התא ניתוח עם יודיד propidium (PI) 11/07.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש במכשיר טלי בביצוע כדאיות התא assay בתאים לבטא GFP. GFP-transduced התאים הם מוכתמים באמצעות ערכת ליכולת הקיום טלי - Red Cell המלח. התאים pipetted מכן לתוך שקופיות ניתוח טלי נייד וטעון cytometer. השדה מואר, אדום פלואורסצנטי ותמונות פלואורסצנטי ירוק נלכדים ונותחו באמצעות אלגוריתמים assay ספציפיים. Histograms נוצרות אז לתצוגה גודל התא, PI fluoעוצמת rescence, ועוצמת הקרינה ה-GFP. פרמטרים אלה לאחר מכן ניתן thresholded להתביית על אוכלוסיית תאים מסוים.
תופעות לוואי על ידי השוואה של Cytometer טלי תמונה מבוססי זרימת cytometry המסורתית מוכיח כי שתי השיטות מספקים נתונים השוואתיים לגבי הכדאיות התא ביטוי חלבון. עם זאת, מכשיר טלי מספק מידע חזותי נוסף על אוכלוסיית תאים שלא ניתן להשיג באמצעות cytometer לזרום.
Protocol
1. תאים עם ערכת מכתים את הכדאיות טלי - מגיב Cell המלח האדום
- בגין הליך זה עם תאים U2OS (גביה סוג התרבות האמריקנית), כי כבר transduced באמצעות CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2.0 *. (הערה: תאים יכול להיות גם הסתחרר למטה resuspended בינוני או PBS).
- כדי להכתים תאים מתים עם PI, העברת 100 μL של התאים לצינור microcentrifuge חדש. שים לב, ריכוז של 10 מ"ל 1 x 5-1 / x 10 7 תאים מומלץ assay הזה, אם כי הריכוז אינו חייב להיות מדויק.
- בשלב הבא, כדי להכתים את התאים המתים, להוסיף 1 μL של מגיב טלי לצרכן המבוסס על תא המלח האדום. בקצרה וורטקס לערבב. דגירה האדום המלח טלי תא מגיב תערובת תא בטמפרטורת החדר בחושך במשך 1-5 דקות.
- לאחר דגירה, מיד להמשיך ניתוח המדגם על Cytometer טלי Image-Based.
2. ביצוע כדאיות התא Assay שימושטלי תמונה מבוסס Cytometer
- Cytometer טלי משתמשת פלסטיק חד פעמיות טלי נייד ניתוח שקופיות ספציפית להשתלב cytometer והוא יכול להחזיק שתי דגימות 25μL בתאי סגורים נפרדים (A ו-B). כאשר הטיפול שקופיות, הקפד תמיד להחזיק אותו על ידי הצדדים.
- כדי לטעון את השקופית, μL 25 פיפטה מדגם לאט לתוך שטח ההעמסה חצי ירח בצורת המדגם, לטפל כדי למנוע יצירת בועות או להתיז בחזרה. אל מעל או מתחת למלא.
- הנה, תאים מלאה (בלא כתם, לא transduced) נטענים בתא ואת מוכתם GFP-להביע תאים נטענים בתא B. מדגם השליטה יסייעו לקבוע את רמת autofluorescence כאשר מנתחים את הנתונים.
- כדי לבצע assay הכדאיות, מגע GFP / RFP במסך הבית של cytometer. האפשרויות assay יופיע בצד ימין. בחר ליכולת הקיום GFP +.
- בשלב הבא, על שם סדרת המדגם, הקש שם עכשיו שמור. (הערה: שם בחר מאוחר יותר באופן אוטומטי להקצות שם לכל סדרה מדגם לפי תאריך ושעה).
- אחרי שיום המדגם, cytometer טלי באופן אוטומטי מראש מסך המדד. לחצו על הלשונית רקע בחצי התחתון הימני של המסך מדוד.
- בשלב הבא, עם מדגם הביקורת (א ') מול הרחק cytometer, הכנס את השקופית בנמל הטעינה עד שייעצר. אין להפעיל כוח.
- במסך רקע, לגעת הקש הוספת תא חדש בקרת בלא כתם. השקופית באופן אוטומטי נכנס cytometer ואת תמונת חיים של תאים יוצג על המסך.
- באמצעות הידית להתמקד, להביא את התאים לתוך המטוס תקין של השקפה. התאים צריך להיות אחיד כהה עם הילה בהירה סביב כל תא (איור 1, שמאל).
- תאזה עשוי להיות undercounted כאשר המעבר בין הרקע ואת הקצוות של התאים מעורפלת, כך גבולות התא אינם מוגדרים היטב (איור 1, מרכז). תאים עשויים להיות overcounted כאשר יש להם מרכזי בהיר היקפה כהה (איור 1, ימין).
- כדי להציג טוב יותר את האוכלוסייה התא תוך התמקדות, להחליק על הכפתור האדום אינדיקטור זום 4X או 16X.
- לאחר שהתאים הובאו אל המוקד, מגע לחצו על הפעל בקרה Cell בלא כתם על מנת למדוד את הקרינה רקע.
- Cytometer באופן אוטומטי ללכוד ולנתח את התמונות של המדגם. זה לוקח בערך 1 דקה כדי ללכוד ולנתח את התמונות ברירת המחדל (9 תמונות) במצב.
- תמונות ממוזערות של כל שדה הראייה מוצגים כפי שהם כבשו את סרגל התקדמות מספקת עדכון שוטף. לאחר לכידת תמונה תושלם, cytometer באופן אוטומטי פולט את השקופית ומספקת את הנתונים מתוך ניתוח של תמונות שנתפסו.
- הנתונים מאוחסנים יוצג התפריט הנפתח של הכרטיסייה רקע cytometer. המדגם לשלוט רקע יוקצה אותו שם כמו זה שניתן הניסוי יהיה מיובא התפריט הנפתח. הערה: אם שליטה רקע לא לרוץ, cytometer מקצה אוטומטית סף הקרינה. ניתן לשנות זאת באופן ידני לאחר ביצוע assay.
- כדי להפעיל את מדגם PI מוכתם transduced, להסיר את השקופית מ cytometer, הופכים אותו סביב והכנס את זה עם מדגם transduced מול הרחק המכשיר.
- לחצו על לשונית לדוגמה ולאחר מכן לחץ על הוספת מגע מדגם חדש. כאשר התמונה מופיעה על המסך, השתמש ידית התאמת תמונה להביא את התאים לתוך להתמקד כמו קודם. ואז לגעת לחץ כדי הפעלה לדוגמא.
- לאחר לכידת תמונה תושלם, הנתונים מניתוח מופיע תחת הלשונית מדגם האוטומטי cytometerברית פולט את השקופית.
- כמתבקש להיפטר החלק את טלי ניתוח נייד כמו פסולת ביולוגית מסוכנת. טלי שקופיות נייד ניתוח לא ניתן לעשות שימוש חוזר.
3. סף קביעת גייטס
- לאחר המדגם יש להפעיל, ספי כעת ניתן להחיל המדגם להתביית על אוכלוסיית תאים מסוים. הנה, נוכל להתאים את הספים כדי לקבוע את אחוז תאים חיים ומתים ב-GFP transduced תאים.
- בכרטיסייה לדוגמה, מספר ואחוז התאים לבטא את ה-GFP, תאים חיים ומתים להביע GFP, הכדאיות הכוללת, גודל התא הממוצע, מספר התאים ספרתי, וריכוז תא מוצגים.
- בנוסף, המגרשים היסטוגרמה להצגת גודל התא, פלואורסצנטי ירוק, אדום פלואורסצנטי (PI) מוצגים בתחתית המסך.
- כדי להגדיר את השער גודל התא, מגע התמונות גודל התא כדי לפתוח את ההיסטוגרמה גודל התא. בעוד תאים בתרבית רק לעתים נדירות יש דebris, מדגמים אחרים עשויים להכיל פסולת כי הוא גדול יותר או קטן יותר מאשר בתאים.
- כדי לא לכלול את ההריסות, להחליק את הכפתורים כחול בסרגל המחוון כדי לכלול אירועים גדולים וקטנים כאחד. לאחר מכן, החל לגעת מחדש לנתח את הנתונים ולעדכן את התוצאות.
- לאחר מכן, להוסיף את הקרינה GFP לניתוח, מגע התמונות היסטוגרמה GFP כדי לפתוח אותו. החלק את הפס הכחול כדי לקבוע את הסף רק בצד ימין של השיא הקלוש ביותר, באמצעות מדגם מלאה כמדריך.
- זה מאפשר ניתוח כדי לכלול את התאים GFP חיובי, אבל להוציא תאים autofluorescent. Autofluorescence הוא ציין לעתים קרובות כאשר מולקולות ביולוגיות בתוך התאים נרגשים.
- מגע החל לאשר ולחזור למסך הקודם. הנתונים המוצגים תחת הלשונית לדוגמא עכשיו צריך לשקף את השערים ספי להגדיר עבור שני ערוצי פלואורסצנטי.
- בשלב הבא, כדי להפריד את התאים מוכתם PI מ autofluorescence, לחץ לאהוא התמונות לצרכן היסטוגרמה כדי לפתוח את ההיסטוגרמה לצרכן.
- שוב, שיא המדגם לשלוט יוצג שיא אפור על ההיסטוגרמה. השיא הוא אדום פלואורסצנטי המדגם. פלואורסצנציה הרקע מוצג לשיא הקרוב ביותר לערך RFU 0 cytometer על זה.
- כדי למנוע את הקרינה רקע בערוץ PI, להזיז את הכפתור הכחול בסרגל במחוון כדי לכוונן את הסף להוציא את השיא המייצגות הקרינה רקע, באמצעות שיא אפור ממדגם הביקורת כנקודת התייחסות. מגע החל לאשר ולחזור למסך הקודם.
- בשלב הבא, כדי לוודא ויזואלית לכל תא מוקצה כראוי, בחר שדה כבש מבט לבדיקה על ידי לחיצה על התמונה הממוזערת בכרטיסיה זום, ואז לחיצה על הכרטיסייה 'שכבות'.
- לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-GFP או PI, כדי להציג את התמונה שצולמה באמצעות ערוץ מסוים. לחצו על הלחצן שוב כדי להסיר את שכבת מהתצוגה, או, כדי להניח שכבות, לגעת כפתור Layer מרובים.
- כדי לזהות את האופן שבו נספרים תאים באמצעות ערוץ מסוים, מעגלי מגע. תאים נספרו רק דרך ערוץ בהיר השדה, אשר אינם מבטאים הקרינה יהיה בעיגול כחול. זה מצביע על כך כי תא מסוים הוא חי (כלומר לצרכן שלילי).
- תאים GFP להביע יראו בערוץ ה-GFP, יהיה בעיגול ירוק. תאים מתים מוכתם אדום Cell המלח יהיה לראות בערוץ לצרכן, ויהיה מוקף בעיגול אדום.
- תאים ספרתי בערוץ הן אדום וירוק יהיה בעיגול צהוב, זה מצביע על כך התא מבטא GFP, אבל היא גם צבעונית עם לצרכן ולכן הוא מת.
- מדי פעם, עיגולים שחורים יופיע על המסך, אלה הם אובייקטים אשר זוהו, אך הורחקו מן הניתוח מבוסס על גודל התא.
- המשך fiנה לכוון את סף הקרינה על ההיסטוגרמה באמצעות השלבים שתוארו עד עתה כל תא מבטא הקרינה הוא הקיף עם הצבע המתאים.
- כל הפרמטרים ניתוח נשמרים באופן אוטומטי תחת לשונית הנתונים. Cytometer טלי יכול לאחסן קובצי נתונים מכ 500 פועל מדגם.
- כל קובץ מאוחסן בכרטיסיה נתונים זמין עבור reanalysis. על ידי בחירה את הקובץ בכרטיסיה נתונים זה יהיה פתח וכל היסטוגרמות שכבות להיות פעיל.
- נתוני ארכיון ולהפיק דוחות, הנתונים מאוחסנים cytometer ניתן להעביר למחשב באמצעות כונן USB.
4. נציג תוצאות:
תמונה מבוסס טלי Cytometer שימש כדי למדוד את רמת חלבון פלואורסצנטי ביטוי בתאים שהיו transduced עם מבנה הגרעין במיקוד GFP הביטוי 2.0 BacMam. ארבעה סוגי תאים נציג היו transduced (U2OS, 293MSR, HEKn, CHO ו-S).עבור אלה שורות תאים, מספר תאים הביעו GFP נמסר על ידי cytometer טלי לעומת נתוני דגימות אותו מנותח על cytometer זרימה. בנוסף, התאים היו מוכתמות מגיב התא האדום המלח באמצעות ערכת ליכולת הקיום טלי לזהות את אוכלוסיית התאים המתים הן על cytometer טלי על cytometer זרימה.
ייצוגים גראפיים באיור 2 להראות את אחוז מכלל האוכלוסייה לכל סוג תא הביעו GFP. נתונים אלה מראים כי cytometer טלי מייצרת נתונים להשוות נתונים שנוצרו על ידי cytometer זרימה.
באיור 1. תאים צריך להיות ממוקד כראוי לפני הניתוח. שקופיות טלי ניתוח נייד עם ריכוזים תא מתאים לניתוח (1 x 05-01 אוקטובר 7 x 10 תאים מומלץ). (משמאל) ב-להתמקד התאים ד אחידארון ברחבי התא, עם הילה בהירה סביב כל תאים סלולריים. (במרכז) ניתן undercounted כאשר המעבר בין הרקע את הקצוות של התאים מטושטשת ותאי יש גבולות מוגדרים (מימין) תאים אולי overcounted כאשר יש להם בהיר מרכזים היקפה כהה.
באיור 2. פלורסנט ביטוי חלבון נתונים Cytometer טלי מבוסס תמונה דומה לזו שהושג באמצעות cytometry הזרימה. השוואה Side-by-הצד של ה-GFP ביטוי בתוצאות מחושב 4 שורות תאים שונות בתאים קיימא.
Discussion
יש לנו נוהל מפורט רק עבור ביצוע ספירות כדאיות והערכת הביטוי GFP באמצעות תמונה מבוסס טלי Cytometer. שימוש באותו הליך, cytometer זה הוא מסוגל לבצע מספר מבחני אחרות, לרבות: אפופטוזיס, RFP ותא ניתוח כדאיות השימוש הלא transduced תאים.
מבחני Fluorometric של כדאיות התא, ביטוי גנים אפופטוזיס הפכו מתודולוגיות מפתח במחקר ביו 7-12. ב המכשור, בעבר נפרדים נעשה שימוש כדי לקבל מידע כמותי על תאים חזותי. בעוד שמידע כמותי על תאים בתוך אוכלוסיה הטרוגנית כבר צבר באמצעות cytometry זרימה, מידע חזותי או איכותי נאסף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 1-4. כאן, אנו מציגים טכנולוגיה אשר מגשר על הפער בין האוכלוסייה לימודי תא יחיד. שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי, כמותי data ונתונים תא חזותי על תאים בודדים או אוכלוסיות תאים ניתן לאסוף בעת ובעונה אחת. המכשיר טלי יכול לשמש עבור מגוון של יישומים, כולל הערכה של ביטוי גנים, מבחני אפופטוזיס, מחקרים על יעילות התרופה, והערכה של התקדמות המחלה.
תמונה מבוסס טלי לוכדת Cytometer ומנתח בהיר שדה, פלואורסצנטי אדום ותמונות פלואורסצנטי ירוק, המאפשר מידע על subpopulations של תאים שיופק. לדוגמה, assay הזה, היינו יכולים להבחין בין תאים מתים מן התאים לחיות בתוך האוכלוסייה-GFP להביע התא באמצעות המלח צבען האדום Cell. זה נותן דיוק במדידה של תאים קיימא להביע GFP, ומזהה את אוכלוסיית התאים שמיש עבור עיבוד במורד הזרם. חשוב לציין כי התאים המתים באוכלוסייה יכולה לנבוע ממקורות שונים, כולל מוות של תאים נורמליים בתרבות או מוות של תאים הנגרם על ידי תנאים סביבתיים (למשל, trypsinization או דהATH המושרה על ידי שיטה transfection / התמרה הנבחר).
כאן אנו מדגימים את השימוש cytometer טלי עם תאים U2OS. בשיטות דומות ניתן לבצע באמצעות בתאי יונקים ביותר חרקים. עבור כל קו התא, מיוצר cytometer טלי ביטוי כמותי GFP נתונים, דבר שאינו אפשרי עם בדיקה ויזואלית של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. למרות התוצאות הללו דומים cytometry זרימה, הם נאספים בשבריר של זמן. Cytometer מסוגל לספור במדויק את התאים בין 5 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר קוטר, רצוי בריכוז של 1 x 05-01 אוקטובר 7 x 10 תאים / מ"ל.
חשוב לציין כי מכתים פרוטוקולים סטנדרטיים ביותר, לרבות פרוטוקול מכתים המלח Red Cell המתואר כאן, להשתמש יודיד propidium להבחין בין תאים חיים ומתים. זה מציב אתגר כאשר להערכת הכדאיות בתאים שהיו permeabilized עבור רחובaining של סמנים תאיים, שכן לצרכן יהיה כתם לכל תא עם קרום בסכנה. מאז כל צבע חלבון פלואורסצנטי או כי ניתן לאתר את ערוצי פלואורסצנטי ירוק או אדום ניתן לנתח על Cytometer טלי מבוסס תמונה, מחקרים עתידיים עשויים לבדוק את השימוש של צבעים חלופית, כגון צבעי אמין הכדאיות תגובתי 4. מחקר שנעשה בשנת 2006 על ידי Perfetto et al. 12 נמצא צבעים אלה כדי להיות קלה לשימוש לשעתקו להפלות אוכלוסיות תאים חיים ומתים.
שים לב טלי יש מגבלות לגבי סוגי מבחני זה יכול לבצע. לדוגמה, מאז המטרה בשימוש על ידי המכשיר היא 4X, מבצעים ספירה מוגבלים סוגי תאים גדולים: המשנה הסלולר מבנים כגון המיטוכונדריה או שלפוחית, וכן תאים חיידקיים לא ניתן לכמת. כמו כן שים לב הערוצים גילוי טלי מוגבלים fluorophores שילהיב פולטים בתוך הערוצים. בעוד YFP ובהיר mCherry אותות גלהתגלות, דימר אותות mCherry לא יכול. לבסוף, טלי רק מנתח את התאים בתרחיף. זה לא מדויק לספור תאים דבקות לשקופית. יתר על כן, בעוד שיש רק יכולת מוגבלת לספור תאים מעוצבים באופן בלתי סדיר, כולל שמרים מסוימים תאים ראשוניים.
בנוסף, מחקרים בעתיד צפויה כתובת השימוש במערכת זו בהערכת ביטוי של סמנים תאיים. צבעים בודדים ניתן לבדוק עבור חפיפה ספקטרלית עם ערוצים סמוכים, באמצעות כלי SpectraViewer המקוונת של Invitrogen ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). לאור החידוש בטכנולוגיה זו, מגוון רחב של יישומים טרם גילו.
לסיכום, Cytometer תמונה מבוסס טלי הפגינו כאן מציגה טכנולוגיה חדשה המאפשרת הדמיית ניתוח סימולטני של אוכלוסיות תאים, המאפשרת הערכה של תאים בודדים, כמו גם celאני אוכלוסיות בפורמט קומפקטי עם זרימת עבודה פשוטה.
Disclosures
Krissy Remple ולורל סטון עובדים של החיים טכנולוגיות שהפיק את המכשיר משמש במאמר זה. החיים טכנולוגיות מימנה את הייצור של מאמר-video זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell'Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
