Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Summary

Este protocolo descreve como executar a viabilidade celular e ensaios de fluorescência usando a expressão Tali Citómetro Image-Based.

Abstract

De uma única célula e informações da população são comumente obtido por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. No entanto, estes dois métodos fornecem informações diferentes. Citometria de fluxo fornece informações multi-paramétricas quantitativas sobre características físicas e coloração ou expressão, mas não permite a visualização. Stand-alone microscopia de fluorescência fornece dados visual, mas não permite simples medições quantitativas ^1.

Com base em imagens de citometria faz a ponte entre estes dois métodos, permitindo a visualização rápida e análise quantitativa simultânea de milhares de células em populações heterogêneas ^2. Aqui, apresentamos um método para a realização de viabilidade celular e ensaios proteína fluorescente verde (GFP) usando a expressão Citómetro Tali Baseado na Imagem ^3. O instrumento Tali é um 3-channel (campo claro, fluorescência verde, fluorescência vermelha), plataforma de ensaio de bancada que Offers várias vantagens sobre citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. O citômetro de Tali é menos caro, ocupa menos espaço em banco, requer menos manutenção, e o fluxo de trabalho foi simplificado para que a operação e análise é muito mais simples e mais rápido. O citômetro de Tali é capaz de realizar uma série de suspensão de células baseado em ensaios, incluindo GFP e vermelho proteína fluorescente expressão (RFP), apoptose ^4-6 e análise de viabilidade celular com iodeto de propídio (PI) ^11/07.

Aqui, nós demonstrar o uso do instrumento Tali na realização de um ensaio de viabilidade celular em células expressando GFP. GFP-transduzidas células são coradas utilizando o Kit de Viabilidade Tali - Red Dead Cell. As células são então pipetado em um slide Análise Tali Celular e carregado no citômetro. De campo claro, fluorescência vermelha e verde imagens de fluorescência são capturados e analisados ​​utilizando algoritmos de ensaio específico. Histogramas são então gerados para mostrar o tamanho da célula, PI fluointensidade de fluorescência, e intensidade de fluorescência da GFP. Estes parâmetros podem ser thresholded em casa, em uma população de células específicas.

A comparação lado a lado do Citómetro Tali Image-Based e citometria de fluxo tradicional demonstra que os dois métodos fornecem dados comparáveis ​​relativos à viabilidade celular e expressão da proteína. No entanto, o instrumento Tali fornece informações visuais adicionais sobre a população de células que não podem ser obtidos através de um citômetro de fluxo.

Protocol

1. Células coradas com o Kit de Viabilidade Tali - Reagente Celular Red Dead

1. Iniciar este procedimento com células U2OS (Coleção American Type Culture) que foram transduzidas usando CellLight Núcleo-GFP * BacMam 2,0 *. (Nota: As células podem também ser girado para baixo e ressuspenso em médio ou PBS).
2. Para manchar as células mortas com a PI, a transferência de 100 L das células para um tubo de microcentrífuga novo. Note-se que uma concentração de 1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ células / ml é recomendado para este ensaio, embora a concentração não tem que ser exato.
3. Em seguida, a manchar as células mortas, adicionar 1 mL do reagente de PI baseada celular Tali Red Dead. Vortex brevemente para misturar. Incubar a Tali reagente Red Dead Cell e mistura de células em temperatura ambiente no escuro por 1-5 minutos.
4. Após a incubação, imediatamente proceder à análise da amostra no citómetro Tali Image-Based.

2. Realizar um ensaio de viabilidade celular Usando umTali Citómetro Baseado na Imagem

1. O citômetro de Tali usa o plástico descartável Tali Slides Análise Cellular que especificamente se encaixam no citômetro e pode armazenar duas amostras 25μL em separado câmaras fechadas (A e B). Ao manusear o slide, não se esqueça de sempre mantê-la pelos lados.
2. Para carregar o slide, pipetar 25 mL da amostra lentamente na metade da área de carga em forma de lua amostra, tomando cuidado para evitar bolhas se formando ou para trás splatter. Não sobre ou sob a preencher.
3. Aqui, as células controle (sem manchas, não transduzidas) são carregados na câmara A ea GFP manchada células que expressam são carregados na câmara B. A amostra de controlo vai ajudar a determinar o nível de autofluorescência ao analisar os dados.
4. Para realizar um ensaio de viabilidade, toque GFP / RFP na tela inicial do citômetro. As opções de ensaio aparecerá à direita. Selecione GFP Viabilidade +.
5. Em seguida, para o nome da série de amostras, pressione Nome Agora Salvar. (Nota: Selecionar Nome Mais tarde, para atribuir automaticamente um nome para cada série de amostras por data e hora).
6. Depois de nomear a amostra, o citômetro de Tali avançará automaticamente para a tela Medida. Pressione a guia Plano de fundo na metade inferior direita da tela Medida.
7. Em seguida, com a amostra controle (A) de costas para o citómetro, inserir o slide no porto de carregamento até que ele pare. Não aplique força.
8. Na tela de fundo, toque Prima para Inserir controlo celular New corado. O slide irá automaticamente ser puxado para o citómetro e uma imagem ao vivo das células será exibido na tela.
9. Usando o botão de foco, trazer as células para o plano adequado de vista. As células devem ser uniformemente escuro, com um halo brilhante em torno de cada célula (Figura 1, esquerda).
10. Células pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células é difuso, de modo que os limites da célula não são bem definidos (Figura 1, Centro). Células podem ser overcounted quando eles têm centros de brilhante e perímetros escuro (Figura 1, direita).
11. Para melhor visualizar a população de células enquanto se concentra, deslize o botão indicador vermelho Zoom de 4X ou 16X.
12. Quando as células foram trazidos para o foco, toque Prima para Run controlo celular não corado para medir a fluorescência de fundo.
13. O citômetro automaticamente capturar e analisar as imagens da amostra. Demora cerca de um minuto para capturar e analisar as imagens no padrão (9 imagem) mode.
14. Miniaturas de cada campo de visão são exibidos como eles são capturados ea barra de progresso fornece uma atualização em andamento. Após a captura de imagem estiver concluído, o citômetro de ejecta automaticamente o slide e fornece os dados a partir da análise das imagens capturadas.
15. Os dados armazenados serão exibidos no menu drop-down da guia de fundo no citômetro. A amostra controle de fundo será atribuído o mesmo nome que deu à experiência e será importado no menu suspenso. Nota: Se um controle de fundo não é executado, o citômetro atribui automaticamente um limiar de fluorescência. Isto pode ser alterado manualmente após a realização do ensaio.
16. Para executar o exemplo PI-transduzidas manchada, remova a lâmina do citômetro, lançá-lo ao redor e reinseri-lo com a amostra transduzidas de costas para o instrumento.
17. Pressione a aba da amostra, e em seguida, toque Prima para Inserir nova amostra. Quando a imagem aparece na tela, use o botão de ajuste de imagem para trazer as células em foco como antes. Em seguida, toque de Imprensa to Run Sample.
18. Após a captura da imagem estiver concluído, os dados da análise aparece sob a guia da amostra eo automática citómetroaliado ejeta o slide.
19. Adequadamente dispor do slide Análise Tali Cellular como resíduos perigosos. Slides Análise Tali celulares não podem ser reutilizados.

3. Limiares configuração e Gates

1. Uma vez que a amostra foi executado, os limiares podem ser aplicados à amostra em casa, em uma população de células específicas. Aqui, vamos ajustar os limiares para determinar a porcentagem de células vivas e mortas no GFP-transduzidas células.
2. Sob a guia de amostra, o número ea porcentagem de células expressando GFP, as células vivas e mortas expressando GFP, viabilidade total, tamanho da célula média, número de células contadas, e concentração de células são exibidos.
3. Além disso, histograma mostrando o tamanho da célula, a fluorescência verde e fluorescência vermelha (PI) são exibidas na parte inferior da tela.
4. Para definir o tamanho da célula portão, toque na miniatura Tamanho da Célula para abrir o histograma do tamanho das células. Enquanto as células cultivadas raramente têm debris, outras amostras podem conter restos que é maior ou menor do que as células.
5. Para excluir os entulhos, deslize os botões azuis na barra de deslocamento para excluir eventos grandes e pequenos. Em seguida, toque em Aplicar para re-analisar os dados e atualizar os resultados.
6. Em seguida, adicionar a fluorescência da GFP para a análise, toque na miniatura histograma GFP para abri-lo. Deslize a barra azul para definir o limite à direita do pico mais escuras, usando a amostra de controlo como um guia.
7. Isso permite que a análise para incluir as células GFP positivas, mas excluem as células autofluorescent. Autofluorescência é freqüentemente observada quando as moléculas dentro das células biológicas são animado.
8. Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior. Os dados exibidos na guia Sample agora deve refletir as portas e limiares definidos para ambos os canais de fluorescência.
9. Em seguida, para separar as células manchadas de autofluorescência PI, pressione tele PI histograma de miniaturas para abrir o histograma PI.
10. Mais uma vez, o pico de amostra de controlo será exibido como um pico de cinza no histograma. O pico de fluorescência vermelha é a amostra. A fluorescência de fundo é exibida como um pico mais próximo do valor RFU 0 nesta citômetro.
11. Para eliminar a fluorescência de fundo no canal PI, mova o botão azul na barra de controle deslizante para ajustar o limite de excluir o pico representando fluorescência de fundo, utilizando o pico de cinza a partir da amostra de controlo como uma referência. Toque em Aplicar para confirmar e voltar à tela anterior.
12. Em seguida, para confirmar visualmente que cada célula é corretamente atribuída, selecione um campo de vista capturados para revisão, pressionando a miniatura da imagem no separador Zoom, em seguida, pressionando a aba Layers.
13. Em seguida, pressione o botão ou GFP PI, para exibir a imagem capturada através desse canal em particular. Pressione o mesmo botão novamente para remover a camada da tela, ou, para sobrepor camadas, toque no botão de múltiplas camadas.
14. Para identificar como as células são contadas através de um canal particular, Círculos toque. As células que foram contados por meio apenas o canal brilhante-campo, que não expressam de fluorescência serão circuladas em azul. Isso indica que essa célula em particular é ao vivo (ou seja, PI negativo).
15. Células GFP expressando será visto no canal de GFP, e será circulada em verde. Células mortas coradas com Red Dead Cell será visto no canal de PI, e será circulada em vermelho.
16. Células contadas em ambos os canais do vermelho e verde serão circulados em amarelo, isso indica que a célula expressa GFP, mas também é corado com PI e, portanto, está morto.
17. Ocasionalmente, círculos pretos aparecerá na tela, estes são objetos que foram identificados, mas foram excluídos da análise com base no tamanho da célula.
18. Continuar a fine ajustar o limite no histograma de fluorescência usando as etapas acima descritas, até que cada célula que está expressando fluorescência é circulado com a cor apropriada.
19. Todos os parâmetros de análise são salvos automaticamente na guia dados. O citômetro de Tali pode armazenar arquivos de dados de aproximadamente 500 corre amostra.
20. Cada arquivo armazenado na guia de dados está disponível para reanálise. Ao selecionar o arquivo a partir do separador de dados será aberta e todos os histogramas e camadas tornam-se ativos.
21. Para arquivar dados e gerar relatórios, os dados armazenados no citômetro podem ser transferidos para um computador usando um drive USB.

4. Resultados representativos:

A Imagem-Baseado Tali Citómetro foi usado para medir o nível de expressão de proteínas fluorescentes em células que foram transduzidas com um BacMam GFP nuclear-alvo construir expressão 2.0. Quatro tipos de células representativas foram transduzidas (U2OS, 293MSR, HEKn e CHO-S).Para estas linhas celulares, o número de células que estavam expressando GFP foi relatado pelo citômetro de Tali e comparados com os dados das mesmas amostras analisadas em um citômetro de fluxo. Além disso, as células foram coradas com o reagente Celular Red Dead usando o Kit de Viabilidade Tali para identificar a população de células mortas tanto no citômetro de Tali e em um citômetro de fluxo.

As representações gráficas na Figura 2 mostra o percentual da população total para cada tipo de célula que estavam expressando GFP. Estes dados demonstram que o citómetro Tali produz dados comparáveis ​​aos dados gerados por um citômetro de fluxo.

Figura 1. Células devem ser devidamente focado antes da análise. Slides Análise Tali celular com concentrações célula apropriada para a análise (1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ células são recomendados). (LEFT) em foco células são uniformemente darca toda a célula, com um halo brilhante em torno de cada célula de células. (CENTER) pode ser undercounted quando a transição entre o fundo e as bordas das células são difusas e as células têm limites indefinidos (RIGHT) Células talvez overcounted quando têm brilhantes centros e perímetros escuro.

Figura 2. Dados proteína fluorescente expressão do Citómetro Tali baseada em imagem é comparável à obtida por citometria de fluxo. A comparação lado a lado de cálculo GFP-expressão resulta em 4 linhas de células diferentes em células viáveis.

Discussion

Temos apenas um procedimento detalhado para a realização de contagens de viabilidade e avaliar a expressão do GFP utilizando a imagem baseada em Tali citómetro. Usando o mesmo procedimento, este citómetro é capaz de realizar uma série de outros ensaios, incluindo: apoptose, RFP e análise de viabilidade celular utilizando células não-transduzidas.

Ensaios fluorimétricos de viabilidade celular, expressão gênica e apoptose tornaram-se metodologias de chave na pesquisa biomédica ^7-12. Na instrumentação, separados passado foi usado para obter informações quantitativas e visuais sobre as células. Embora as informações quantitativas sobre células dentro de uma população heterogênea tem sido garnered através do uso de citometria de fluxo, a informação visual ou qualitativa foi recolhida através do uso de microscopia de fluorescência ^1-4. Aqui, apresentamos uma tecnologia que faz a ponte entre população e estudos de células individuais. Usando o Tali Citómetro Image-Based, quantitativa data e os dados das células visuais sobre células individuais ou populações de células podem ser coletados simultaneamente. O instrumento Tali pode ser usado para uma variedade de aplicações incluindo a avaliação da expressão gênica, ensaios de apoptose, estudos de eficácia de drogas e avaliação da progressão da doença.

A Imagem-Baseado Tali captura citómetro e análises de campo brilhante fluorescência, vermelho e verde imagens de fluorescência, permitindo que informações sobre subpopulações de células a serem obtidos. Por exemplo, neste ensaio, fomos capazes de distinguir as células mortas de células vivas dentro do GFP-expressando população de células usando células mortas corante Vermelho. Isso dá a precisão na medição de células viáveis ​​expressando GFP, e identifica a população de células utilizável para o processamento de downstream. É importante notar que as células mortas da população podem surgir de várias fontes, incluindo a morte de células normais em cultura ou morte celular causada por condições ambientais (por exemplo tripsinização, ou death induzida pelo método de transfecção / transdução escolhido).

Aqui mostramos o uso do citômetro de Tali com células U2OS. Métodos semelhantes podem ser realizadas usando a maioria das células de mamíferos e insetos. Para cada linhagem celular, o citômetro de Tali produzidos dados quantitativos GFP expressão, que não é possível com uma inspeção visual das células usando um microscópio padrão de fluorescência. Embora estes resultados são comparáveis ​​aos de citometria de fluxo, são coletados em uma fração do tempo. O citômetro é capaz de precisão células contagem entre 5 mm a 60 m de diâmetro, de preferência em uma concentração de 1 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁷ células / mL.

É importante ressaltar que os protocolos de coloração mais uniforme, incluindo o protocolo de coloração Morto Red Cell descritas aqui, use iodeto de propídio para distinguir as células vivas e mortas. Isto representa um desafio ao avaliar a viabilidade das células que foram permeabilizadas para staining de marcadores intracelulares, uma vez que PI vai manchar qualquer célula com uma membrana comprometida. Uma vez que qualquer corante fluorescente ou proteína que pode ser detectada com os canais verde ou vermelho de fluorescência podem ser analisadas no citômetro de Tali Image-Based, estudos futuros podem explorar o uso de corantes alternativos, tais como aminas corantes reativos viabilidade ^4. Um estudo de 2006 por Perfetto et al. ¹² encontraram estes corantes para ser fácil de usar e reprodutível em discriminar populações de células vivas e mortas.

Note que o Tali tem limitações no que diz respeito aos tipos de testes ele pode executar. Por exemplo, já que o objetivo utilizada pelo instrumento é 4X, operações de contagem são limitados a tipos maiores célula: sub-celular das estruturas, tais como mitocôndrias ou vesículas e células bacterianas não podem ser quantificados. Observe também que os canais de detecção em Tali estão limitados a fluoróforos que vão animar e emitem dentro dos canais. Enquanto YFP e brilhante mCherry sinais cum ser detectado, os sinais de dimmer mCherry não pode. Finalmente, a Tali analisa somente as células em suspensão. Ele não vai contar com precisão células aderindo a um slide. Além disso, enquanto há apenas uma capacidade limitada para a contagem de células que estão de forma irregular, incluindo algumas leveduras e células primárias.

Além disso, estudos futuros provavelmente vai abordar o uso deste sistema na avaliação da expressão de marcadores intracelulares. Corantes individuais podem ser verificados para sobreposição espectral com canais adjacentes, utilizando a ferramenta da Invitrogen SpectraViewer online ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Dada a novidade desta tecnologia, a gama completa de aplicações ainda não foi descoberto.

Em resumo, a Tali Citómetro Imagem Baseada demonstrado aqui apresenta uma nova tecnologia que permite a visualização simultânea e análise de populações de células, permitindo a avaliação de células individuais, bem como celpopulações l em um formato compacto, com um fluxo de trabalho simples.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells