Summary
Este protocolo se describe cómo realizar los ensayos de viabilidad celular y la expresión mediante la fluorescencia Tali basada en imágenes citómetro.
Abstract
Una sola célula y la información de la población son generalmente obtenidas por citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. Sin embargo, estos dos métodos proporcionan información diferente. La citometría de flujo cuantitativa ofrece multi-paramétrico de información sobre las características físicas y de coloración o de expresión, pero no permite la visualización. Stand-alone microscopía de fluorescencia proporciona información visual, pero no permite la fácil medición cuantitativa 1.
Imagen basada en citometría de puente entre estos dos métodos, lo que permite la rápida visualización y el análisis cuantitativo simultáneo de miles de células en poblaciones heterogéneas 2. A continuación, presentamos un método para realizar la viabilidad celular y la proteína verde fluorescente (GFP) ensayos de expresión con el Tali basada en imágenes citómetro 3. El instrumento Tali es una plataforma de 3 canales (campo claro, fluorescencia de color verde, rojo fluorescente) de sobremesa ensayo que Offers varias ventajas con respecto a la citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El citómetro de Tali es más barato, ocupa menos espacio en el laboratorio, requiere menos mantenimiento, y el flujo de trabajo se ha simplificado para que la operación y el análisis es mucho más simple y más rápido. El citómetro de Tali es capaz de realizar una amplia gama de suspensión basada en ensayos de células, incluidas las buenas prácticas agrarias y el rojo la expresión proteína fluorescente (RFP), la apoptosis 4-6 y análisis de viabilidad celular con yoduro de propidio (PI) 7.11.
En este caso, se demuestra el uso del instrumento de Tali en la realización de un ensayo de viabilidad celular en las células que expresan GFP. GFP-transduced células se tiñen con el Kit de Viabilidad Tali - Red Dead Cell. Las células se pipeta en una diapositiva Análisis Tali celular y se carga en el citómetro. De campo claro, fluorescencia roja y verde imágenes de fluorescencia son capturados y analizados mediante algoritmos de análisis específicos. Histogramas continuación, se generan para mostrar el tamaño de celda, PI fluola intensidad de fluorescencia, y la intensidad de la fluorescencia de GFP. Estos parámetros pueden ser un umbral de su casa en una población de células específicas.
Una comparación lado a lado del citómetro de Tali basada en imágenes y citometría de flujo tradicionales demuestra que los dos métodos ofrecen datos comparables en relación con la viabilidad celular y la expresión de la proteína. Sin embargo, el instrumento Tali proporciona información adicional visual sobre la población de células que no se puede obtener con un citómetro de flujo.
Protocol
1. Tinción de las células con el kit de Viabilidad Tali - reactivo para la Red Dead
- De iniciar este procedimiento con células U2OS (American Type Culture Collection) que han sido transducidas con CellLight Núcleo-GFP * BacMam 2.0 *. (Nota: Las células también se pueden hilar y resuspendido en el medio o PBS).
- Para teñir las células muertas de PI, la transferencia de 100 L de las células a un tubo nuevo de microcentrífuga. Tenga en cuenta que una concentración de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / ml se recomienda para este ensayo, aunque la concentración no tiene por qué ser exacta.
- A continuación, para teñir las células muertas, añadir 1 l de reactivo basado en IP Tali de glóbulos rojos muertos. Agitar brevemente para mezclar. Incubar el Tali muertos reactivo de glóbulos rojos y la mezcla de células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1-5 minutos.
- Tras la incubación, proceder de inmediato al análisis de la muestra en la imagen basada en Tali citómetro.
2. Realización de un ensayo de viabilidad celular El uso de unTali basada en imágenes citómetro
- El citómetro de Tali utiliza el plástico desechables Tali Diapositivas análisis celular que se ajuste específicamente en el citómetro y puede albergar dos muestras de 25μL por separado en cámaras cerradas (A y B). Al manipular la diapositiva, asegúrese de que siempre tienen a los lados.
- Para cargar la diapositiva, pipeta de 25 l de la muestra lentamente en la forma de media luna zona de carga de la muestra, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas o en la espalda salpicaduras. No más o menos llenar.
- En este caso, las células control (sin mancha, no transducidas) se cargan en la cámara A y el manchado GFP-que expresan las células se cargan en la cámara B. La muestra de control le ayudará a determinar el nivel de autofluorescencia en el análisis de los datos.
- Para llevar a cabo un ensayo de viabilidad, el tacto GFP / RFP en la pantalla principal del citómetro. Las opciones de análisis aparecerá a la derecha. Seleccione GFP + Viabilidad.
- A continuación, a nombre de la serie de muestras, presione nombre ahora Guardar. (Nota: Seleccionar Nombre Más tarde, para asignar automáticamente un nombre para cada serie de muestras por fecha y hora.)
- Después de nombrar a la muestra, el citómetro de Tali avanzará automáticamente a la pantalla de medida. Pulse la ficha de fondo en la parte derecha inferior de la pantalla de medición.
- A continuación, con la muestra de control (A) de espaldas a la citómetro, insertar la diapositiva en el puerto de carga hasta que se detenga. No aplique una fuerza.
- En la pantalla de fondo, toque Pulse para Insertar nuevo control celular sin teñir. La diapositiva de forma automática se detuvo en el citómetro y una imagen en vivo de las células se mostrará en la pantalla.
- Utilizando el botón de enfoque, traer las células en el plano adecuado de vista. Las células deben ser uniformemente oscuro, con un halo brillante alrededor de cada célula (Figura 1, izquierda).
- Células pueden ser contadas en la transición entre el fondo y los bordes de las celdas es confusa, por lo que los límites de la celda no están bien definidos (Figura 1, Centro). Las células pueden ser overcounted cuando tienen centros de brillantes y oscuros perímetros (Figura 1, derecha).
- Para ver mejor la población de células mientras que se centra, deslice el botón de zoom indicador rojo de 4X o 16X.
- Una vez que las células se han puesto de relieve, toque Pulse para ejecutar control de células sin teñir para medir la fluorescencia de fondo.
- El citómetro de automáticamente capturar y analizar las imágenes de la muestra. Se tarda aproximadamente 1 minuto para capturar y analizar las imágenes en el directorio predeterminado (9 imagen fija).
- Las miniaturas de cada campo de visión se muestran como son capturados y la barra de progreso se ofrece una actualización permanente. Después de la captura de imágenes se ha completado, el citómetro expulsa automáticamente la diapositiva y brinda los datos para el análisis de las imágenes capturadas.
- Los datos almacenados se mostrará en el menú desplegable de la ficha de fondo en el citómetro. La muestra de control de antecedentes se le asignará el mismo nombre que se da a la experiencia y se importarán en el menú desplegable. Nota: Si un control de fondo no se ejecuta, el citómetro asigna automáticamente un umbral de fluorescencia. Esto se puede cambiar manualmente después de realizar el ensayo.
- Para ejecutar el ejemplo PI teñido transducidas, eliminar la diapositiva del citómetro, darle la vuelta y vuelva a insertarlo con la muestra de transducción de espaldas al instrumento.
- Pulse la pestaña de la muestra, a continuación, toque Pulse para introducir nueva muestra. Cuando la imagen aparece en la pantalla, utilice el botón de ajuste de imagen para que las células en el foco que antes. A continuación, pulse Pulse para Ejecutar la muestra.
- Después de la captura de imágenes se ha completado, los datos de los análisis aparece en la pestaña de la muestra y el citómetro automáticoaliado expulsa de la diapositiva.
- Adecuada disposición de las diapositivas Análisis Tali celular como desechos. Tali Diapositivas análisis celular no se pueden reutilizar.
3. Establecer umbrales y puertas
- Una vez que la muestra se ha ejecutado, los umbrales de ahora se puede aplicar a la muestra a la casa en una población de células específicas. Aquí, vamos a ajustar los umbrales para determinar el porcentaje de células vivas y muertas en las buenas prácticas agrarias-las células transducidas.
- En la ficha de la muestra, el número y porcentaje de células que expresan GFP, células vivas y muertas que expresan GFP, la viabilidad total, el tamaño promedio de células, el número de células contadas, y la concentración de la celda se muestran.
- Además, el histograma de mostrar el tamaño de celda, la fluorescencia verde y rojo de fluorescencia (PI) se muestran en la parte inferior de la pantalla.
- Para configurar la puerta de tamaño de la celda, toque la miniatura de tamaño celular para abrir el histograma tamaño de la celda. Mientras que las células cultivadas rara vez tienen debris, otras muestras pueden contener restos del que sea más grande o más pequeño que las células.
- Para excluir estos desechos, deslice el botón azul en la barra deslizante para excluir a los eventos grandes y pequeños. A continuación, toque en Aplicar para volver a analizar los datos y actualizar los resultados.
- A continuación, añadir la fluorescencia de GFP en el análisis, toque la miniatura histograma GFP para abrirlo. Deslice la barra azul para establecer el umbral justo a la derecha de la más tenue de pico, con la muestra de control como guía.
- Esto permite el análisis para incluir las células GFP positivos, pero excluye las células autofluorescentes. Autofluorescencia se observa con frecuencia cuando las moléculas biológicas dentro de las células se excitan.
- Toque en Aplicar para confirmar y volver a la pantalla anterior. Los datos que se muestran en la pestaña muestra el momento de reflexionar las puertas y los umbrales establecidos para los dos canales de fluorescencia.
- A continuación, para separar las células PI teñido de autofluorescencia, pulse tque thumbnail PI histograma para abrir el histograma de PI.
- Una vez más, el pico de la muestra de control se muestra como un pico de color gris en el histograma. El pico de color rojo es la fluorescencia de la muestra. La fluorescencia de fondo se muestra como un pico más próximo al valor 0 RFU en este citómetro.
- Para eliminar la fluorescencia de fondo en el canal de PI, mueva el botón azul en la barra deslizante para ajustar el umbral para excluir el pico que representa la fluorescencia de fondo, con el pico gris de la muestra de control como referencia. Toque en Aplicar para confirmar y volver a la pantalla anterior.
- A continuación, para confirmar visualmente que cada célula está correctamente asignado, seleccione un campo de captura de vista para revisar pulsando la miniatura de la imagen en la ficha Zoom, a continuación, pulse la pestaña de Capas.
- A continuación, pulse el botón de las buenas prácticas agrarias o PI, para mostrar la imagen capturada a través de ese canal en particular. Pulse el mismo botón para eliminar la capa de la pantalla, o bien, para superponer capas, toque el botón de múltiples capas.
- Para identificar cómo las células se cuentan a través de un canal en particular, los círculos de contacto. Las células que se contaron únicamente a través del canal de campo claro, que no expresan fluorescencia será encerrado en azul. Esto indica que esa célula en particular es en vivo (es decir, PI negativas).
- Las células que expresan GFP se verá en el canal de las buenas prácticas agrarias, y será un círculo de color verde. Las células muertas teñidas con Red Dead Cell se verá en el canal de PI, y será un círculo en rojo.
- Células contadas, tanto en el canal rojo y el verde será un círculo de color amarillo, esto indica que la célula expresa GFP, pero también teñidas con PI y por lo tanto está muerto.
- En ocasiones, los círculos negro aparecerá en la pantalla, se trata de objetos que han sido identificados, pero han sido excluidos del análisis basado en el tamaño celular.
- Siguen fine ajustar el umbral en el histograma de fluorescencia utilizando los pasos que acabamos de describir hasta que cada célula que expresa la fluorescencia es un círculo con el color adecuado.
- Todos los parámetros de análisis se guardan automáticamente en la ficha de datos. El citómetro de Tali puede almacenar archivos de datos de alrededor de 500 carreras de la muestra.
- Cada archivo almacenado en la ficha de datos está disponible para su nuevo análisis. Al seleccionar el archivo de la ficha de datos, se le abre y todos los histogramas y las capas se activan.
- Para archivar datos y generar informes, los datos almacenados en el citómetro pueden ser transferidos a un ordenador mediante una unidad USB.
4. Los resultados representativos:
La imagen basada en Tali citómetro se utilizó para medir el nivel de expresión de la proteína fluorescente en las células que se transduced con una construcción de armas nucleares dirigida GFP expresión BacMam 2.0. Cuatro tipos de células representativas fueron transducidas (U2OS, 293MSR, HEKn y CHO-S).Para estas líneas celulares, el número de células que expresaban GFP fue reportado por el citómetro de Tali y en comparación con los datos de las mismas muestras se analizaron en un citómetro de flujo. Además, las células fueron teñidas con reactivo para la Red Dead utilizando el Kit de Viabilidad Tali identificar a la población de células muertas, tanto en el citómetro de Tali y en un citómetro de flujo.
Las representaciones gráficas de la Figura 2 muestra el porcentaje de la población total de cada tipo de células que expresaban GFP. Estos datos demuestran que el citómetro de Tali produce datos comparables a los datos generados por un citómetro de flujo.
Figura 1. Las celdas deben estar debidamente centrado antes del análisis. Diapositivas Tali celular Análisis de las concentraciones de células adecuadas para el análisis (1 x 10 5 a 1 x 10 7 células se recomiendan). (Izquierda) en las células de enfoque son de manera uniforme darca en toda la célula, con un halo brillante alrededor de cada célula de la célula. (CENTRO) pueden ser contadas en la transición entre el fondo y los bordes de las células se ven borrosos y las células tienen límites indefinidos (DERECHA) Células quizá overcounted cuando tienen brillantes centros y los perímetros de oscuridad.
Figura 2. Fluorescentes datos de expresión de proteínas de la citómetro Tali basada en imágenes es comparable a la obtenida mediante citometría de flujo. Una comparación lado a lado de calcular la expresión de GFP-los resultados en cuatro líneas diferentes de células en células viables.
Discussion
Acabamos detallada de un procedimiento para la realización de recuentos de viabilidad y la evaluación de la expresión de GFP usando la imagen basada en Tali citómetro. Utilizando el mismo procedimiento, esta citómetro es capaz de realizar una serie de otros ensayos que incluyen: análisis de la apoptosis, la RFP y de viabilidad celular utilizando células no transducidas.
Fluorométricos ensayos de viabilidad celular, la expresión génica y apoptosis se han convertido en metodologías clave en la investigación biomédica 12.07. En la instrumentación del pasado, por separado se ha utilizado para obtener información cuantitativa y visual acerca de las células. Mientras que la información cuantitativa acerca de las células dentro de una población heterogénea se ha obtenido mediante el uso de citometría de flujo, la información visual o cualitativa ha sido obtenida a través de la utilización de la microscopía de fluorescencia 1-4. A continuación, presentamos una tecnología que sirve de puente entre la población y los estudios individuales de la célula. Utilizando el Tali basada en imágenes citómetro, cuantitativa data y visual de células de células individuales o poblaciones de células se pueden recoger de forma simultánea. El instrumento de Tali puede ser utilizado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la evaluación de la expresión genética, ensayos de apoptosis, los estudios de eficacia de los medicamentos, y la evaluación de la progresión de la enfermedad.
La imagen basada en Tali captura citómetro y análisis de campo claro, fluorescencia roja y verde imágenes de fluorescencia, permitiendo que la información acerca de las subpoblaciones de células que se obtengan. Por ejemplo, en este ensayo, hemos sido capaces de distinguir las células muertas de las células vivas en el que expresan GFP población de células con Dead Cell tinte rojo. Esto proporciona una precisión en la medición de células viables que expresan GFP, e identifica la población de células utilizables para su tratamiento. Es importante señalar que las células muertas de la población podría surgir de varias fuentes, incluyendo la muerte celular normal en la cultura o la muerte celular causada por las condiciones ambientales (por ejemplo, tripsina o deATH inducida por el método de transfección / transducción de la elegida).
Aquí se demuestra el uso del citómetro de Tali con células U2OS. Métodos similares se pueden realizar utilizando mayoría de las células de mamíferos e insectos. Por cada línea celular, el citómetro de Tali producido cuantitativa de datos de expresión GFP, lo que no es posible con una inspección visual de las células utilizando un microscopio de fluorescencia estándar. Aunque estos resultados son comparables con la citometría de flujo, que se recogen en una fracción del tiempo. El citómetro es capaz de contar con precisión las células entre 5 micras a 60 micras de diámetro, de preferencia en una concentración de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / ml.
Es importante señalar que la mayoría de los protocolos de tinción estándar, incluyendo el protocolo de tinción celular Red Dead se describe aquí, el uso de yoduro de propidio para distinguir las células vivas y muertas. Esto presenta un desafío cuando se evalúa la viabilidad de las células que han sido permeabilizadas para staining de marcadores intracelulares, ya que PI se mancha cualquier célula con una membrana comprometida. Ya que cualquier tinte fluorescente o una proteína que puede ser detectada con los canales de fluorescencia de color verde o rojo puede ser analizada en el Tali basada en imágenes citómetro, los estudios futuros pueden explorar el uso de tintes alternativos, tales como aminas colorantes reactivos viabilidad 4. Un estudio de 2006 Perfetto et al. 12 encontraron estos colorantes para ser fácil de usar y reproducible en la discriminación de las poblaciones de células vivas y muertas.
Tenga en cuenta que el Tali tiene limitaciones con respecto a los tipos de pruebas que puede realizar. Por ejemplo, ya que el objetivo utilizado por el instrumento es de 4X, las operaciones se limitan a contar los tipos de células grandes: estructuras subcelulares como las mitocondrias y vesículas, y las células bacterianas no se pueden cuantificar. También tenga en cuenta que los canales de detección de Tali se limitan a fluoróforos que se excitan y emiten dentro de los canales. Mientras YFP y brillante mCherry señales de cun ser detectados, dimmer señales mCherry no se puede. Por último, el Tali sólo analiza las células en suspensión. Es posible que no contará con células que se adhieren a una diapositiva. Por otra parte, mientras que sólo hay una capacidad limitada para el conteo de células que son de forma irregular, incluyendo algunas levaduras y células primarias.
Además, los estudios futuros es probable que abordar el uso de este sistema en la evaluación de la expresión de marcadores intracelulares. Colorantes individuales se puede comprobar la superposición espectral con los canales adyacentes, utilizando la herramienta de línea SpectraViewer de Invitrogen ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Dada la novedad de esta tecnología, la gama completa de aplicaciones aún por descubrir.
En resumen, el Tali basada en imágenes citómetro demostrado aquí se presenta una nueva tecnología que permite la visualización simultánea y el análisis de las poblaciones de células, lo que permite la evaluación de las células individuales, así como cellas poblaciones de l en un formato compacto con un flujo de trabajo simple.
Disclosures
Krissy Remple Laurel y la piedra son los empleados de las Tecnologías de la Vida, que produce el instrumento utilizado en este artículo. Life Technologies ha patrocinado la producción de este video-artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell'Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
