Vurdering af GFP Expression og levedygtighed Brug af Tali Billed-Based cytometer

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan du udfører cellernes levedygtighed og fluorescens udtryk analyser ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer.

Abstract

Enkelt-celle og befolkningen information er almindeligt fås enten ved flowcytometri eller fluorescens mikroskopi. Men disse to metoder giver forskellige informationer. Flowcytometri giver kvantitative multi-parametrisk oplysninger om fysiske egenskaber og farvning eller udtryk, men giver ikke mulighed for visualisering. Stand-alone fluorescensmikroskopi indeholder visuelle data, men tillader ikke ved ukomplicerede kvantitative målinger ^1.

Billed-baserede cytometri bygger bro mellem disse to metoder, der muliggør hurtig visualisering og samtidig kvantitativ analyse af tusindvis af celler i heterogene populationer ^2. Her præsenteres en metode til udførelse af cellernes levedygtighed og grønne fluorescerende protein (GFP) udtryk analyser ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer ^3. Den Tali instrument er en 3-kanal (lyse felt, grøn fluorescens, rød fluorescens) benchtop assay platform, der offers flere fordele i forhold til flowcytometri og fluorescens mikroskopi. Den Tali cytometeret er billigere, optager mindre bænk plads, kræver mindre vedligeholdelse, og det arbejde flow er blevet forenklet, så drift og analysen er meget enklere og hurtigere. Den Tali cytometeret er i stand til at udføre en række suspension cellebaserede assays, herunder GFP og rød fluorescerende protein (RFP) udtryk, apoptose ^4-6 og cellernes levedygtighed analyse med propidium iodid (PI) ^7-11.

Her vil vi demonstrere brugen af ​​Tali instrument i udførelsen af ​​en celle levedygtighed assay i celler, der udtrykker GFP. GFP-transduced celler farves ved hjælp af Tali Levedygtighed Kit - Dead Cell Rød. Cellerne bliver derefter afpipetteres i en Tali Cellular Analyse Skub og indlæses i cytometret. Bright felt, rød fluorescens og grøn fluorescens billeder er taget til fange og analyseres ved hjælp af assay specifikke algoritmer. Histogrammer bliver derefter genereret for at få vist celle størrelse, PI Fluorescence intensitet, og GFP fluorescensintensitet. Disse parametre kan derefter thresholded komme ind på en bestemt celle population.

En side om side sammenligning af Tali Billed-baserede cytometer og traditionelle flowcytometri viser, at de to metoder giver sammenlignelige data om cellernes levedygtighed og protein udtryk. Men den Tali instrumentet giver yderligere visuel information om cellepopulation, der ikke kan opnås ved hjælp af et flowcytometer.

Protocol

1. Farvning Celler med Tali Levedygtighed Kit - Dead Cell Rød Reagens

1. Begynd denne procedure med U2OS celler (American Type Culture Collection), der er blevet transduced hjælp CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Bemærk: Celler kan også spindes ned og resuspenderet i medium eller PBS).
2. At farve døde celler med PI, overførsel 100 μL af cellerne til en ny mikrocentrifugerør. Bemærk, at en koncentration på 1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler / ml anbefales til denne analyse, men den koncentration, der ikke behøver at være helt nøjagtig.
3. Dernæst at farve de døde celler, tilsættes 1 ml af PI-baseret Tali Dead Cell Rød reagens. Vortex kort at blande. Inkubér Tali Dead Cell Red reagens og celle blanding ved stuetemperatur i mørke i 1-5 minutter.
4. Efter inkubation, gå straks til analyse af prøven på Tali Billed-Based cytometer.

2. Udførelse af en cellelevedygtighed Assay Ved hjælp af enTali Billed-baseret cytometer

1. Den Tali cytometeret bruger engangs plast Tali Cellular Analyse Dias, der specifikt passer ind i cytometret og kan holde to 25μL prøver i separate lukkede kamre (A og B). Ved håndtering af dias, skal du sørge for altid at holde den ved siderne.
2. For at indlæse et dias, afpipetteres 25 μL af prøven langsomt ind i halvmåne-formet prøve loading område, under omhyggelig med at undgå at danne bobler eller tilbage splatter. Må ikke over eller under udfylde.
3. Her er kontrol celler (uplettet, ikke-transduced) er lagt i kammer A og de farvede GFP-udtrykkende celler er lagt i kammer B. kontrolprøve vil hjælpe med at bestemme niveauet af autofluorescens når analysere dataene.
4. For at udføre en levedygtighed assay, skal du trykke GFP / RFP på startskærmen på cytometret. Analysen valgmuligheder vises derefter til højre. Vælg GFP + levedygtighed.
5. Dernæst at navngive prøveserie, tryk på Navn nu Gem. (Bemærk: Vælg navn senere til automatisk at tildele et navn for hver prøveserie efter dato og klokkeslæt.)
6. Efter navngivning prøven, vil Tali cytometret automatisk gå videre til Mål skærmen. Tryk på fanen Baggrund i nederste højre halvdel af Mål skærmen.
7. Dernæst med kontrolprøve (A) vender væk fra cytometret, indsætte dias i laste havnen, indtil den stopper. Må ikke anvendes kraft.
8. På baggrund skærmen, Tryk røre ved at indsætte nye Ufarvet Cellekontrol. Slide vil automatisk blive trukket ind i cytometret og et levende billede af cellerne vil blive vist på skærmen.
9. Ved hjælp af fokus knop, cellerne sætter den rette plan udsigt. Cellerne skal være ensartet mørk med et lysende glorie omkring hver celle (figur 1, Venstre).
10. Cells kan undercounted, når overgangen mellem baggrund og kanterne af cellerne er fuzzy, således at cellen grænser ikke er veldefinerede (figur 1, Center). Celler kan overcounted når de har lyst centre og mørke perimetre (figur 1, højre).
11. For bedre at se cellepopulation samtidig fokusere, skal du skubbe den røde Zoom indikator knap for at 4X eller 16X.
12. Når cellerne er blevet bragt i fokus, skal du trykke Tryk for at Run Ufarvet Cellekontrol at måle baggrundsfluorescens.
13. Cytometret vil automatisk opsamling og analysere billeder af prøven. Det tager omkring 1 minut at indfange og analysere billeder i standard (9 billeder) mode.
14. Miniaturer af hver synsfelt vises som de er fanget, og de fremskridt, bar giver en løbende opdatering. Efter billedoptagelse er færdig, cytometret automatisk skubber slæden og giver dataene fra analysen af ​​de optagne billeder.
15. De gemte data vil blive vist i drop down menuen i fanen Baggrund på cytometret. Baggrunden kontrolprøven vil blive tildelt det samme navn som der gives til eksperimentet, og vil blive importeret i drop down menuen. Bemærk: Hvis en baggrund kontrol ikke er kørt, cytometret tildeler automatisk et fluorescens tærskel. Dette kan manuelt ændres efter udførelse af analysen.
16. Sådan køres PI-farvede transduced prøve, skal du fjerne dias fra cytometret, vend det rundt og sæt det med transduced prøve vender væk fra instrumentet.
17. Tryk Sample fanen, og tryk derefter på Tryk for at indsætte ny prøve. Når billedet vises på skærmen, bruge billedet justeringsknappen for at bringe celler i fokus som før. Tryk derefter på Tryk på for at Run Sample.
18. Efter billedoptagelse er afsluttet, data fra analyse forekommer under Sample fanen og cytometret automatiskeallieret skubber slæden.
19. Tilstrækkeligt disponere over Tali Cellular Analyse Slide som biologisk farligt affald. Tali Cellular Analyse Dias kan ikke genbruges.

3. Indstilling Tærskler og Gates

1. Når prøven har kørt, kan tærskler nu anvendes til prøven komme ind på en bestemt celle population. Her vil vi justere tærsklerne til at bestemme den procentdel af levende og døde celler i GFP-transduced celler.
2. Under Sample fanen, er antallet og procentdelen af celler, der udtrykker GFP, levende og døde celler, der udtrykker GFP, total levedygtighed, gennemsnitlig cellestørrelse, antallet af optalte celler, og cellekoncentrationen vises.
3. Desuden er histogram grunde viser celle størrelse, grøn fluorescens, og rød fluorescens (PI), der vises nederst på skærmen.
4. For at indstille cellestørrelse porten, røre Cell Size miniaturebilledet for at åbne cellestørrelse histogrammet. Mens dyrkede celler sjældent har debris, kan andre prøver indeholder rester, der er større eller mindre end cellerne.
5. At udelukke denne vragrester, skal du skubbe den blå knapper på skyderen til at udelukke både store og små begivenheder. Tryk derefter på Anvend for at re-analysere data og opdatere resultaterne.
6. Dernæst at tilføje GFP-fluorescens til analysen, røre ved GFP histogrammet miniaturebillede for at åbne den. Skub den blå bjælke til at indstille tærsklen lige til højre for selv meget svagt peak, ved hjælp af kontrolprøven som en vejledning.
7. Dette giver analysen til også at omfatte GFP positive celler, men udelukker autofluorescent celler. Autofluorescens er ofte observeret, når biologiske molekyler i celler er begejstrede.
8. Tryk på Anvend for at bekræfte og vende tilbage til den forrige skærm. De data, der vises under Sample fanen skal nu afspejle portene og tærskler for såvel fluorescens kanaler.
9. Dernæst at adskille PI farvede celler fra autofluorescens, skal du trykke than PI histogram miniaturebillede for at åbne PI histogrammet.
10. Igen vil kontrolprøve peak blive vist som en grå peak på histogrammet. Den røde top er prøven fluorescens. Baggrunden fluorescens vises som et højdepunkt tættest på 0 RFU værdi på denne cytometer.
11. For at fjerne baggrunden fluorescens i PI kanal, skal du flytte den blå knap på skyderen for at justere tærsklen til at udelukke den top, der repræsenterer baggrundsfluorescens, ved hjælp af den grå top fra kontrolprøven som reference. Tryk på Anvend for at bekræfte og vende tilbage til den forrige skærm.
12. Dernæst til visuelt bekræfte, at hver celle er korrekt tildelt, vælge et fanget synsfelt til gennemsyn ved at trykke på miniaturen af billedet i Zoom under fanen, og derefter trykke på fanen Lag.
13. Tryk derefter på GFP eller PI-knappen, for at vise et billede taget gennem denne særlige kanal. Tryk på den samme knap igen for at fjerne det lag fra displayet, eller at overlejre lag, røre ved Multiple Layer knappen.
14. At identificere, hvordan cellerne tælles ved hjælp af en særlig kanal, tryk cirkler. De celler, der blev talt igennem kun de lyse-feltet kanal, som ikke udtrykker fluorescens vil blive markeret med en cirkel i blå. Dette indikerer, at denne særlige celle er levende (dvs. PI negativ).
15. Celler, der udtrykker GFP skal ses i GFP-kanal, og vil blive cirklede i grønt. Døde celler farvet med Dead Cell Red vil ses i PI kanal, og vil blive rød cirkel.
16. Cellerne tælles i både rød og grøn kanal vil blive markeret med en cirkel i gult, indikerer dette, at cellen udtrykker GFP, men er også plettet af PI, og derfor er død.
17. Lejlighedsvis, sorte cirkler vises på skærmen, er disse objekter, der er blevet identificeret, men er blevet udelukket fra analyse baseret på celle størrelse.
18. Fortsæt med at fine tune den tærskel på fluorescens histogrammet ved hjælp af de trin, lige har beskrevet indtil hver celle, der udtrykker fluorescens er omgivet med en passende farve.
19. Alle analyseparametre gemmes automatisk under fanen Data. Den Tali cytometer kan gemme datafiler fra omkring 500 prøve kører.
20. Hver fil er gemt i fanen Data er til rådighed for reanalyse. Ved at vælge filen fra fanen Data vil det blive åbnet og alle histogrammer og lag bliver aktive.
21. Til arkivering af data og generere rapporter, kan data gemt i cytometret blive overført til en computer via et USB-drev.

4. Repræsentative resultater:

Den Tali Billed-Based cytometer blev brugt til at måle fluorescerende protein udtryk niveau i celler, der var transduced med en nuklear målrettet GFP BacMam 2,0 udtryk konstruere. Fire repræsentative celletyper var transduced (U2OS, 293MSR, HEKn, og Cho-S).For disse cellelinjer, var antallet af celler, der blev udtrykker GFP indberettet af Tali cytometret og sammenlignes med data fra de samme prøver analyseret på et flowcytometer. Derudover blev cellerne farvet med Dead Cell Rød reagenset ved hjælp af Tali Levedygtighed Kit til at identificere de døde cellepopulation både på Tali cytometret og på et flowcytometer.

Den grafiske fremstillinger i Figur 2 viser procent af den samlede befolkning for hver celletype, der var udtryk for GFP. Disse data viser, at Tali cytometret producerer data sammenlignes med data fra et flowcytometer.

Figur 1. Cellerne skal være ordentligt fokuseret forud for analysen. Tali Cellulær Analyse lysbilleder med celle koncentrationer egnede til analyse (1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler anbefales). (Venstre) i-fokus celler er ens dArken i hele cellen, med en lys glorie omkring hver celle. (i midten) Celler kan undercounted, når overgangen mellem baggrunden og kanterne af cellerne er slørede, og cellerne har udefinerede grænser (HØJRE) Celler måske overcounted, når de har lyst centre og mørke påbudt.

Figur 2. Fluorescerende protein udtryk data fra Tali Billed-Based cytometer kan sammenlignes med, der opnås ved hjælp af flowcytometri. Et side-by-side sammenligning af beregnede GFP-ekspression resulterer i 4 forskellige cellelinjer i levedygtige celler.

Discussion

Vi har netop detaljeret en procedure for udførelse af levedygtighed tæller og vurdere GFP udtryk ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer. Ved hjælp af samme procedure, denne cytometer er i stand til at udføre en række andre analyser, herunder: apoptose, RFP og celle levedygtighed og analysen ved hjælp af ikke-transduced celler.

Fluorometric analyser af cellernes levedygtighed, genekspression og apoptose er blevet centrale metoder i biomedicinsk forskning ^7-12. I fortiden, separate instrumentering er blevet brugt til at fremskaffe kvantitative og visuel information om celler. Mens kvantitative oplysninger om celler i en heterogen population er blevet vundet ved hjælp af flowcytometri, har visuel eller kvalitative oplysninger blevet indsamlet ved hjælp af fluorescensmikroskopi ^1-4. Her præsenterer vi en teknologi, der bygger bro mellem befolkningen og enkelte celle studier. Brug af Tali Billed-Based cytometer, kvantitative daTA og visuel celle data om de enkelte celler eller cellepopulationer kan indsamles samtidigt. Den Tali instrument kan bruges til en række applikationer, herunder vurdering af genekspression, apoptose analyser, undersøgelser af narkotika effekt, og vurdering af sygdomsprogression.

Den Tali Billed-Based cytometer indfanger og analyser lyse-feltet, rød fluorescens og grøn fluorescens billeder, der giver oplysninger om delpopulationer af celler, der skal indhentes. For eksempel, i denne analyse var vi i stand til at skelne døde celler fra levende celler inden for GFP-udtrykkende cellepopulation hjælp Dead Cell rød farve. Dette giver præcision i målingen af ​​levedygtige celler, der udtrykker GFP, og identificerer befolkningen i cellerne brugbare for downstream-behandling. Det er vigtigt at bemærke, at de døde celler i befolkningen kunne opstå fra forskellige kilder, herunder normal celledød i kultur-eller celledød forårsaget af miljømæssige forhold (f.eks, trypsinization eller deATH foranlediget af transfektion / transduktion valgte metode).

Her har vi demonstrere brugen af ​​Tali cytometret med U2OS celler. Lignende metoder kan udføres ved hjælp af de fleste pattedyr og insekter celler. For hver cellelinie, produceret Tali cytometret kvantitative GFP udtryk data, hvilket ikke er muligt med en visuel inspektion af celler ved hjælp af en standard fluorescens mikroskop. Selv om disse resultater er sammenlignelige med flowcytometri, er de samlet i en brøkdel af tiden. Cytometret er i stand til præcist at tælle celler mellem 5 m til 60 ìm i diameter, helst i en koncentration på 1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler / ml.

Det er vigtigt at påpege, at de fleste standard farvning protokoller, herunder Dead Cell Røde farvningsprotokol beskrevet her, kan du bruge propidium iodid til at skelne mellem levende og døde celler. Dette er en udfordring, når de vurderer levedygtigheden i celler, der har været permeabilized for staining af intracellulære markører, da PI vil pletten enhver celle med en kompromitteret membran. Da enhver fluorescerende farvestof eller protein, som kan opdages med den grønne eller røde fluorescens kanaler kan analyseres på Tali Billed-Based cytometer, kan fremtidige studier undersøge brugen af alternative farvestoffer, som amin reaktive levedygtighed farvestoffer ^4. En undersøgelse fra 2006 af Perfetto et al. ¹² fundet disse farvestoffer til at være nem at bruge og reproducerbar i diskriminerende levende og døde cellepopulationer.

Bemærk, at Tali har begrænsninger med hensyn til typer af assays det kan udføre. For eksempel, da formålet bruges af instrumentet er 4X regner begrænsede til større celletyper: sub-cellulære strukturer såsom mitokondrier eller vesikler, og bakterielle celler kan ikke kvantificeres. Bemærk også, at påvisning kanalerne i Tali er begrænset til fluorophores, der vil begejstre og udsender inden for de kanaler. Mens YFP og lyse mCherry signaler cen påvises, lysdæmper mCherry signaler ikke kan. Endelig Tali kun analyser celler i suspension. Det vil ikke nøjagtigt tælle celler at tilslutte sig et dias. Hertil kommer, mens der er kun begrænset kapacitet til at tælle celler, der er uregelmæssigt formet, herunder nogle gær og primære celler.

Desuden vil fremtidige undersøgelser sandsynligvis løse problemet med brug af dette system i forbindelse med vurderingen udtryk for intracellulære markører. Individuelle farver kan tjekkes for spektrale overlap med tilstødende kanaler, ved hjælp af Invitrogen online SpectraViewer værktøj ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). I betragtning af det nye i denne teknologi, har hele spektret af applikationer endnu at blive opdaget.

Sammenfattende viste Tali Billed-Based cytometer her præsenterer en ny teknologi, der giver mulighed for samtidig visualisering og analyse af cellepopulationer, der muliggør vurdering af de enkelte celler samt CELl populationer i et kompakt format med en simpel arbejdsgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells