Summary
要理解的复杂的细胞形状，如神经细胞树突，如何在发展过程中取得的，重要的是要能够准确地检测微管组织。在这里，我们描述了一个强大的免疫组化标记法研究微管组织的感觉神经元树突树突分枝，气管，肌肉，及其他
Abstract
要了解如何实现复杂的细胞形态的差异，重要的是要准确地按照微管组织。 果蝇幼虫体壁含有几种类型的细胞模型来研究细胞和组织的形态发生。例如气管是用于检查1，管形态发生和感觉神经元的果蝇幼虫一般的澄清和神经树突状分化2-5和变性 6级的具体机制已成为一个主要系统的树突状树枝状（ DA） 。
之间的神经元类，树突分支的形状可以显著不同，甚至在单个神经元的不同分支 7,8中。 DA能神经元的遗传研究表明，差的细胞骨架的组织可以在树突分支的形状4,9-11形态差异的基础。我们提供了一个强大的免疫标记法到ssay 在体内 DA的感觉神经元枝蔓乔木微管组织（图1，2，电影1）。该协议说明了第一龄幼虫的解剖和免疫组化，一个阶段，积极的感觉神经元树突生长和分支组织时发生12,13。
除了染色的感觉神经元，这种方法实现了强大的标签（电影2，3）微管在肌肉组织，气管（图3，电影3），和其他的体壁组织。这是宝贵的希望分析在体壁的微管组织调查机制时，在原地调查控制的组织和细胞的形状。
Protocol
1。试剂的制备
注：在开始之前进行解剖和免疫组化染色在磁场室和幼虫是使用特殊形状的昆虫引脚牵制。磁性室的建设，编制这些引脚的详细说明， 可以发现在14,15相关文献。简单地说，一个1x1cm方孔切成磁性表贴表，使一个小室的后部盖玻片。双方室是密封的环氧树脂胶，这种胶后室是用70％乙醇使用前清洗几次。准备解剖昆虫引脚弯曲所需要的形状，然后粘到金属选项卡14,15。另外一个金属片，我们从切断黄色提示作出了处理使用一个倒置的平头钢图钉。利用这个磁场室安排允许严密控制OVER引脚定位和组织在夹层延伸。
为了推动在不同子集的DA能神经元调查报告基因的表达，可以使用几种不同的Gal4的线（下野和他的同事 16总结） 。许多这些线路都可以从公共储备中心。在此代表的协议，我们开展免疫这两个DA神经元对比类是共同标记的行：最简单的类，我和最复杂的一流的四（P10 - Gal4的17,18，UAS - mCD8：： Kusabira橙色（KO））。
- 准备CA +无HL3.1生理盐水
- （毫米）：70氯化钠，氯化钾，20氯化镁2，碳酸氢钠3，5 HEPES，115蔗糖，5海藻糖; pH值7.2 19 10 5。过滤，消毒，并储存于4 ° C。注意：CA + +免费的解决方案可以防止肌肉收缩，在清扫。
- 准备2X PHEM缓冲区
- （毫米）：130管，60 HEPES，EGTA，20日4硫酸镁4，pH值7.0。过滤，消毒，并储存于4 ° C。
注：这些材料不会解散，直到pH值接近7.0。
- （毫米）：130管，60 HEPES，EGTA，20日4硫酸镁4，pH值7.0。过滤，消毒，并储存于4 ° C。
- 新鲜立即准备固定液前固定。
- 为了准备在50毫升猎鹰管一25ml的解决方案，第一个混合2G多聚甲醛，100μL1M NaOH溶液和10ml水。
- 在55℃，摇床水浴摇固定液，直到解决方案是明确的。 （总体积约11.5毫升）。
- 在冰酷固定液。
- 添加12.5毫升2X PHEM缓冲区。
- 1M盐酸调整pH值至7.0。
- 水填充的解决方案，直到卷25毫升。
- 过滤器使用的Whatman纸解决方案。
2。幼虫清扫
开始前的注意事项：微管网络，并特别是那些在感官树突，将迅速击穿后启动夹层。 AChieving在不到五分钟之内立即固定的快速清扫是在本议定书的成功的关键因素。
- 洗净的幼虫在水中快速移动到使用的头发循环下降。
- 东方的幼虫背侧和腹侧方在玻璃上。注：这个方向是研究腹侧集群神经元。要检查背的集群神经元，颠倒的方向。
- 使用昆虫针的中心针口附近挂钩前结束。将针接近年底，以取得最佳效果。
- 放置在解剖室内HL3.1生理盐水下降。
- 剪下的幼虫后的提示microscissors。注意：此步骤打开光圈microscissors（步骤2.7），将允许访问的幼虫后结束。
- 抓住镊子地区的肠道，现在戳在幼虫后部的光圈。轻轻拉出整个肠道。
- 放置提示一个刀片沿腹中线走向前通过光圈和削减microscissors。
- 利用角落引脚，引脚现在可以自由的角落，后第一，然后前。同时轻轻地伸展开幼虫圆角。
3。固定，阻断，染色，并安装幼虫鱼片
在解剖室内进行开始前的注意事项：所有的固定和染色步骤。在这个过程中，应注意不要敲的昆虫幼虫，因为这可能导致组织损伤引脚。为了防止干燥实验，做特百惠蘸组织包围在一个小容器中所有的染色步骤。
- 吸的Ca + + HL3.1缓冲区使用一个黄色的提示。立即加入固定液使用另一个pipetteman。
- 轻轻吸管上下钙+ +免费HL3.1缓冲区剩余的痕迹混合固定液在会议厅内。立即吸出，然后添加新鲜固定液进入会议厅。
- 在室温下孵育20分钟。
- PBST 6X清洗10分钟（0.1％的Triton X - 100的PBS中）。
- 座与5％PBST山羊血清在室温下20分钟。
- 更换封闭液在5％山羊血清PBST稀释的抗体。使用的主要抗体小鼠抗α-微管蛋白（DM1A）和鼠抗CD8（5H10）都稀释1 / 1000。
注：研究者不妨以鼠抗Futsch（22C10）20,21稀释1 / 1000在某些情况下，鼠抗α-微管蛋白（DM1A）（见讨论）。
- 孵育过夜（至少16小时）在4 ° C。
- 6X PBST清洗10分钟。
- 新增二级抗体溶液稀释于5％山羊血清PBST。使用的抗体的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG和Cy3标记的驴抗鼠IgG。保持样品的覆盖，以防止荧光团光漂白22。
- 可以在室温下孵育两小时或过夜，4 ° C的室温一小时。
- 6X PBST清洗10分钟。
- 放置在幻灯片上角质层的一面朝下的幼虫圆角，安装在80％甘油，和密封装入一个“快”与指甲油盖玻片的两侧。
注：为了提高组织的清算，和一个永久性的稳定样品，安装中的DPX如前所述23。
4。代表性的成果：
荧光染色，共聚焦显微镜下观察。在图1-2不同的分支，在枝蔓乔木有不同的细胞骨架组织。图1显示了一个地区的一类四DA神经元在第一龄幼虫期的乔木。整个乔木标记与mCD8：KO和检测用抗CD8抗体和荧光中学（Cy3标记）。微管蛋白检测抗α-微管蛋白抗体和Fluorescent中学（的Alexa Fluor 488）。主要支流为微管蛋白是积极的，有些单薄的偏科是微管蛋白阴性。电影1是通过类似的I类DA神经元染色的连续切片。图2显示了一个地区的一类四DA神经元在第一龄幼虫期的乔木Futsch和CD8抗体染色。主要支流Futsch阳性，一些薄的偏科Futsch阴性。图3。在幼虫体壁的气管显示一个复杂的微管组织。电影2和3显示了通过体壁肌肉和气管染色的连续切片。
图1。图1显示了一个地区的一类四DA神经元在第一龄幼虫期的乔木。整个乔木标有mCD8：：正和检测抗- CD8抗体和荧光中学（Cy3标记）。微管蛋白检测抗-＆-肾小管ñ抗体和荧光二（Alexa的488）。连续共聚焦Z -节（0.5微米），小组交流C' - C“，单从面板C.分支机构（黄色箭头）或无（紫色箭头）微管突出的例子抗体染色。红色箭头突出微管在底层上皮细胞。
图2。图2显示了一个类似的一类四DA神经元在第一龄幼虫期的乔木Futsch和CD8抗体染色地区。整个乔木标有mCD8：：正和检测抗- CD8抗体和荧光中学（Cy3标记）。使用反Futsch抗体和荧光中学（488 Alexa的）检测Futsch。主要支流Futsch阳性，一些薄的偏科Futsch阴性。 （黄色箭头）或无（紫色箭头）Futsch分行的例子是突出的。
图3。气管染色使用以上所述的抗微管蛋白的协议。幼虫三龄和解剖如前面所述23,24。电影3显示了从一个正方形标志着领域扩大连续切片。
电影1。连续切片追踪整个I类神经树突状乔木微管蛋白染色。整个乔木与mCD8标记：正（洋红色），检测抗- CD8抗体和荧光中学（Cy3标记）。微管蛋白（绿色）是检测抗α-微管蛋白抗体和荧光中学（的Alexa Fluor 488）。规模：视频图像的一侧对应到46.88μm ，点击这里查看电影节。 。
电影2追查BOD微管蛋白染色的连续切片 。Ÿ壁肌肉的第三龄幼虫。微管蛋白是检测抗α-微管蛋白的抗体和荧光中学（的Alexa Fluor 488）。规模：视频图像的一侧对应到46.88μm ，点击这里查看电影节。 。
电影（3）跟踪一个标方在Figure.3第三龄幼虫体壁气管，微管蛋白染色的连续切片。微管蛋白是检测抗α-微管蛋白的抗体和荧光中学（的Alexa Fluor 488）。规模：视频图像的一侧对应到46.88μm ，点击这里查看电影节。 。
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Discussion
要理解复杂的细胞形态如何实现它重要的是要能够准确地检测微管组织。在这里，我们描述了一个强大的免疫组化标签方法检测树突状树枝状感觉神经元的树突的微管组织。除了染色的感觉神经元，这种方法实现了强大的气管，肌肉和其他体壁组织的免疫组化染色。
我们使用此协议，研究开发的DA能神经元的感官树突微管组织。这些树突是非常敏感，受伤或应力25，并打破后，迅速 开始清扫23。开展清扫应在5分钟或更少。在气管和其他体壁组织中的微管更稳定。此协议是改编自14,15神经肌肉接头处的分析准备幼虫鱼片所用，并优化快速fixation后快速剥离。
分析DA能神经元，强大的抗微管蛋白染色，覆肌肉和底层26上皮细胞树突时，可导致一个复杂的染色图案（图1 ，Movie1）。因此，仔细跟踪通过几个连续切片的树突状染色（Movie1），可能需要一个全面的分析，在DA神经元枝蔓乔木微管组织。 MAP1B，Futsch 20,21的具体果蝇同源的单克隆抗体，也可以用来标记微管骨架在果蝇周围神经系统 5,9,20 。 Futsch表示只在神经元，并因此产生一个不太复杂的染色图案，比α-微管蛋白（图2）。绿色荧光蛋白标记内源性头有也被作为DA神经元的树突状微管27的标志使用。使用这些标记是有效的，但应该指出，在轴突末端的日Ë神经肌肉交界处Futsch的专门标签捆绑的微管28。确切Futsch，头，和DA的树突中的微管之间的空间关系尚未得到充分的特点。在这个协议中，我们已经解决了内源性的微管组织。它也可以使用绿色荧光蛋白标记的头或微管蛋白的过度表达的标签微管。应注意对意料之外的表型诱导过度表达方法时， 使用 29 。
在我们的手中，才能最好地实现DA能神经元和其他体壁组织中的微管的免疫组化染色时用于检测抗-微管蛋白的抗体的二次抗体耦合的Alexa Fluor 488很容易，如可视化荧光团。因此，使用转基因工具标签DA能神经元具有抗微管蛋白通过Gal4/UAS系统，LexA系统，或在MARCM 23和MARCM衍生工具的标签，例如在演唱时，我们宁愿标志蛋白光谱重叠了这个中学，作为mCD8：樱桃和mCD8：：KO。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢理化学研究所的资金。 P10 - GAL4阿兰文森特（保罗萨巴蒂尔大学，法国图卢兹）是一种礼物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
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