Summary
Чтобы понять, как сложные формы клеток, например, нейронных дендритов, достигаются в процессе развития, важно, чтобы быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для изучения организации микротрубочек дендритных разветвление дендритов нейронов сенсорных, трахея, мышцы и другие
Abstract
Чтобы понять, как различия в сложной формы ячейки достигнута, важно точно следовать микротрубочек организации. Тела дрозофилы личиночной стены состоит из нескольких типов клеток, которые являются моделями для изучения клеток и тканей морфогенеза. Например трахеи используются для изучения морфогенеза трубки 1, и дендритные разветвление (DA) сенсорных нейронов личинки дрозофилы стали основной системы для выяснения общих и нейрон-класс-специфические механизмы дендритных 2-5 дифференциация и перерождение 6 .
Форма дендритов ветви могут существенно различаться между нейроном классы, и даже между различными ветвями одного нейрона 7,8. Генетические исследования в нейронах Д. А. предполагают, что дифференциальные цитоскелета организация может лежать в основе морфологических различий в дендритные формы филиала 4,9-11. Мы обеспечиваем надежный метод маркировки для иммунологическихssay в естественных условиях микротрубочек организации в Д.А. сенсорного нейрона дендритов беседки (рис. 1, 2, фильм 1). Этот протокол иллюстрирует вскрытие и иммунной первой взрослой личинки, этап, когда активной сенсорной вырост дендрита нейрона и ветвление организации происходит 12,13.
В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной маркировки организации микротрубочек в мышцах (Видео 2, 3), трахеи (рис. 3, Movie 3), и других тканей стенки тела. Он ценен для следователей желающих анализировать микротрубочек организации на местах в стенке тела при исследовании механизмов, ткани контроля и формы клеток.
Protocol
1. Подготовка реагентов
Примечания Перед началом: Разбор и иммуногистохимического окрашивания осуществляется в магнитных камеры и личинка возлагали вниз, используя специальную форму контакта насекомого. Подробные инструкции по строительству магнитной камеры, и подготовка этих выводов можно найти в соответствующих ссылок 14,15. Короче говоря, отверстие 1x1cm квадратных разрезается на магнитных листа и покровного прикреплена к задней части листа, чтобы сделать небольшую камеру. Стенками камеры герметизированы эпоксидным клеем, после этого клей установил камеру несколько раз промывают 70% этанолом перед использованием. Препарирование контакты насекомых готовы, сгибая в нужную форму, а затем наклеиваются на металл вкладку 14,15. В качестве альтернативы металла вкладку, мы использовали перевернутый с плоской головкой стали канцелярская кнопка с ручкой из отсечки желтый наконечник. Использование этого магнитного расположения камеры позволяет тщательный контроль ОвеГ контактный позиционирования и растяжения тканей во время вскрытия.
Чтобы управлять экспрессией гена-репортера в различных подмножеств Д. А. следователи нейроны могут использовать несколько различных Gal4 линий (обобщены Шимоном и его коллеги 16). Многие из этих линий можно получить в общественных центрах акций. В этом представительном протокол, мы осуществляем иммунной линии, в которых два противоположных класса DA нейрона совместно называются: самый простой класс я и самый сложный класс IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-оранжевый (КО)).
- Подготовка Ca + +-бесплатный HL3.1 солевой
- В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2 19. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C. Примечание: Ca + +-бесплатное решение предотвращает сокращение мышц во время вскрытия.
- Подготовка 2x буфера PHEM
- В мм: 130 ТРУБЫ, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, рН 7,0. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
Примечание: Эти материалы не растворяются, пока рН подходы 7.0.
- В мм: 130 ТРУБЫ, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, рН 7,0. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
- Подготовка фиксирующие только что непосредственно перед фиксацией.
- Для того чтобы подготовить 25 мл раствора, первый параформальдегида 2g смеси, 100 мкл 1М NaOH и 10 мл воды в 50 мл трубки Falcon.
- Встряхните фиксатором в 55 ° С водяной бане с шейкер, пока раствор не станет прозрачным. (Общий объем составит около 11,5 мл.)
- Прохладный фиксатором на льду.
- Добавить 12.5ml 2x буфера PHEM.
- Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 1М HCl.
- Заполните раствор водой до объема 25 мл.
- Фильтры решения с использованием ватмана.
2. Личинки вскрытия
Обратите внимание, перед началом: микротрубочек сетей, и особенно те, в сенсорных дендритов, будет пробой быстро после начала вскрытия. Переменный токhieving быстрого вскрытия менее чем за пять минут с последующей немедленной фиксации являются ключевыми факторами в успехе этого протокола.
- Вымойте личинки в воде и быстро переместить их в это падение, используя цикл волос.
- Восток личинки спинной стороной вверх и брюшной стороны на стекле. Примечание: Это направление заключается в изучении нейронов вентральной кластера. Изучить спинной нейронов кластера, инвертировать ориентации.
- Использование центра насекомых-контактный к контакту переднем конце близ устья крючков. Место контактный близко к концу для лучшего результата.
- Место каплю физиологического раствора в HL3.1 вскрытия камеры.
- Вырезать очень заднего конца личинки прочь с microscissors. Примечание: Этот шаг открывает отверстие на заднем конце тела личинки, которая позволит доступ для microscissors (шаг 2.7).
- Захватите с пинцетом области кишечника, который сейчас торчат из диафрагмы на заднем конце личинки. Аккуратно вытащить весь кишечник.
- Местокончика одного лезвия microscissors через диафрагму и разрезать вдоль вентральной срединной линии по отношению к передней.
- Использование угол контакта, контакт теперь свободна углов, задних, а затем передние. Одновременно мягко растянуть открытых личиночной филе.
3. Фиксация, блокирование, окрашивания и монтажа личинок филе
Примечания Перед началом: Все фиксации и окрашивания шаги осуществляются в рассечение камеры. Во время этого процесса, будьте осторожны, чтобы не сбить насекомое контакты проведения личинки так как это может привести к повреждению тканей. Чтобы предотвратить эксперимент от высыхания, все делайте окрашивание шаги в небольшой контейнер Tupperware окружении смоченной ткани.
- Аспирируйте Ca + +-бесплатный HL3.1 буфер, используя желтый наконечник. Сразу же добавить фиксатор с использованием другого pipetteman.
- Аккуратно пипетку вверх и вниз, смешать с фиксатором оставшиеся следы Ca + +-бесплатный HL3.1 буферв камере. Сразу аспирата, а затем добавить свежий фиксатором в камеру.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
- Вымойте 6x 10 минут в PBST (0,1% Тритон Х-100 в PBS).
- Блок с 5% сыворотки козьего в PBST в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Замените блокирующий раствор с первичными антителами разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Первичных антител использовали с помощью мыши анти-α-тубулина (DM1A) и крысы анти-CD8 (5H10), как разбавленный 1 / 1000.
Примечание: следователь, возможно, пожелают заменить мышь анти-α-тубулина (DM1A) с мышью против Futsch (22C10) 20,21 разбавленного 1 / 1000 в некоторых обстоятельствах (см. обсуждение).
- Выдержите в течение ночи (по крайней мере 16 ч) при 4 ° C.
- Вымойте 6x 10 минут в PBST.
- Добавить вторичных решение антител разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Вторичные антитела, используемые Alexa Fluor 488 антимышиного IgG и Cy3 осла анти-IgG крысы. Держите выборка охватывала для предотвращения флуорофорафото-отбеливание 22.
- Инкубируйте либо при комнатной температуре в течение двух часов или на ночь при 4 ° C следует один час при комнатной температуре.
- Вымойте 6x 10 минут в PBST.
- Место личиночной филе на слайде кутикулы стороной вниз, смонтировать в 80% глицерина, и печатью сторон покровным лаком для ногтей для 'быстрый' горе.
Примечание: Для улучшения очистки ткани, и постоянный стабильный образец, смонтировать в DPX, как описано выше 23.
4. Представитель Результаты:
Флуоресцентные окрашивание рассматривается в соответствии с конфокальной микроскопии. На рисунках 1-2, различных отраслей в дендритных беседки имеют различные цитоскелета организации. На рисунке 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти α-тубулина антител и фторescent вторичные (Alexa Fluor 488). Основные отрасли являются позитивными для тубулина, некоторые тонкие ветки стороне тубулина-отрицательными. Фильм 1 представляет собой набор серийных срезов через аналогичный окрашивание класса я Д. А. нейрона. На рисунке 2 показана область вала IV класса DA нейронов окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Рисунок 3. Трахеи в личиночной стенкой тела показывают сложную организацию микротрубочек. Фильмы 2 и 3 показаны серийные участки окрашивания через стенки тела мышцы и трахеи.
Рисунок 1. Рис. 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти-и-Tubuliн антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Панели переменного тока последовательного конфокальной Z-секций (0.5μm), С ^-С ", одного меченых антител с панели C. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) микротрубочки выделены. Красной выделить наконечники стрел микротрубочек в основной эпителиальных клеток.
Рисунок 2. Рис. 2 показаны аналогичные область беседке класса IV да нейрона окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Futsch определяется с помощью анти-Futsch антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) Futsch выделены.
Рисунок 3. Трахея окрашивали анти-тубулина протокол, описанный выше. Это личинка третьего возраста и расчлененным, как описано выше 23,24. Movie 3 показан увеличенный серийных срезов с поля отмечены площади.
Фильм 1. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания всей дендритных беседки из класса я нейрона. Вся беседка отмечен mCD8:: KO (Magenta) и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина (зеленый) определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Фильм 2. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в совет директорову стены мышцы третьего взрослой личинки. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Фильм 3. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в стенке тела трахеи третьей взрослой личинки, отмеченные площади рис.3. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы понять, как клеточный комплекс форм достигается очень важно быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для анализа организации микротрубочек дендритных разветвление нейрона сенсорными дендритов. В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной immunohistological окрашивание трахея, мышцы и другие ткани стенки тела.
Мы используем этот протокол для изучения организации микротрубочек в разработке сенсорных дендриты нейронов DA. Эти дендриты очень чувствительны к травме или стресса 25, а сломать быстро после начала вскрытия 23. Вскрытие должно быть проведено в течение пяти минут или меньше. Микротрубочек в трахее и других тканей стенки тела являются более стабильными. Этот протокол адаптирован от используемых подготовить личиночной филе для анализа нервно-мышечном соединении 14,15, и оптимизирован для быстрого еixation после быстрого вскрытия.
При анализе дендриты нейронов Д.А., надежные анти-тубулина окрашивания в вышележащие мышцы, и основные клетки эпителия 26 может привести к сложным окрашиванием (рис. 1, Movie1). Поэтому осторожность трассировки дендритных окрашивание через несколько последовательных секций (Movie1) могут потребоваться для полного анализа микротрубочек организации в Д.А. нейрона дендритов беседке. Моноклональные антитела к конкретным гомолог дрозофилы из MAP1B, Futsch 20,21, также может быть использован для обозначения микротрубочек цитоскелета в дрозофилы периферической нервной системы 5,9,20. Futsch выражается только в нейронах и, следовательно, она производит менее сложный узор, чем окрашивание α-тубулина (рис. 2). GFP-меченых эндогенного-Тау была также использована в качестве маркера дендритных Д. А. нейрона микротрубочек 27. Использование этих маркеров является эффективным, но следует отметить, что в аксон-концов из-йэлектронной нервно-мышечном соединении Futsch специально этикетки комплекте микротрубочек 28. Точные пространственные отношения между Futsch, Тау и микротрубочек в дендритах DA еще не полностью описана. В этом протоколе мы обратились эндогенной организации микротрубочек. Кроме того, можно маркировать микротрубочек использованием гиперэкспрессия GFP меткой Тау или тубулина. Следует проявлять осторожность в отношении вызывающие непредвиденные фенотипов, когда гиперэкспрессия подходы используются 29.
В наших руках, иммуногистохимического окрашивания микротрубочек в нейронах Д. А. и других тканей стенки тела лучше всего достигается, когда вторичные антитела используются для обнаружения анти-тубулина первичное антитело связывается с легко визуализировать флуорофора, такие как Alexa Fluor 488. Следовательно, при использовании трансгенных инструменты для обозначения DA нейронов в концерте с анти-тубулина маркировки, например, через систему Gal4/UAS, LexA системы, или в MARCM 23 и MARCM производных, мы предпочитаем маркеров белков сиз спектральных пересекается с этим вторичные, такие как mCD8:: Вишня и mCD8:: KO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим RIKEN для финансирования. P10-Gal4 был своего рода подарок Алена Винсент (Университет Поля Сабатье, Тулуза, Франция).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , Oxford University Press. (1911).
- London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
- Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
- Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
- Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
- Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
- Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
- Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
- Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
