Summary
För att förstå hur komplexa cell former som neuronala dendriter, uppnås under utveckling är det viktigt att kunna korrekt analys mikrotubuli organisation. Här beskriver vi ett robust immunohistological märkning metod för att undersöka mikrotubuli organisation av dendritiska sensoriska arborization neuron dendriter, luftstrupe, muskler och andra
Abstract
För att förstå hur skillnader i komplexa cell former uppnås är det viktigt att noggrant följa mikrotubuli organisation. Det Drosophila larvkroppen vägg innehåller flera celltyper som är modeller för att studera celler och vävnader morfogenes. Till exempel tracheae används för att undersöka rör morfogenes 1 och dendritiska arborization (DA) sensoriska nervceller i Drosophila larven har blivit ett primärt system för belysning av allmänna och neuron-class-specifika mekanismer av dendritiska differentiering 2-5 och degeneration 6 .
Formen på Dendrite grenar kan variera kraftigt mellan neuron klasser, och även mellan olika grenar av en enda neuron 7,8. Genetiska studier i Da nervceller tyder på att skillnaden cytoskelettala organisation kan ligga till grund för morfologiska skillnader i dendritiska gren form 4,9-11. Vi erbjuder en robust metod immunologiska märkning för att enssay in vivo mikrotubuli organisation i DA sensoriska neuron Dendrite berså (figur 1, 2, Movie 1). Detta protokoll illustrerar dissekering och immunfärgning första INSTAR larv, ett stadium då aktiv sensoriska neuron Dendrite utväxt och förgrenade organisation sker 12,13.
Förutom färgning sensoriska nervceller, uppnår denna metod robusta märkning av mikrotubuli organisation i musklerna (Movies 2, 3), luftstrupe (Figur 3, Movie 3) och andra kroppsvävnader vägg. Det är värdefullt för utredare som vill analysera mikrotubuli organisation på plats i kroppen väggen vid utredning av mekanismer som styr vävnader och celler form.
Protocol
1. Beredning av reagens
Anteckningar innan du börjar: Dissection och immunhistokemisk färgning utförs i en magnetisk kammare och larven är låst ner med speciellt formade insekter stift. Detaljerade anvisningar om byggandet av en magnetisk kammare, och beredning av dessa stift finns i referenser 14,15. I korthet är en 1x1cm fyrkantigt hål skärs i en magnetisk plåt och ett täckglas som fästs på baksidan av bladet för att göra en liten kammare. Sidorna av kammaren förseglas med epoxy lim, varefter limmet har satt kammaren tvättas flera gånger med 70% etanol före användning. Dissection insekter stift är förberedda genom att böja till önskad form och sedan limmas på en metall flik 14,15. Alternativt att en metall flik har vi använt en inverterad platt huvud stift stål ritning med ett handtag från en cut-off gul spets. Användning av denna magnetisk kammare arrangemang låter nära kontroll Over pin positionering och vävnad stretching under dissekering.
Att köra uttryck reporter genen i olika undergrupper av DA neuron utredare kan använda flera olika Gal4 linjer (sammanfattas av Shimono och kollegor 16). Många av dessa rader är tillgängliga från offentliga lager centra. I detta representativa protokoll, utför vi immunfärgning av en linje där två kontrasterande klasser av DA neuron är co-märkt: de mest enkla klass I och mest komplexa-klass IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).
- Förbered Ca + +-free HL3.1 koksaltlösning
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sackaros och 5 trehalos, pH 7,2 19. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C. Obs: Ca + +-free-lösning förhindrar muskelsammandragningar under dissekering.
- Förbered 2x PHEM buffert
- I mm: 130 RÖR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C.
Obs: Dessa material löses inte upp tills pH närmar sig 7,0.
- I mm: 130 RÖR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Förbered fixativ nyligen omedelbart före fixering.
- I syfte att förbereda en 25ml lösning, först blanda 2g paraformaldehyd, 100μl 1M NaOH och 10 ml vatten i en 50 ml Falcon rör.
- Skaka fixativ i ett 55 ° C vattenbad med skakare tills lösningen är klar. (Total volym är ca 11,5 ml.)
- Cool fixativ på is.
- Tillsätt 12,5 ml 2x PHEM buffert.
- Justera pH till 7,0 med 1 M HCl.
- Fyll med vatten tills volymen är 25ml.
- Filtrera lösningen med Whatman papper.
2. Larver dissektion
Observera innan du börjar: mikrotubuli nätverk, och särskilt inom sensorisk dendriter, kommer fördelningen snabbt efter inledandet av dissekering. Achieving snabb dissektion på mindre än fem minuter följt av omedelbar fixering är viktiga faktorer för framgång i detta protokoll.
- Tvätta larven i vatten och snabbt flytta dem till denna minskning med hjälp av en slinga av håret.
- Orient larven ryggen uppåt och ventrala sidan på glaset. OBS: Denna inriktning är att undersöka den ventrala klustret nervceller. För att undersöka rygg kluster nervceller, invertera orientering.
- Använd centrum insekt stift till stift den främre änden nära munnen krokar. Placera stift nära slutet för bästa resultat.
- Placera en droppe HL3.1 koksaltlösning i dissekering kammaren.
- Skär mycket bakre spetsen av larven iväg med microscissors. OBS: Detta steg öppnar en öppning i bakre änden av larven som kommer att ge tillgång till microscissors (steg 2,7).
- Ta med pincett regionen tarmen som nu sticker ut från öppningen i den bakre änden av larven. Dra försiktigt ut hela tarmen.
- Placeraspetsen på ett blad av microscissors genom öppningen och skär längs den ventrala mittlinjen mot den främre.
- Använda hörnet stift, stift den nu fria hörn, bakre först, sedan främre. Samtidigt försiktigt tänja öppna larver filén.
3. Fixering, blockering, färgning, och montering av larver filéer
Anteckningar innan du börjar: Alla fixering och steg färgning utförs i dissekering kammaren. Under denna process, vara noga med att inte slå insekten stiften som håller larven eftersom detta kan leda till vävnadsskador. För att förhindra att experimentet torkar ut, göra allt färgning steg i en liten Tupperware behållare omgiven av fuktad vävnader.
- Aspirera Ca + +-free HL3.1 buffert med hjälp av en gul spets. Omedelbart lägga till fixativ med en annan pipetteman.
- Försiktigt pipettera upp och ner att blanda fixativ med de återstående spår av Ca + +-free HL3.1 bufferti kammaren. Omedelbart aspirera den och sedan lägga till färska fixativ in i kammaren.
- Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
- Tvätta 6x 10mins i PBST (0,1% Triton X-100 i PBS).
- Block med 5% get serum i PBST i 20 minuter vid RT.
- Byt ut den blockerande lösningen med primära antikroppar utspädd i 5% get serum i PBST. De primära används antikroppar mus-anti-α-tubulin (DM1A) och råtta anti-CD8 (5H10) både utspädd 1 / 1000.
Obs: Utredaren kan vilja ersätta mus-anti-α-tubulin (DM1A) med mus-anti-Futsch (22C10) 20,21 utspädd 1 / 1000 i vissa fall (se diskussion).
- Inkubera över natten (i minst 16 timmar) vid 4 ° C.
- Tvätta 6x 10mins i PBST.
- Lägg sekundär antikropp lösning utspädd i 5% get serum i PBST. De sekundära används antikroppar Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG och Cy3 åsna anti-råtta IgG. Håll provet täckas för att förhindra fluoroforenfoto-blekning 22.
- Inkubera antingen på RT för två timmar, eller över natten vid 4 ° C följt av en timme i rumstemperatur.
- Tvätta 6x 10mins i PBST.
- Placera larver filén på bilden nagelbanden och ner, montera i 80% glycerol och täta sidor täckglas med nagellack för en "snabb" mount.
OBS: För att förbättra vävnad clearing, och en permanent stabil prov montera i DPX som tidigare beskrivits 23.
4. Representativa resultat:
Fluorescerande infärgning undersöktes under ett konfokalmikroskop. I figur 1-2, olika grenar inom en Dendrite berså har olika cytoskelettala organisation. Figur 1 visar en region i bersån en klass IV DA neuron vid 1: a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: och KO påvisas med en anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin detekteras med hjälp av anti α-tubulin antikropp och fluorescent sekundära (Alexa Fluor 488). De viktigaste grenarna är positivt för tubulin, några tunna sidogrenar är tubulin-negativa. Film 1 är en uppsättning seriella delar genom en liknande färgning av en klass I DA neuron. Figur 2 visar en region i bersån en klass IV DA neuron som färgats med antikroppar mot Futsch och CD8 vid 1: a INSTAR larvstadiet. De viktigaste grenarna är Futsch-positiva, några tunna sidogrenar är Futsch-negativa. Figur 3. Tracheae i larvkroppen väggen visar en komplex mikrotubuli organisation. Filmer 2 och 3 visar seriella delar av färgning i muskler kroppen vägg och luftstrupe.
Figur 1. Fig. 1 visar en region i bersån en klass IV DA neuron vid 1: a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: KO och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin upptäcks med hjälp av anti-&-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa 488). Paneler AC sekventiell konfokala Z-profiler (0.5μm), C'-C ", enda antikropp fläckar från panel C. Exempel på grenar med (gul pil) eller utan (lila pilspets) mikrotubuli är markerade. Röda pilspetsar markerar mikrotubuli i den underliggande epitelceller.
Figur 2. Fig. 2 visar en liknande region i bersån en klass IV da neuron som färgats med antikroppar mot Futsch och CD8 vid 1: a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: KO och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Futsch upptäcks med hjälp av anti-Futsch antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa 488). De viktigaste grenarna är Futsch-positiva, några tunna sidogrenar är Futsch-negativa. Exempel på branscher med (gul pil) eller utan (lila pilspets) Futsch är markerade.
Figur 3. Luftstrupe färgas med den anti-tubulin protokoll som beskrivs ovan. Denna larv är tredje INSTAR och dissekeras som tidigare beskrivits 23,24. Movie 3 visar utvidgade seriella avsnitt från fältet markeras med en kvadrat.
Film 1. Serial avsnitt spåra tubulin färgning hela dendritiska berså i en klass I neuron. Hela berså är märkt med mCD8:: KO (Magenta) och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin (Grön) upptäcks med hjälp av en anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.
Film 2. Serial sektioner spåra tubulin färgning i BODy vägg muskler en tredje INSTAR larv. Tubulin upptäcks med hjälp av anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.
Film 3. Serial sektioner spåra tubulin färgning i en kropp vägg luftstrupen i tredje INSTAR larv, märkt med ett torg i Figure.3. Tubulin upptäcks med hjälp av anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att förstå hur komplexa cell former uppnås är det viktigt att kunna korrekt analys mikrotubuli organisation. Här beskriver vi ett robust immunohistological märkning metod för analys mikrotubuli organisation av dendritiska sensoriska arborization neuron dendriter. Förutom färgning sensoriska nervceller, uppnår denna metod robusta immunohistological färgning av luftstrupe, muskler och andra kroppsvävnader vägg.
Vi använder detta protokoll för att undersöka mikrotubuli organisation i u-sensoriska dendriter av DA neuron. Dessa dendriter är mycket känsliga för skada eller stress 25, och bryta ner snabbt efter början av dissekering 23. Dissektion bör genomföras i fem minuter eller mindre. Mikrotubuli i luftstrupen och andra kroppsvävnader väggen är mer stabila. Detta protokoll är anpassad från dem som förbereder larver filéer för analys av den neuromuskulära förbindelsen 14,15, och är optimerad för snabb fixation efter en snabb dissektion.
Vid en analys av dendriter av DA neuron, robust anti-tubulin färgning i överliggande muskler och underliggande epitelceller 26 kan leda till en komplicerad färgningsmönster (figur 1, Movie1). Därför noggrann spårning av dendritiska färgning genom flera seriella sektioner (Movie1) kan krävas för en fullständig analys av mikrotubuli organisation i DA neuron Dendrite berså. Monoklonala antikroppar mot specifika Drosophila homolog av MAP1B, Futsch 20,21, kan också användas för att märka mikrotubuli cytoskelettet i Drosophila perifera nervsystemet 5,9,20. Futsch uttrycks bara i nervceller och därmed den producerar en mindre komplicerad färgningsmönstret än α-tubulin (Figur 2). GFP-märkta-endogen-Tau har också använts som en markör av DA neuron dendritiska mikrotubuli 27. Användning av dessa markörer är effektivt, men det bör noteras att i axonet-ändstationer the neuromuskulära förbindelsen Futsch etiketter specifikt medföljande mikrotubuli 28. Den exakta rumsliga relationer mellan Futsch, Tau och mikrotubuli i Da dendriter är ännu inte helt beskrivas. I detta protokoll har vi riktat endogena mikrotubuli organisation. Det är också möjligt att märka mikrotubuli med hjälp av överuttryck av GFP taggade Tau eller tubulin. Försiktighet bör vidtas mot inducera oförutsedda fenotyper när överuttryck metoder används 29.
I våra händer är immunhistokemisk färgning av mikrotubuli i Da nervceller och andra kroppsvävnader vägg bäst när den sekundära antikroppar används för att upptäcka anti-tubulin primära antikroppen är kopplad till en lätt-visualiseras fluoroforen såsom Alexa Fluor 488. Därför när du använder transgena verktyg för att märka DA neuron i samförstånd med anti-tubulin märkning t.ex. via Gal4/UAS systemet, Lexa systemet, eller i MARCM 23 och MARCM derivat, föredrar vi markör proteiner medur spektral överlappning med denna sekundära, såsom mCD8:: Cherry och mCD8:: KO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar RIKEN för finansiering. P10-Gal4 var en sorts gåva av Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankrike).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , Oxford University Press. (1911).
- London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
- Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
- Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
- Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
- Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
- Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
- Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
- Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
