Summary
For at forstå, hvordan komplekse celle former, såsom neuronal dendritter, er opnået under udviklingen, er det vigtigt at være i stand til præcist at analysen mikrotubuli organisation. Her beskriver vi en robust immunohistological mærkning metode til at undersøge mikrotubuli organisering af dendritiske arborization neuron sensoriske dendritter, luftrør, muskler og andre
Abstract
For at forstå, hvordan forskelle i komplekse celle figurer er opnået, er det vigtigt præcist at følge mikrotubuli organisation. Det Drosophila Larvetilstand kroppen væggen indeholder flere celletyper, der er modeller til at studere celler og væv morfogenese. For eksempel tracheae bruges til at undersøge rør morfogenese 1, og de dendritiske arborization (DA) sensoriske neuroner i det Drosophila larve er blevet et primært system til belysning af generelle og neuron-klasse-specifikke mekanismer af dendritiske differentiering 2-5 og degeneration 6 .
Formen på dendritceller grene kan variere betydeligt mellem neuron klasser, og endda mellem forskellige grene af en enkelt neuron 7,8. Genetiske undersøgelser i DA neuroner tyder på, at forskellen cytoskeletal organisation kan ligge til grund morfologiske forskelle i dendritiske gren form 4,9-11. Vi leverer en solid immunologisk mærkning metode på enssay in vivo mikrotubuli organisation i DA sensoriske neuron dendritceller Arbor (figur 1, 2, Movie 1). Denne protokol illustrerer dissektion og immunfarvning første instar larve, et stadie, hvor aktiv sensoriske neuron dendritceller udvækst og forgrenet organisation er forekommende 12,13.
I tillæg til farvning sensoriske neuroner, opnår denne metode robuste mærkning af mikrotubuli organisation i musklerne (film 2, 3), luftrør (Figur 3, Movie 3), og andre organer væg væv. Det er værdifuldt for efterforskerne, der ønsker at analysere mikrotubuli organisation in situ i kroppen væggen, når undersøge mekanismer, der styrer væv og celler form.
Protocol
1. Forberedelse af reagenser
Bemærkninger, før du begynder: Dissektion og immunhistokemisk farvning udføres i en magnetisk kammer, og larven er holdt nede ved hjælp af særligt formede insekt ben. Detaljerede instruktioner om opførelsen af en magnetisk kammer, og udarbejdelse af disse stifter kan findes i referencer 14,15. Kort fortalt er en 1x1cm firkantet hul skåret i en magnetisk plade og et dækglas anbringes på bagsiden af arket for at lave en lille kammer. Siderne af kammeret er forseglet med epoxy lim, efter at denne lim har sat kammeret er vasket flere gange med 70% ethanol før brug. Dissektion insekt ben er forberedt ved at bøje til den ønskede form og derefter limet på en metal fane 14,15. Alternativt til et metal fane, har vi brugt en omvendt flad-head stål tegnestift med et håndtag lavet af en cut-off gul spids. Brug af denne magnetisk kammer arrangement giver mulighed for tæt kontrol over pin positionering og væv strække under dissektion.
Til at drive reporter genekspression i forskellige delgrupper i DA neuroner efterforskere kan bruge flere forskellige Gal4 linjer (sammenfattet af Shimono og kolleger 16). Mange af disse linjer er tilgængelige fra offentlige lager centre. I denne repræsentative protokol, udfører vi immunfarvning af en linje, hvor to kontrasterende klasser af DA neuron er co-mærket: den mest simple-klasse I og mest komplekse-klasse IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).
- Forbered Ca + +-fri HL3.1 saltvand
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 saccharose, og 5 trehalose, pH 7,2 19. Filter-steriliseres og opbevares ved 4 ° C. Bemærk: Ca + +-fri løsning forebygger muskel sammentrækning under dissektion.
- Forbered 2x PHEM buffer
- I mm: 130 RØR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Disse materialer vil ikke opløse indtil pH nærmer sig 7,0.
- I mm: 130 RØR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered fiksativ frisk umiddelbart før fiksering.
- For at forberede en 25ml løsning, første mix 2g paraformaldehyd, 100μl 1M NaOH og 10 ml vand i en 50 ml Falcon rør.
- Shake fiksativ i en 55 ° C vandbad med shaker, indtil opløsningen er klar. (Total volumen vil blive cirka 11,5 ml.)
- Cool fiksativ på is.
- Tilføj 12.5ml 2x PHEM buffer.
- Justér pH til 7,0 med 1M HCl.
- Fyld løsning med vand, indtil lydstyrken er 25ml.
- Opløsningen filtreres ved hjælp af Whatman papir.
2. Larver dissektion
Bemærk, før du begynder: mikrotubulære netværk, og især dem i sensorisk dendritter, vil opdeling hurtigt efter indledningen af dissektion. Achieving hurtige dissektion på mindre end fem minutter efterfulgt af øjeblikkelig fiksering er centrale faktorer for succes i denne protokol.
- Vask larve i vand og hurtigt flytte dem ind i dette fald ved hjælp af en sløjfe af hår.
- Vend larve dorsalsiden op, og den ventrale side på glasset. Bemærk: Denne orientering er at undersøge den ventrale klyngen neuroner. At undersøge dorsal klynge neuroner, invertere orientering.
- Brug den midterste insekt-stift til stift den forreste ende i nærheden af munden kroge. Anbring pin tæt på slutningen for de bedste resultater.
- Placer en dråbe HL3.1 saltvand i dissektion kammeret.
- Skær meget bageste spids på larve af med microscissors. Bemærk: Dette trin åbner en blænde på den bageste ende af larve, der vil give adgang til microscissors (trin 2,7).
- Grab med pincet regionen tarmen, der nu stikker ud af blænde på den bageste ende af larve. Træk forsigtigt hele tarmen.
- Placerspidsen af en kniv af microscissors gennem åbningen og skær langs den ventrale midterlinjen mod den forreste.
- Brug hjørnet stifter, den nu frie hjørner, posterior først, derefter anterior pin. Samtidig forsigtigt strække åbne larver fileten.
3. Fiksering, blokering, farvning og montering af larvestadiet fileter
Bemærkninger, før du begynder: Alle fiksering og farvning skridt er udført i dissektion kammeret. Under denne proces, være forsigtig med ikke at banke insektet benene holder larven, da dette kan føre til vævsskader. For at forhindre forsøget tørrer ud, gøre alt farvning trin i en lille Tupperware beholder omgivet af fugtet væv.
- Aspirer Ca + +-fri HL3.1 buffer ved hjælp af en gul spids. Umiddelbart tilføje fiksativ med en anden pipetteman.
- Forsigtigt pipetten op og ned for at blande fiksativ med de resterende spor af Ca + +-fri HL3.1 bufferi kammeret. Umiddelbart aspirer det og derefter tilføje frisk fiksativ ind i kammeret.
- Inkubér ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Vask 6x 10 min i PBST (0,1% Triton X-100 i PBS).
- Blok med 5% ged serum i PBST i 20 min ved RT.
- Udskift blokerende opløsning med primære antistoffer fortyndet i 5% ged serum i PBST. De primære anvendte antistoffer er muse anti-α-tubulin (DM1A) og rotter anti-CD8 (5H10) begge fortyndet 1 / 1000.
Bemærk: Investigator kan ønske at erstatte mus anti-α-tubulin (DM1A) med muse anti-Futsch (22C10) 20,21 fortyndet 1 / 1000 i visse tilfælde (se diskussionen).
- Inkuber natten over (mindst 16 timer) ved 4 ° C.
- Vask 6x 10 min i PBST.
- Tilføj sekundært antistof løsning fortyndes i 5% ged serum i PBST. De sekundære anvendte antistoffer er Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG og Cy3 æsel anti-rotte IgG. Hold prøven tildækkes for at forhindre fluoroforenfoto-blegning 22.
- Inkuber enten på RT i to timer, eller natten over ved 4 ° C efterfulgt af en time ved stuetemperatur.
- Vask 6x 10 min i PBST.
- Placer Larvetilstand fileten på diaset neglebånd nedad, monteres i 80% glycerol, og forsegl sider af dækglasset med neglelak for en 'hurtig' mount.
Bemærk: For forbedret væv clearing, og en permanent stabil prøve, som monteres i DPX tidligere beskrevet 23.
4. Repræsentative resultater:
Fluorescensfarvede blev undersøgt under et konfokal mikroskop. I figur 1-2, forskellige grene inden for en dendritceller løvhytte har forskellige cytoskeletal organisation. Figur 1 viser en region i løvhytte af klasse IV DA neuron på 1 m instar larvestadiet. Hele Lysthuset er markeret med mCD8:: KO og detekteres ved brug af en anti-CD8 antistof og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin er opdaget ved hjælp af anti α-tubulin antistof og fluorescent sekundære (Alexa Fluor 488). De vigtigste grene er positive for tubulin, nogle tynde sidegrene er tubulin-negative. Movie 1 er et sæt af serielle snit gennem en lignende farvning af en klasse jeg da neuron. Figur 2 viser en region i løvhytte af klasse IV DA neuron farvet med antistoffer mod Futsch og CD8 på 1 m instar larvestadiet. De vigtigste grene er Futsch-positive, nogle tynde sidegrene er Futsch-negative. Figur 3. Tracheae i larvestadiet kroppen væggen viser en kompleks mikrotubuli organisation. Film 2 og 3 viser serielle dele af farvning gennem kroppen væg muskler og luftrør.
Figur 1. Fig. 1 viser en region i løvhytte af klasse IV DA neuron på 1 m instar larvestadiet. Hele Lysthuset er markeret med mCD8:: KO og påvises ved hjælp af anti-CD8 antistof og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin detekteres ved hjælp af anti-&-tubulin antistof og fluorescerende sekundære (Alexa 488). Paneler AC sekventiel konfokal z-sektioner (0.5μm), C'-C ", enkelt antistof pletter fra panel C. Eksempel på grene med (gul pilespids) eller uden (lilla pilespids) mikrotubuli er fremhævet. Red pilespidser fremhæve mikrotubuli i de underliggende epitelceller.
Figur 2. Fig. 2 viser en tilsvarende region i løvhytte af klasse IV da neuron farvet med antistoffer mod Futsch og CD8 på 1 m instar larvestadiet. Hele Lysthuset er markeret med mCD8:: KO og påvises ved hjælp af anti-CD8 antistof og fluorescerende sekundære (Cy3). Futsch detekteres ved hjælp af anti-Futsch antistof og fluorescerende sekundære (Alexa 488). De vigtigste grene er Futsch-positive, nogle tynde sidegrene er Futsch-negative. Eksempel på grene med (gul pilespids) eller uden (lilla pilespids) Futsch er fremhævet.
Figur 3. Luftrør farves ved hjælp af anti-tubulin-protokol, der er beskrevet ovenfor. Denne larve er den tredje instar og dissekeret som tidligere beskrevet 23,24. Movie 3 viser forstørret serielle sektioner fra marken markeret med en firkant.
Movie 1. Serial sektioner sporing tubulin farvning hele dendritiske løvhytte af en klasse jeg neuron. Hele Lysthuset er markeret med mCD8:: KO (Magenta) og påvises ved hjælp af anti-CD8 antistof og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin (grøn), påvises ved hjælp af en anti-α-tubulin antistof og fluorescerende sekundære (Alexa Fluor 488). Skala: den ene side af videobilledet svarer til 46.88μm i afsnittet. Klik her for at se filmen.
Movie 2. Seriel sektioner sporing tubulin farvning i BODy væg muskler af en tredje instar larve. Tubulin detekteres ved hjælp af anti-α-tubulin antistof og fluorescerende sekundære (Alexa Fluor 488). Skala: den ene side af videobilledet svarer til 46.88μm i afsnittet. Klik her for at se filmen.
Movie 3. Serial sektioner sporing tubulin farvning i et organ væg luftrøret af en tredje instar larve, der er markeret med en firkant i Figure.3. Tubulin detekteres ved hjælp af anti-α-tubulin antistof og fluorescerende sekundære (Alexa Fluor 488). Skala: den ene side af videobilledet svarer til 46.88μm i afsnittet. Klik her for at se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at forstå, hvordan komplekse celle figurer er nået, er det vigtigt at være i stand til præcist at analysen mikrotubuli organisation. Her beskriver vi en robust immunohistological mærkning metode til analyse mikrotubuli organisering af dendritiske arborization neuron sensoriske dendritter. I tillæg til farvning sensoriske neuroner, opnår denne metode robuste immunohistological farvning af luftrøret, muskler og andre organer væg væv.
Vi bruger denne protokol til at undersøge mikrotubuli organisation i at udvikle sensoriske dendritter af DA neuroner. Disse dendritter er meget følsomme over for skader eller stress 25, og nedbryde hurtigt efter begyndelsen af dissektion 23. Dissektion bør være gennemført i fem minutter eller mindre. Mikrotubuli i luftrøret og andet organ væg væv er mere stabil. Denne protokol er tilpasset fra dem, der anvendes forberede larvernes fileter til analyse af den neuromuskulære junction 14,15, og er optimeret til hurtig fixation efter en hurtig dissektion.
Når man analyserer dendrites af DA neuroner, robust anti-tubulin farvning i overliggende muskler, og underliggende epitelceller 26 kan føre til et kompliceret farvningsmønster (figur 1, movie1). Derfor omhyggelig sporing af dendritiske farvning gennem flere serielle sektioner (movie1) kan være nødvendig for en fuldstændig analyse af mikrotubuli organisation i DA neuron dendritceller lysthus. Monoklonale antistoffer til de specifikke Drosophila homolog af MAP1B, Futsch 20,21, kan også bruges til at mærke det mikrotubulære cytoskeleton i Drosophila perifere nervesystem 5,9,20. Futsch er kun udtrykt i neuroner og dermed det producerer en mindre kompliceret farvningsmønster end α-tubulin (Figur 2). GFP-mærkede endogen-Tau er også blevet brugt som en markør af DA neuron dendritiske mikrotubuli 27. Brug af disse markører er effektiv, men det bør bemærkes, at Axon-endestationer the neuromuskulære junction Futsch specifikt etiketter bundtede mikrotubuli 28. Den præcise rumlige forhold mellem Futsch, Tau, og mikrotubuli i DA dendritter er endnu ikke fuldt karakteriseret. I denne protokol har vi rettet endogene mikrotubuli organisation. Det er også muligt at mærke mikrotubuli ved hjælp af overekspression af GFP mærkede Tau eller tubulin. Der bør udvises forsigtighed mod at fremkalde uventede fænotyper, når overekspression tilgange anvendes 29.
I vores hænder, er immunhistokemisk farvning af mikrotubuli i DA neuroner og andet organ væg væv bedst opnås, når de sekundære antistoffer anvendes til at påvise anti-tubulin primære antistof er koblet til en let-visualiseret fluoroforen såsom Alexa Fluor 488. Derfor, når du bruger transgene værktøjer til at mærke DA neuroner i samråd med anti-tubulin mærkning fx via Gal4/UAS systemet, Lexa-system, eller i MARCM 23 og MARCM derivater, foretrækker vi markørproteiner medud spektral overlapning med denne sekundære, såsom mCD8:: Cherry og mCD8:: KO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Riken til finansiering. P10-Gal4 var en slags gave Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankrig).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
References
- Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , Oxford University Press. (1911).
- London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
- Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
- Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
- Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
- Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
- Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
- Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
- Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
