Summary
Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e outros
Abstract
Para entender como as diferenças de formas complexas de células são alcançados, é importante seguir precisamente organização de microtúbulos. A Drosophila parede do corpo larval contém vários tipos de células que são modelos para o estudo celular e morfogênese do tecido. Por exemplo traquéias são usados para examinar morfogênese tubo 1, ea arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larva Drosophila tornaram-se um sistema primário para a elucidação da geral e neurônio-específico de classe mecanismos de diferenciação 05/02 dendríticas e degeneração 6 .
A forma de ramos dendríticos podem variar significativamente entre as classes de neurônios, e até mesmo entre os diferentes ramos de um único neurônio 7,8. Estudos genéticos em neurônios DA sugerem que a organização do citoesqueleto diferencial pode subjacentes diferenças morfológicas na forma ramo dendríticas 4,9-11. Nós fornecemos um método de etiquetagem robusta imunológica a umssay in vivo organização de microtúbulos em DA neurônio sensorial dendrite arbor (Figuras 1, 2, Movie 1). Este protocolo ilustra a dissecção e imunomarcação de larva de primeiro ínstar, uma fase em conseqüência dendrito ativo neurônio sensorial e organização ramificação está ocorrendo 12,13.
Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém etiquetagem robusta de organização de microtúbulos nos músculos (Filmes 2, 3), traquéia (Figura 3, Movie 3), e tecidos outra parede do corpo. É valioso para pesquisadores que desejam analisar a organização de microtúbulos in situ na parede do corpo quando se investiga os mecanismos que o tecido de controle e forma da célula.
Protocol
1. Preparação de reagentes
Notas antes de começar: dissecção e coloração imuno-histoquímica são realizadas em uma câmara magnética ea larva é preso utilizando os pinos de insetos com formato especial. Instruções detalhadas sobre a construção de uma câmara magnética, ea preparação desses pinos pode ser encontrada nas referências relacionadas 14,15. Em resumo, um buraco quadrado 1x1cm é cortada em uma folha magnética e uma lamela afixada na parte traseira da folha para fazer uma pequena câmara. Os lados da câmara são selados com cola epóxi, após esta cola não definiu a câmara é lavado várias vezes com etanol 70% antes de usar. Pinos de insetos dissecção são preparados por flexão na forma requerida e então colados em uma guia de metal 14,15. Em alternativa a uma guia de metal, temos utilizado uma invertida de cabeça chata pin desenho de aço com uma alça feita a partir de uma ponta de corte amarela. O uso deste arranjo câmara magnética permite fechar controle over posicionamento do pino e do tecido que se estende durante a dissecção.
Para dirigir a expressão do gene repórter em subconjuntos diferentes de investigadores DA neurônios pode usar várias linhas diferentes Gal4 (resumido por Shimono e colegas 16). Muitas dessas linhas estão disponíveis em centros de estoque público. Neste protocolo representante, realizamos imunocoloração de uma linha em que duas classes contrastantes de DA neurônio são co-marcado: o mais simples de classe I e mais complexo de classe IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).
- Prepare Ca + + livre HL3.1 salina
- Em mM: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sacarose, trealose e 5; pH 7,2 19. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C. Nota: Ca + + livre solução impede a contração muscular durante a dissecção.
- Prepare tampão PHEM 2x
- Em mM: 130 PIPES, HEPES 60, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C.
Nota: Estes materiais não se dissolvem até que a aproximação do pH 7.0.
- Em mM: 130 PIPES, HEPES 60, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C.
- Prepare o fixador recém imediatamente antes da fixação.
- A fim de preparar uma solução de 25ml, paraformaldeído 2g primeiro mix, 100μl 1M NaOH e água 10ml em tubo Falcon 50ml.
- Agite fixador em um banho de água 55 ° C, com agitador até que a solução é clara. (Volume total será de cerca de 11,5 ml.)
- Fixador fresco no gelo.
- Adicionar 12.5ml tampão PHEM 2x.
- Ajustar o pH para 7,0 com HCl 1M.
- Preencha a solução com água até que o volume é 25ml.
- Filtrar a solução usando papel Whatman.
2. Dissecação das larvas
Nota antes de começar: redes de microtúbulos, e em particular os dendritos sensorial, vai colapso rapidamente após o início da dissecção. CAhieving dissecção rápida em menos de cinco minutos, seguida pela fixação imediata são fatores chave para o sucesso deste protocolo.
- Lavar a larva na água e rapidamente movê-los para essa queda usando um laço de cabelo.
- Orientar a larva até lado dorsal e no lado ventral no vidro. Nota: Esta orientação é examinar os neurônios aglomerado ventral. Para examinar os neurônios aglomerado dorsal, inverter a orientação.
- Utilizar o centro de insetos pino a pino a extremidade anterior perto da boca ganchos. Coloque o pino perto do fim para obter melhores resultados.
- Coloque uma gota de solução salina HL3.1 na câmara de dissecção.
- Cortar a ponta posterior da larva fora com microtesoura. Nota: Este passo abre uma abertura na parte posterior da larva que irá permitir o acesso para a microtesoura (passo 2.7).
- Pegar com a pinça a região do intestino que agora está saindo da abertura na extremidade posterior da larva. Retire cuidadosamente o intestino todo.
- Coloque oponta de uma lâmina do microtesoura através da abertura e corte ao longo da linha mediana ventral para o anterior.
- Utilizando os pinos de canto, pinos nos cantos agora livre, posterior primeiro, depois anterior. Simultaneamente esticar suavemente abrir o filé larval.
3. Fixação, o bloqueio, coloração e montagem de filetes larval
Notas antes de começar: Todos os passos de fixação e coloração são realizadas na câmara de dissecção. Durante este processo, tome cuidado para não bater os pinos de insetos segurando a larva, pois isso pode levar a danos nos tecidos. Para evitar a experiência de secar, faça todos os passos coloração em um recipiente Tupperware pequena, rodeada por lenços umedecidos.
- Aspirar o Ca + + livre HL3.1 buffer usando uma ponta amarela. Imediatamente adicione o fixador usando outro pipetteman.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar o fixador com os traços remanescentes de Ca + + livre HL3.1 tampãona câmara. Imediatamente aspirado-lo e em seguida, adicione fixador fresco para dentro da câmara.
- Incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
- Lavar 10mins 6x no PBST (0,1% Triton X-100 em PBS).
- Bloco com soro de cabra 5% em PBST por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Substitua a solução de bloqueio com anticorpos primários diluídos em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos primários utilizados são mouse anti-α-tubulina (DM1A) e de ratos anti-CD8 (5H10) ambos diluídos a 1 / 1000.
Nota: O investigador pode desejar substituir o rato tubulina anti-α-(DM1A) com o mouse anti-Futsch (22C10) 20,21 diluído 1 / 1000, em algumas circunstâncias (ver discussão).
- Incubar overnight (por pelo menos 16h) a 4 ° C.
- Lavar 10mins 6x no PBST.
- Adicionar solução de anticorpo secundário diluído em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos secundários utilizados são Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG e Cy3 burro anti-rato IgG. Manter a amostra coberta para evitar fluoróforofoto-branqueamento 22.
- Incubar quer no RT por duas horas, ou durante a noite a 4 ° C seguido por uma hora em temperatura ambiente.
- Lavar 10mins 6x no PBST.
- Coloque o filé larval no slide cutícula voltada para baixo, montado em glicerol 80%, e selar os lados da lamela com unha polonês para uma montagem de 'quick'.
Nota: Para limpar o tecido melhorou, e uma amostra permanente e estável, montagem em DPX como descrito anteriormente 23.
4. Resultados representativos:
Fluorescente de coloração foi analisada sob um microscópio confocal. Nas Figuras 1-2, diferentes ramos dentro de um mandril dendrite tem organização do citoesqueleto diferentes. A Figura 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectado com um anticorpo anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anticorpos anti α-tubulina e fluorescent secundário (Alexa Fluor 488). Os ramos principais são positivos para tubulina, alguns ramos laterais finas são tubulina-negativos. Um filme é um conjunto de cortes seriados através de uma coloração semelhante de uma classe I DA neurônio. A Figura 2 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 º estágio larval. Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Figura 3. Traquéias na parede do corpo larval mostram uma organização de microtúbulos complexo. Filmes 2 e 3 mostram cortes seriados de coloração através dos músculos da parede do corpo e da traquéia.
Figura 1. Fig. 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anti-&-túbulosn anticorpo fluorescente e secundário (Alexa 488). AC painéis seqüenciais confocal z-seções (0.5μm),'c-C ", manchando de anticorpos único a partir do painel Exemplo de ramos com C. (amarelo ponta de seta) ou sem (roxo seta) microtúbulos são realçados. Red arrowheads microtúbulos destaque no subjacentes células epiteliais.
Figura 2. Fig. 2 mostra uma região similar do mandril de um neurônio da classe IV corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Futsch é detectada através de anticorpos anti-Futsch e secundário fluorescente (Alexa 488). Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Exemplo de ramos com (seta amarela) ou sem (roxo seta) Futsch são realçados.
Figura 3. Traquéia coradas utilizando o protocolo anti-tubulina descrito acima. Esta larva é de terceiro instar e dissecados como descrito anteriormente 23,24. Movie 3 mostra alargada cortes seriados do campo marcado por um quadrado.
Movie 1. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em todo o arbor dendríticas de uma classe que eu neurônio. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO (Magenta) e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina (Green) é detectado com um anticorpo anti-α-tubulina e fluorescentes secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.
Filme 2. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em bodmúsculos y parede de uma larva de terceiro instar. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.
Movie 3. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em um corpo de parede da traquéia de uma larva de terceiro instar, marcado com um quadrado no Figure.3. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. Clique aqui para ver o filme.
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Discussion
Para entender o quão complexo formas de células são alcançados, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método etiquetagem robusta imuno ensaio para a organização de microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica de neurônios sensoriais. Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém coloração imuno robusto de traquéia, músculos e tecidos outra parede do corpo.
Nós usamos esse protocolo para examinar organização de microtúbulos no desenvolvimento sensorial dendrites dos neurónios DA. Estes dendritos são muito sensíveis a ferimentos ou estresse 25, e quebrar-se rapidamente após o início da dissecção 23. Dissecção deve ser feita em cinco minutos ou menos. Microtúbulos na traquéia e tecidos outra parede do corpo são mais estáveis. Este protocolo é adaptado dos utilizados preparar filés de larvas para análise da junção neuromuscular 14,15, e é otimizado para f rápidaixation depois de uma dissecção rápida.
Ao analisar os dendritos de neurônios DA, coloração anti-tubulina robusta no músculo sobrejacente, e subjacentes células epiteliais 26 pode levar a um padrão de coloração complicado (Figura 1, Movie1). Daí o cuidado rastreamento de coloração dendríticas através de vários cortes seriados (Movie1) pode ser necessária para uma análise completa de organização de microtúbulos no neurônio DA dendrite arbor. Anticorpos monoclonais para o homólogo específico de Drosophila MAP1B, Futsch 20,21, também pode ser usado para rotular o citoesqueleto de microtúbulos no sistema nervoso periférico Drosophila 5,9,20. Futsch é expressa apenas em neurônios e, portanto, produz um padrão de coloração menos complicado do que α-tubulina (Figura 2). GFP-tagged-endógenas-Tau também tem sido usada como um marcador do dendríticas dos neurônios DA microtúbulos 27. Uso destes marcadores é eficaz, mas deve-se notar que no términos do axônio-the junção neuromuscular Futsch especificamente rótulos microtúbulos pacote 28. As relações espaciais entre exata Futsch, Tau, e microtúbulos nos dendritos DA estão ainda a ser completamente caracterizado. Neste protocolo temos abordado organização de microtúbulos endógena. Também é possível aos microtúbulos etiqueta com superexpressão de Tau GFP tag ou tubulina. Cuidados devem ser tomados contra a induzir fenótipos imprevistos durante a superexpressão abordagens são utilizadas 29.
Em nossas mãos, coloração imuno-histoquímica dos microtúbulos nos neurônios DA e tecidos outra parede do corpo é melhor alcançada quando os anticorpos secundários utilizados para detectar o anticorpo anti-tubulina principal é acoplado a um fluoróforo facilmente visualizado, como Alexa Fluor 488. Portanto, quando o uso de ferramentas para rotular transgênicos neurônios DA em conjunto com anti-tubulina por exemplo, através do sistema de rotulagem Gal4/UAS, sistema LexA, ou em MARCM 23 e MARCM derivados, nós preferimos proteínas marcadoras coma sobreposição espectral com este secundárias, tais como mCD8: KO:: Cherry e mCD8:.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a RIKEN para financiamento. P10-Gal4 foi um presente tipo de Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, França).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) | Sigma-Aldrich | T9026 | Dilution 1/1000 |
| Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | Dilution 1/1000 |
| Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) | Caltag | MCD0800 | Dilution 1/1000 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11001 | Dilution 1/500 |
| Cy3 anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-166-150 | Dilution 1/200 |
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