Summary
이 비디오는 immunodeficient 쥐 모델에서 인간의 함대 (IMA)를 사용하여 스텐 트를 배포 후 내막 증식증의 발전을 연구하는 모델을 보여줍니다.
Abstract
선박 stenting 후 내막 증식증의 개발에 pathobiological 및 pathophysiological 프로세스를 조사 생체내 연구 모델의 잠복기는 translational 방법 1,2를위한 열쇠입니다.
일반적으로 사용되는 동물 모델 마우스, 쥐, 토끼 및 돼지 3-5 포함되어 있습니다. 이러한 생물 학적 과정이 이미 동물의 혈관에서 공부하지만, 인간의 연구 모델 6,7 년 전에는 수행되지 않습니다 때문에 그러나, 임상 설정으로 이러한 모델의 번역이 어려운 남아 있습니다. 이 동영상에서 우리는이 translational 격차를 극복하는 새로운 인간화 모델을 보여줍니다. 표시된 절차, 재현할 쉬우며, 빠르게 수행할 수 있으며 내막 증식증과 다양한 stents의 적용의 개발을 공부하기 적합합니다.
이 비디오는 immunodeficient 쥐에 이식 다음에 인간의 혈관에 스텐 트 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다, 그리고인간과 같은 proliferating 세포의 출처를 식별합니다.
Protocol
1. 내유 동맥 (IMA) 준비
- 동맥 내피는 2 - 프랑스어 포가 티 동맥 embolectomy의 카테터 (박스터 헬스케어, 디어 필드, 일리노이, 미국)의 흐름에 의해 denuded됩니다. 카테터에 두번 내피 손상을 보장하기 위해 전체 선박의 길이 빠져있다.
- 8mm의 길이와 직경 2.5 mm-3mm (예 Translumina, 유콘 스텐 트)의 인간의 스텐 트를 사용합니다. 주의 : 스텐 트의 직경은 사전 및 사후 스텐 트 협착증을 피하기 위해 10 % 이상에 의해 혈관 직경을 초과해서는 안됩니다. 주의 : 같은 연구 내에 스텐 트의 길이를 전환하지 마십시오.
- 원하는 직경을 달성하기위한 적절한 풍선 압력 (어떤은 스텐 트 패키지에 언급되는)를 사용하여 스텐 트를 배포합니다.
- 쇼핑몰 ° C RPMI + 헤파린 (500 IE/10 ML) 얼음 이식까지 4 IMA를 stented.
2. 동물 준비
RNU 누드 (CRL : NIH-Foxn1rnu) 쥐 (3백~3백50g)는 는걸 있습니다scantainer에서 종래의 조건에서 SED는 캐비닛, 수사관 표준 쥐 차우와 autoclaved 물 광고 libidum를 통풍이.
- 유도 챔버를 사용하여 isoflurane와 쥐 (2.5-3 %)를 마취.
- 복부 면도를하고 뒷면에있는 쥐 배치하고 코와 마취를 유지하는 입안을 통해 안면을 넣으십시오.
- 두번이 단계를 반복합니다 - 널리 프로보 - 요오드, 다음 사용을 80 % 에탄올을 사용하여 복부 지역을 소독. 쥐가 anesthetized 충분한지 확인하기 위해 뒷다리를 곤란 반사를 확인하십시오.
- 미세한 관점에서 infrarenal 복부 대동맥을 노출하기 위해 상단 중앙 분리대 개복술을 수행합니다.
- 식염수 moisturized 장갑 안에 창자를 놓습니다. 수분 손실을 방지하기 위해 내장 주위에 장갑을 접으십시오.
- infrarenal 지역에서 분기점으로 대동맥 해부, 조심스럽게 선박의 지점에 손상을 줄 수 없습니다.
- 대동맥 혈류를 중지 마이크로 클램프를 사용합니다. 를 삽입근위 클램프 먼저 말초 겸자로 따라갔다.
- 응용 프로그램을 제거합니다. 0.5-0.7 밀리미터 대동맥 세그먼트 및 헤파린 (200 세대)와 나머지 대동맥를 플러시.
- stented IMA를 타고 적절한 길이로 단축하고 간격으로 위치를.
- 8-0 prolene 봉합사를 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용하여 봉합을 실행하여,받는 대동맥으로 IMA를 연결합니다.
- 조심스럽게 첫 두개골 클램프 다음 꼬리 클램프를 엽니다.
- 이식된 IMA과 대동맥의 말초 끝에 가시 펄스가 있어야합니다.
- 복부에 다시 창자를 놓습니다.
- 사전 예열 멸균 식염수에 복부를 플러시.
- 6-0 prolene 실행 봉합을 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용하여 복벽의 근육 레이어를 닫습니다.
- 쥐가 마취 아직이지만, subcutaneously 4-5 밀리그램 / kg Carprofen 투입.
- 삼일 게시물 surg 동안 (예 : Carprofen 또는 Meloxicam) 적절한 사후 수술 진통제를 관리ery.
3. 대표 결과
조직학의 경우 표본은 알코올의 등급 시리즈, 포르말린 탈수 4퍼센트에서 수정되었으며, 1 % 건조 과산화 벤 조일 1 개 일간 dibutylphthalate 80 % methylmethacrylate와 20 %, MMA 나의 혼합물 (MMA 전)에 침입 4에 1-2일위한 3% 건조 벤조일의 과산화수소 (MMA III) : 1 개 날, MMA 나는 ° C. 이후 표본은 미리 polymerized 기지에있는 물을 욕조에 유리 튜브 안에 신선한 MMA III에 polymerized되었다. 느린 중합은 26 살에 튜브를 유지함으로써 달성되었다 ° C에서 하룻밤, 중합이 발생하기 전까지 ° C ~ 다음날 아침, 그리고 점차적으로 0.5 ° C ~ 12여 H에 의해 온도를 증가 28 온도를 증가. polymerized 블록 텅스텐 초경 나이프를 갖춘 MICROM HM 360 마이크로톰를 사용하여 5 μm의 두께로 sectioned 있었다.
초, proliferating 세포의 기원 (그림 1)를 식별하려면lides이 중 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 쥐를 식별하는 항체 물들일되었다 MHC-I와 인간의 평활근 세포. 이러한 연구 내용은, 인간 IMA는 리포터 유전자에 GFP가 하룻밤 IMA 전지의 안정적인 도입을 위해 lentiviral 입자를 이용하여 incubated되었습니다. 인간의 기원으로부터 분리 딸 세포가 GFP를 표현하여 식별 수 있습니다. deparaffinization 후, 열을 유발 에피토프 검색은 증기선을 사용하여 항원 복구 솔루션에 슬라이드를 가열하여 수행됩니다. 이미지-IT FX 신호 확장기가 차단 단계에 사용될 수 있습니다. 인간의 근본 세포 GFP (주 항체 희석액 (Dako)에 희석 1:100)에 대해 마우스 단클론 항체를 사용하여 확인하고, 추가로 염소 - 안티 - 마우스 IgG, 알렉사 형석 488 (1:1000 이차 항체 희석액에 희석으로 표시됩니다 ). 평활근 세포는 염소 - 안티 - 토끼 IgG, 알렉사 Fluo 다음, 토끼 polycolonal 안티 평활근 α-actin (주 항체 희석액에 희석 1:100)로 표시된R 555 (이차 항체 diluents에 희석 1:1000). 각 항체 배양 단계는 세 번 PBS는 중간에 세척으로 1 시간 37 ° C에서 수행됩니다. 핵은 10 분 DAPI 물들일 수 있습니다. 골드 antifade 시약을 연장 사용하여 슬라이드를 장착 후, 샘플은 공촛점 현미경을 사용하여 분석되었다.
1 그림. 인간의 평활근 세포와 같은 neointimal 세포 :.. 그린 = 안티 GFP, 인간의 근본 세포를 레이블링, 빨간색 = 안티 인간의 평활근 세포 actin, 파란색 = DAPI, 세포 핵을 식별 B : 녹색 = 안티 쥐 MHC-I, 레이블링 쥐 원산지 세포, 빨간색 = 안티 인간의 평활근 세포 actin, 파란색 = DAPI, 세포 핵 식별. Proliferating 세포가 GFP를위한 평활근 세포와 긍정적인 것으로 판별하지만, 쥐 MHC-I 분자에 대한 부정하고 있습니다. 따라서 proliferating 세포는 인간의 근원입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
생체내 연구 모델에서 서로 다른가 스텐 트 배치 후 내막 증식증의 발전을 조사하기 위해 존재하고 있지만, 이러한 모델은 여전히 극복하기 위해 translational 장애물에 직면. 또한, 대형 동물 모델은 고가의 주택 및 특수 조건뿐만 아니라 수술 장비 모든 실험실을 사용할 수 없습니다입니다.
인간의 내막 증식 및 인 - 스텐 트 restenosis의 개발을 연구하는 인간 IMA를 사용하면 장기의 문화 8,9의 전직 원위치 전에 공부했다. 새로운 인간화 IMA 모델은 immunodeficient 쥐의 복부 대동맥 위치로 인간 IMA을 이온 주입하여 생체내에 재 협착의 스텐 트의 문제를 해결하기위한 translational 접근 방식을 구성합니다. 인간 IMA가 쥐의 복부 대동맥의 크기에 완벽하게 일치합니다. 따라서 우리의 제시 모델, 재현성 쉽게 수행할 빠르고, 특수 외과 교육을 요구하고있다하지 않습니다저렴.
인간의 평활근 세포와 같은 neointimal 세포의 식별은 임상 설정으로 translational 격차를 닫고 생체내 인간의 pathophysiological 프로세스를 조사할 수있는 기회를 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그녀의 공헌을 위해 크리스티안 Pahrmann 감사드립니다. 봉합 재료를 제공 Ethicon, Norderstedt, 함부르크 (독일)에 대한 특별 감사합니다.
기금
소냐 Schrepfer는 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 SCHR992/4-1)에서 연구 보조금을 받았습니다.] 작품 ISHLT Shumway 경력 개발 그랜트 2010 포크 연구 기금 (스탠포드 대학)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346 (2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
