Summary
בסרט מוצג במודל כדי לחקור את הפיתוח של היפרפלזיה intimal לאחר הפריסה סטנט באמצעות הכלי האנושי (הר"י) במודל עכברים immunodeficient.
Abstract
פרה במודלים ב vivo מחקר כדי לחקור תהליכים pathobiological ו פתופיזיולוגיים בפיתוח של היפרפלזיה intimal לאחר סטנט כלי הם קריטיים עבור 1,2 גישות translational.
על מודלים של בעלי חיים נפוצים כוללים עכברים, חולדות, ארנבות, חזירים 3-5. עם זאת, תרגום של מודלים אלה לתוך ההגדרות הקליניות עדיין קשה, כי אלה תהליכים ביולוגיים נלמדים כבר כלי בעלי חיים אבל מעולם לא הופיע לפני במודלים של מחקר האדם 6,7. בסרטון הזה אנחנו מדגימים מודל אנושי חדשה כדי להתגבר על הפער הזה translational. ההליך המוצג הוא לשחזור, קל, מהיר לביצוע והוא מתאים ללמוד את הפיתוח של היפרפלזיה intimal ואת הישימות של סטנטים שונים.
סרט זה מראה כיצד לבצע את טכניקת הסטנט בכלי אדם ואחריו השתלת לתוך חולדות immunodeficient, ומזהה את מקור התאים מתרבים כמו בני אדם.
Protocol
1. עורק פנימי החלב (הר"י) הכנה
- האנדותל עורקים היא חשופה על ידי מעבר של קטטר פוגארטי 2-צרפתית embolectomy עורקים (Baxter Healthcare, Deerfield, אילינוי, ארה"ב). קטטר נמשך לאורך דרך כל כלי פעמיים כדי להבטיח נזק האנדותל.
- השתמש בכל סטנט אנושית באורך 8 מ"מ ו 2.5 מ"מ, 3 מ"מ קוטר (למשל Translumina, יוקון סטנט). זהירות: קוטר של סטנט לא יעלה על קוטר כלי של מעל 10%, כדי למנוע היצרות של לפני ואחרי, סטנט. זהירות: אין לעבור את האורך של סטנט בתוך המחקר את אותו הדבר.
- לפרוס את הסטנט באמצעות בלון הלחץ המתאים (אשר צוין על האריזה סטנט) כדי להשיג בקוטר הרצוי.
- חנות stented הר"י ב 4 ° C על RPMI + הפרין (500 מ"ל IE/10) קרח עד להשתלה.
2. בעלי חיים הכנה
RNU עירום (CRL: NIH-Foxn1rnu) חולדות (300-350 גרם) הם הוsed בתנאים רגילים ב scantainer מאוורר ארונות, הפד תקן עכברוש צ ו libidum autoclaved המודעה מים.
- להרדים חולדה עם isoflurane (2.5-3%) באמצעות חדר אינדוקציה.
- לגלח את שיער הבטן ומניחים את העכברוש על גבו והנח facemask על אפו ופיו כדי לשמור על הרדמה.
- לחטא את אזור הבטן תוך שימוש נרחב Provo, יוד, השימוש באתנול 80% הבא - לחזור על פעולה זו פעמיים. יש לבדוק את הרפלקסים צובט את הרגליים האחוריות כדי לוודא עכברוש די הרדים.
- תחת נוף מיקרוסקופי, לבצע laparotomy החציוני העליונה כדי לחשוף את אבי העורקים בבטן infrarenal.
- מניחים את המעיים בכפפה לחות מלוחים. מקפלים את הכפפה סביב המעיים כדי למנוע אובדן לחות.
- לנתח את אבי העורקים מאזור infrarenal אל הסתעפות, בזהירות שלא לגרום נזק על ענפי הכלים.
- השתמש מהדק מיקרו לעצור את זרימת הדם באבי העורקים. מניחים אתמהדק הפרוקסימלי 1, ואחריו תפס דיסטלי.
- להסיר רכיב. 0.5-0.7 מ"מ קטע אבי העורקים ולשטוף את אבי העורקים הנותרים עם הפרין (200 יחידות).
- קח את הר"י stented ולקצר אותו לאורך נאותה ומקם אותה לתוך הפער.
- חבר הר"י על אבי העורקים הנמען, על ידי הפעלת התפרים באמצעות 8-0 prolene תפר (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).
- בזהירות לפתוח את מהדק הגולגולת הראשון ולאחר מכן תפס הזנב.
- לא צריך להיות הדופק גלוי הר"י המושתל ובסוף הדיסטלי של האאורטה.
- מניחים את המעיים בחזרה לתוך הבטן.
- לרוקן את הבטן עם מי מלח מחומם מראש סטרילית.
- סגור את שכבת השרירים של דופן הבטן באמצעות תפרים 6-0 רצים prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).
- בעוד העכברוש עדיין הרדמה, להזריק Carprofen 4-5 מ"ג / ק"ג תת עורי.
- ניהול לאחר ניתוח כאבים לפי הצורך (למשל Carprofen או Meloxicam) במשך 3 ימים הודעה Surgery.
3. נציג תוצאות
לבדיקת רקמות, דגימות היו קבועים 4% פורמלין, מיובש בסדרה מדורג של אלכוהול, הסתננו בתערובת (MMA I) של methylmethacrylate 80% ו 20% dibutylphthalate ליום 1, MMA לי עם מי חמצן 1% בנזואיל יבש 1 יום, MMA לי עם מי חמצן 3% בנזואיל יבש (MMA III) של 1-2 ימים על 4 ° C. לאחר מכן, דגימות היו מפולמר ב טרי MMA השלישי ב צלוחיות זכוכית באמבט מים על בסיס מראש polymerized. פילמור איטי הושגה על ידי שמירה על צלוחיות על 26 מעלות צלזיוס במשך הלילה, מעלה את הטמפרטורה עד 28 מעלות צלזיוס למחרת בבוקר, ולאחר מכן להעלות את הטמפרטורה בהדרגה H 0.5 ° C מעל 12 עד פילמור התרחש. אבני polymerized היו מחולק על עובי 5 מיקרומטר באמצעות HM MICROM 360 microtome מצויד בסכין טונגסטן קרביד.
כדי לזהות את מקור התאים מתרבים (איור 1), Slides הוכתמו נוגדנים המזהים או עכברוש ירוק ניאון חלבון (GFP) או MHC-I ו אנושיים לתאי שריר חלק. למחקרים אלה, האדם הר"י הודגר עם GFP הגן כתב בן לילה באמצעות חלקיקים lentiviral עבור התמרה של תאים יציבה אמא. לתאי הבת חלוקת ממקור אנושי יכול להיות מזוהה על ידי הבעת ה-GFP. לאחר deparaffinization, חום הנגרמת epitope אחזור מתבצע על ידי חימום השקופיות בפתרון אנטיגן אחזור באמצעות קיטור. Image-IT FX האות משפר יכול לשמש צעד חסימה. תאים ממקור אנושי מזוהים באמצעות נוגדנים חד שבטיים כנגד ה-GFP עכבר (1:100 מדולל diluent הנוגדן הראשוני (Dako)), ומסומן נוסף עם עז נגד העכבר IgG, Alexa פלואוריד 488 (1:1000 מדולל diluent נוגדנים משני ). בתאי השריר החלק סומנו שרירים ארנב polycolonal נגד החלקה α-אקטין (1:100 מדולל diluent הנוגדן הראשוני), ואחריו עז נגד ארנב IgG, Alexa FluoR 555 (1:1000 מדולל diluents נוגדנים משניים). שלב הדגירה נוגדנים מבוצעת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם שלוש פעמים PBS כביסה באמצע. גרעינים מגואלות DAPI במשך 10 דקות. לאחר הרכבה של השקופיות באמצעות להאריך מגיב antifade זהב, דגימות נותחו באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
באיור 1. התאים neointimal כמו בתאי שריר חלק.. ירוק = אנטי GFP, תיוג תאים ממקור אנושי, אדום = אנטי התא האנושי חלק השריר אקטין, כחול = DAPI, זיהוי גרעיני תאים ב ': ירוק = חולדה נגד MHC-I, תיוג תאים ממקור חולדה, אדום = אנטי התא האנושי חלק השריר אקטין, כחול = DAPI, זיהוי גרעיני תאים. תאים מתרבים מזוהים בתאי שריר חלק חיובי עבור ה-GFP, אבל שלילי מולקולה עכברוש MHC-I. לכן, תאים מתרבים הם ממקור אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אף על פי מודלים שונים ב vivo המחקר הם קיימים כדי לחקור את הפיתוח של היפרפלזיה intimal לאחר מיקום הסטנט, מודלים אלה עדיין בפני מכשולים של תרגום להתגבר. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים גדולים הם תנאי דיור יקרים ומיוחדים, כמו גם ציוד כירורגי אינו זמין עבור כל המעבדות.
באמצעות הר"י האדם ללמוד על התפתחות התרבות האנושית intimal ב-סטנט restenosis נחקרה לפני באתרו לשעבר בתרבויות איברים 8,9. הדגם החדש מהווה אנושי IMA גישה translational להתייחס לנושא של ב סטנט מחדש היצרות in vivo, על ידי השתלת הר"י האדם למצב של אבי העורקים בבטן חולדות immunodeficient. האדם של הר"י הן התאמה מושלמת לגודל של אבי העורקים בבטן של חולדות. לכן, המודל שלנו הוא הציג לשחזור, קל ומהיר לביצוע, אינה דורשת הכשרה כירורגית מיוחדת, והואזול.
זיהוי התאים neointimal כמו בתאי שריר חלק סוגר את הפער translational להגדרות קליניים ומראה את ההזדמנות כדי לחקור תהליכים פתופיזיולוגיים אדם in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המחברים מודים כריסטיאן Pahrmann על תרומתה. תודה מיוחדת Ethicon, Norderstedt, המבורג (גרמניה) לאספקת חומר תפר.
מימון
סוניה Schrepfer קיבל מענק מחקר של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 ו SCHR992/4-1).] עבודה נתמך על ידי Shumway ISHLT פיתוח קריירה גרנט 2010 ו מימון מחקרי פאלק (אוניברסיטת סטנפורד).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346 (2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
