Summary
यह वीडियो एक स्टेंट एक immunodeficient चूहे मॉडल में एक मानव पोत (आईएमए) का उपयोग तैनाती बाद intimal hyperplasia के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल को दर्शाता है.
Abstract
Vivo अनुसंधान मॉडल में Preclinical पोत stenting के बाद intimal hyperplasia के विकास में pathobiological और pathophysiological प्रक्रियाओं की जांच translational दृष्टिकोण 1,2 के लिए महत्वपूर्ण हैं.
आमतौर पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल चूहे, चूहे, खरगोश, और 3-5 सूअरों शामिल हैं. हालांकि, नैदानिक सेटिंग में इन मॉडलों का अनुवाद मुश्किल बना हुआ है, के बाद से पहले से ही उन जैविक प्रक्रियाओं पशु वाहिकाओं में अध्ययन कर रहे हैं लेकिन मानव अनुसंधान 6,7 मॉडल में प्रदर्शन से पहले कभी नहीं. इस वीडियो में हम इस translational अंतर को दूर करने के लिए एक नया humanized मॉडल को प्रदर्शित करता है. दिखाया प्रक्रिया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, आसान, और प्रदर्शन करने के लिए तेजी से और intimal hyperplasia और विविध stents की प्रयोज्यता के विकास का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है.
इस वीडियो से पता चलता है कि कैसे मानव immunodeficient चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा पीछा वाहिकाओं में स्टेंट तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, औरमानव के रूप में proliferating कोशिकाओं के मूल को दिखाता है.
Protocol
1. आंतरिक स्तन धमनी तैयारी (आईएमए)
- धमनी endothelium एक 2-फ्रेंच Fogarty धमनी अन्त: शल्यनिष्कासन कैथेटर (बैक्सटर हेल्थकेयर, Deerfield, आईएल, संयुक्त राज्य अमेरिका) के पारित होने से denuded है. कैथेटर पूरे पोत लंबाई के माध्यम से खींचा जाता है दो बार endothelial क्षति को सुनिश्चित करने के लिए है.
- 8mm लंबाई और व्यास में 2.5 मिमी 3 (जैसे Translumina, Yukon स्टेंट) के किसी भी मानव स्टेंट का प्रयोग करें. चेतावनी: स्टेंट का व्यास 10% से अधिक पोत व्यास पूर्व और बाद स्टेंट एक प्रकार का रोग से बचने से अधिक नहीं होनी चाहिए. चेतावनी: इसी अध्ययन के भीतर स्विच स्टेंट की लंबाई नहीं.
- उपयुक्त गुब्बारा (जो स्टेंट पैकेज पर उल्लेख किया है) के दबाव वांछित व्यास को प्राप्त करने का उपयोग स्टेंट तैनात करें.
- स्टोर में 4 प्रत्यारोपण तक ° C RPMI + हेपरिन (500 IE/10 मिलीलीटर) बर्फ पर आईएमए stented.
2. पशु तैयारी
(CRL: NIH-Foxn1rnu) RNU नग्न चूहों (300-350 छ) hou रहे हैंपारंपरिक शर्तों के तहत scantainer में sed अलमारियाँ खिलाया मानक चूहे चाउ और autoclaved पानी विज्ञापन libidum हवादार है.
- Anesthetize isoflurane (2.5-3%) के साथ चूहे एक प्रेरण कक्ष का उपयोग.
- पेट बाल दाढ़ी और अपनी पीठ पर जगह चूहे और अपनी नाक और मुंह के ऊपर संज्ञाहरण रखने पर एक facemask जगह.
- इस कदम को दो बार दोहराना - पेट की व्यापक रूप से Provo आयोडीन, अगले उपयोग 80% इथेनॉल का उपयोग क्षेत्र कीटाणुरहित. पिछले पैर pinching लगता है कि चूहे anesthetized पर्याप्त है सजगता की जाँच करें.
- सूक्ष्म दृश्य के तहत, एक ऊपरी मंझला laparotomy प्रदर्शन अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी का पर्दाफाश.
- एक खारा moisturized दस्ताने में आंतों रखें. आंतों के चारों ओर दस्ताने नमी के नुकसान को रोकने के मोड़ो.
- क्षेत्र से द्विभाजन के लिए अधोमूत्र पिंडीय महाधमनी टुकड़े करना, ध्यान नहीं जहाजों की शाखाओं पर नुकसान का कारण.
- महाधमनी रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए सूक्ष्म clamps का उपयोग करने के लिए. जगहसमीपस्थ क्लैंप 1 है, डिस्टल क्लैंप द्वारा पीछा किया.
- एक app निकालें. 0.5-0.7 मिमी महाधमनी खंड और हेपरिन (200 इकाइयों) के साथ शेष महाधमनी फ्लश.
- Stented आईएमए ले लो और यह पर्याप्त लंबाई के लिए छोटा है और यह अंतराल में स्थिति.
- प्राप्तकर्ता महाधमनी 8-0 prolene सीवन (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) का उपयोग sutures चलाकर आईएमए, कनेक्ट.
- ध्यान से 1 कपाल तो और लांगुलिय क्लैंप क्लैंप खोलने.
- प्रतिरोपित आईएमए और महाधमनी के बाहर अंत में एक दृश्य नाड़ी होना चाहिए.
- आंतों वापस जगह पेट में.
- पूर्व गर्म बाँझ खारा के साथ पेट फ्लश.
- पेट 6-0 prolene चल रहा sutures (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) का उपयोग कर दीवार की मांसपेशियों परत बंद.
- जबकि चूहे संज्ञाहरण में अभी भी है, 4-5 Carprofen मिलीग्राम / किग्रा subcutaneously इंजेक्षन.
- के रूप में उपयुक्त (जैसे Carprofen या Meloxicam) 3 पोस्ट सर्जन दिनों के लिए शल्य चिकित्सा के बाद analgesia प्रशासनery.
3. प्रतिनिधि परिणाम
ऊतक विज्ञान के लिए, 4% formalin, शराब की एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलित नमूनों में तय किया गया है, और 80% और 20% methylmethacrylate 1 दिन के लिए dibutylphthalate, एमएमए मैं (एमएमए) के एक 1% सूखी पेरोक्साइड के साथ मिश्रण में घुसपैठ 1 दिन, 3% 1-2 दिनों के लिए सूखी benzoyl पेरोक्साइड (एमएमए III) के साथ एमएमए मैं 4 डिग्री सेल्सियस इसके बाद, नमूनों ताजा एमएमए III में एक पानी में स्नान एक पूर्व polymerized आधार पर कांच की शीशियों में polymerized थे. धीमी polymerization 26 में शीशियों रखने के द्वारा प्राप्त किया गया था ° C रातोंरात, 28 के लिए तापमान में वृद्धि ° C अगली सुबह, और फिर 0.5 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के द्वारा धीरे - धीरे तापमान में वृद्धि जब तक polymerization हुआ. polymerized ब्लॉक 5 सुक्ष्ममापी एक MICROM एचएम 360 एक tungsten कार्बाइड चाकू के साथ सुसज्जित सूक्ष्म मोटाई में sectioned थे.
Proliferating कोशिकाओं के मूल (1 चित्रा) की पहचान है,lides या तो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या चूहा की पहचान एंटीबॉडी के साथ दाग थे MHC-मैं और मानव चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं. इन अध्ययनों के लिए, मानव आईएमए रिपोर्टर जीन GFP रातोंरात आईएमए कोशिकाओं के स्थिर पारगमन के लिए lentiviral कणों का उपयोग कर के साथ incubated किया गया था. मानव मूल से Dividing बेटी कोशिकाओं GFP व्यक्त की पहचान की जा सकती है. Deparaffinization के बाद, गर्मी प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति प्रतिजन पुनर्प्राप्ति एक स्टीमर का उपयोग कर समाधान में स्लाइड्स हीटिंग के द्वारा किया जाता है. यह छवि FX संकेत बढ़ाने अवरुद्ध कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव मूल की कोशिकाओं GFP (1:100 प्राथमिक एंटीबॉडी तनुकारक (वस्तु) (Dako) में पतला) के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग की पहचान कर रहे हैं, और आगे बकरी विरोधी माउस आईजीजी, Alexa Fluor 488 (1:1000 माध्यमिक एंटीबॉडी तनुकारक (वस्तु) में पतला के साथ लेबल ). चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं खरगोश polycolonal विरोधी चिकनी पेशी α actin (1:100 प्राथमिक एंटीबॉडी तनुकारक (वस्तु) में पतला) के साथ के रूप में चिह्नित किया गया, बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी, Alexa Fluo द्वारा पीछाr 555 (1:1000 माध्यमिक एंटीबॉडी diluents में पतला). प्रत्येक एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए तीन बार पीबीएस के बीच में कपड़े धोने के साथ किया जाता है. नाभिक DAPI के साथ 10 मिनट के लिए दाग रहे हैं. गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा का उपयोग स्लाइड के बढ़ते के बाद, नमूने confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया.
चित्रा 1. मानव चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में neointimal कोशिकाओं: ग्रीन = विरोधी GFP, मानव मूल की कोशिकाओं लेबलिंग, लाल = मानव विरोधी चिकनी मांसपेशी कोशिका actin, नीले = DAPI, सेल नाभिक की पहचान बी: ग्रीन = विरोधी चूहा MHC-मैं, लेबलिंग चूहे मूल की कोशिकाओं, लाल = मानव विरोधी चिकनी मांसपेशी कोशिका actin, नीले = DAPI, सेल नाभिक की पहचान. Proliferating कोशिकाओं चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं GFP के लिए और सकारात्मक रूप में पहचाने जाते हैं, लेकिन चूहे अणु MHC-I के लिए नकारात्मक है. इसलिए, proliferating कोशिकाओं मानव मूल के हैं.
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Discussion
हालांकि vivo अनुसंधान मॉडल में अलग स्टेंट प्लेसमेंट बाद intimal hyperplasia के विकास की जांच करने के लिए विद्यमान हैं, इन मॉडलों को अभी भी translational टट्टी कुदने की घुड़ौड़ का सामना करना पड़ रहा है पर काबू पाने के लिए. इसके अलावा, बड़े पशु मॉडल महंगी और विशेष आवास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिस्थितियों शल्य चिकित्सा उपकरण सभी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं है.
मानव intimal प्रसार और स्टेंट restenosis के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मानव आईएमए का अंग 8,9 संस्कृतियों में पूर्व स्वस्थानी से पहले अध्ययन किया गया. नई humanized आईएमए मॉडल एक translational vivo में immunodeficient चूहों के पेट महाधमनी की स्थिति में मानव आईएमए द्वारा दाखिल स्टेंट में फिर से एक प्रकार का रोग के मुद्दे को संबोधित दृष्टिकोण का गठन किया है. मानव आईएमए चूहों के उदर महाधमनी के आकार के एक परिपूर्ण मैच हैं. इसलिए, हमारे प्रस्तुत मॉडल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, आसान और तेजी से प्रदर्शन करने के लिए है, विशेष शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है, करता है और हैसस्ती.
मानव चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में neointimal कोशिकाओं की पहचान नैदानिक सेटिंग करने के लिए translational अंतर बंद कर देता है और vivo में मानव pathophysiological प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अवसर को दर्शाता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों को उनके योगदान के लिए धन्यवाद Christiane Pahrmann. सिवनी सामग्री प्रदान करने के लिए Ethicon, Norderstedt, हैम्बर्ग (जर्मनी) के लिए विशेष धन्यवाद.
निधिकरण
सोनिया Schrepfer ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) (/ SCHR992 1 3 और SCHR992/4-1) से एक शोध अनुदान प्राप्त हुआ है. काम ISHLT Shumway कैरियर विकास 2010 अनुदान और Falk अनुसंधान अनुदान (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
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