Summary
Deze video toont een model om de ontwikkeling van intima hyperplasie studeren na stent met behulp van een menselijk vat (IMA) in een immunodeficiënte rat model.
Abstract
Gegevens uit het preklinisch in vivo onderzoek modellen om pathobiological en pathofysiologische processen te onderzoeken in de ontwikkeling van intima hyperplasie na schip stenting zijn cruciaal voor translationele benadering 1,2.
De meest gebruikte diermodellen zijn muizen, ratten, konijnen en varkens 3-5. Echter, de vertaling van deze modellen in de klinische omgeving blijft het moeilijk, omdat die biologische processen zijn reeds bestudeerd in dier schepen, maar niet eerder in de menselijke onderzoeksmodellen 6,7. In deze video demonstreren we een nieuw gehumaniseerd model om dit translationele kloof te overwinnen. De getoonde werkwijze is reproduceerbaar, gemakkelijk en snel uit te voeren en is geschikt voor de ontwikkeling van intimale hyperplasie en de toepasbaarheid van diverse stents bestuderen.
Deze video laat zien hoe u de stent techniek in menselijke voertuigen, gevolgd door transplantatie in immunodeficiënte ratten enidentificeert de oorsprong van prolifererende cellen mens.
Protocol
1. Interne borstslagader (IMA) Voorbereiding
- De arteriële endotheel wordt kaal door de passage van een 2-franse Fogarty arteriële embolectomie katheter (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). De katheter wordt getrokken door het gehele schip lengte twee keer op endotheliale schade te verzekeren.
- Gebruik een menselijke stent van 8 mm lang en 2,5 mm-3 mm in diameter (bijv. Translumina, Yukon stent). Let: De diameter van de stent de bloedvaten met niet meer dan 10% vóór en na stent stenose voorkomen. LET OP: de lengte van de stent niet veranderen binnen dezelfde studie.
- Implementeren de stent met de juiste ballon druk (die wordt opgemerkt de stent pakket) om de gewenste diameter te bereiken.
- Store gestente IMA in 4 ° C RPMI + heparine (500 IE/10 ml) op ijs tot transplantatie.
2. Toebereiding van dieren
RNU Naakt (CRL: NIH-Foxn1rnu) ratten (300-350 g) zijn housed onder gebruikelijke voorwaarden in scantainer geventileerde kasten, gevoed standaard rat chow en geautoclaveerd water ad libidum.
- Verdoof rat met isofluraan (2,5-3%) met behulp van een inductie kamer.
- Scheer de buik-haar en zet de rat op zijn rug en plaats een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie.
- Ontsmet de buikstreek op ruime schaal in Provo-Jodium, naast het gebruik 80% ethanol - twee keer herhaalt u deze stap. Controleer reflexen knijpen de achterpoten om zeker te zijn dat de rat voldoende is verdoofd.
- Onder microscopisch beeld, voert u een bovenste mediaan laparotomie om de infrarenale abdominale aorta bloot te leggen.
- Plaats de darmen in een zoutoplossing gehydrateerde handschoen. Vouw de handschoen rond de darmen om het verlies van vocht te voorkomen.
- Ontleden de aorta van de infrarenale regio naar de splitsing, zorgvuldig om geen schade te veroorzaken op de takken van de schepen.
- Gebruik micro klemmen om de aorta bloedstroom te stoppen. Plaats hetproximale klem, gevolgd door het distale klem.
- Verwijder een app. 0,5-0,7 mm aorta-segment en spoel de resterende aorta met heparine (200 eenheden).
- Neem het gestente IMA en het verkorten tot het juiste lengte en plaats deze in het gat.
- Sluit de IMA aan de ontvanger aorta, door het uitvoeren van hechtingen met 8-0 prolene hechting (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
- Open voorzichtig de eerste schedel klem en daarna de staart klem.
- Er moet een zichtbaar puls in de getransplanteerde IMA en aan het distale einde van de aorta zijn.
- Plaats de darmen in de buik.
- Spoel de buik met voorverwarmde steriele zoutoplossing.
- Sluit de spierlaag van de buikwand met 6-0 prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
- Terwijl de rat is nog steeds in de anesthesie, subcutaan injecteren 4-5 mg / kg Carprofen.
- Dien post-operatieve analgesie in voorkomend geval (bijv. Carprofen of Meloxicam) gedurende 3 dagen na de chirurgischeery.
3. Representatieve resultaten
Voor histologie, werden de monsters gefixeerd in 4% formaline, gedehydrateerd in een gegradeerde reeks alcohol en geïnfiltreerd in een mengsel (MMA I) van 80% methylmethacrylaat en 20% dibutylftalaat gedurende 1 dag, MMA I met 1% droge benzoylperoxyde voor 1 dag en MMA I 3% droge benzoylperoxide (MMA III) gedurende 1-2 dagen bij 4 ° C. Daarna werden de monsters gepolymeriseerd in verse MMA III in glazen flesjes in een waterbad op een pre-gepolymeriseerde basis. Slow polymerisatie werd bereikt door het houden van de flacons bij 26 ° C gedurende de nacht, het verhogen van de temperatuur tot 28 ° C de volgende ochtend, en dan het verhogen van de temperatuur geleidelijk met 0,5 ° C meer dan 12 uur tot polymerisatie heeft plaatsgevonden. De gepolymeriseerde blokken waren coupes op 5 micrometer dikte van het gebruik van een Microm HM 360 microtoom voorzien van een hardmetalen mes.
Om het ontstaan van prolifererende cellen (Figuur 1) bepalen, slides werden gekleurd met antilichamen identificeren of de groen fluorescerend eiwit (GFP) en rat MHC-I en menselijke gladde spiercellen. Voor deze studies werd de menselijke IMA geïncubeerd met het reportergen GFP 's nachts met behulp van lentivirale deeltjes voor een stabiele transductie van IMA cellen. Het verdelen dochter cellen van menselijke oorsprong kon worden geïdentificeerd met het uitspreken van GFP. Na deparaffinization wordt de warmte-geïnduceerd herstel van de epitoop uitgevoerd door het verwarmen van de dia's in antigen herstel oplossing met behulp van een stoomboot. De afbeelding-iT FX signaal enhancer kan worden gebruikt voor de blokkeringsstap. Cellen van humane oorsprong zijn aangegeven met de muis monoklonale antilichamen tegen GFP (1:100 verdund in primaire antilichaam oplosmiddel (Dako)), en verder voorzien van geit anti-muis IgG, Alexa Fluor 488 (1:1000 verdund in secundair antilichaam verdunningsmiddel ). De gladde spiercellen zijn gemarkeerd met het konijnen anti-polycolonal gladde spier α-actine (1:100 verdund in primaire antilichaam verdunningsmiddel), gevolgd door geit-anti-konijn IgG, Alexa Fluor 555 (1:1000 verdund in secundaire antilichaam verdunningsmiddelen). Elk antilichaam incubatiestap wordt uitgevoerd bij 37 ° C gedurende 1 uur driemaal wassen tussen PBS. Kernen zijn gekleurd met DAPI gedurende 10 minuten. Na montage van de dia's met behulp van Verleng Gold antifade reagens, werden monsters geanalyseerd met behulp van confocale microscopie.
Figuur 1. De neo-intima-cellen als menselijke gladde spiercellen A:.. Groen = anti GFP, etikettering cellen van menselijke oorsprong; rood = anti menselijke gladde spiercellen actine, blauw = DAPI, het identificeren van celkernen B: Groen = anti rat MHC-I, etikettering cellen van rat oorsprong; rood = anti menselijke gladde spiercellen actine, blauw = DAPI, het identificeren van celkernen. Prolifererende cellen worden aangeduid als gladde spiercellen en positief voor GFP, maar negatief voor de rat MHC-I molecuul. Daarom prolifererende cellen zijn humane oorsprong.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel verschillende in-vivo-onderzoek modellen zijn de bestaande aan de ontwikkeling van intima hyperplasie te onderzoeken na het plaatsen van een stent, deze modellen nog steeds geconfronteerd met translationeel hindernissen te overwinnen. Bovendien, grote diermodellen zijn duur en speciale huisvesting en medische apparatuur is niet beschikbaar voor alle laboratoria.
Een menselijke IMA de ontwikkeling van intimale menselijke proliferatie en in-stent restenose bestudeerd voor ex situ in orgaankweken 8,9. De nieuwe gehumaniseerd IMA-model vormt een translationele benadering van het probleem van de stent in de re-stenose te pakken in vivo, door het implanteren van de menselijke IMA in de abdominale aorta-positie van immunodeficiënte ratten. Human IMA's zijn een perfecte match om de grootte van de abdominale aorta van ratten. Daarom is onze gepresenteerde model is reproduceerbaar, gemakkelijk en snel uit te voeren, vereist geen speciale chirurgische training, en isgoedkoop.
De identificatie van de neo-intimale cellen menselijke gladde spiercellen sluit de translationele gat naar klinische omgeving en toont de mogelijkheid om menselijke pathofysiologische processen onderzoeken in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Christiane Pahrmann voor haar bijdrage. Met dank aan Ethicon, Norderstedt, Hamburg (Duitsland) voor het verstrekken van hechtmateriaal.
Financiering
Sonja Schrepfer heeft een onderzoeksbeurs van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 en SCHR992/4-1).] Het werk werd ondersteund door de ISHLT Shumway Career Development Grant 2010 en de Falk Onderzoek Financiering (Stanford University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346 (2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
