Summary
Это видео показывает модель для изучения развития гиперплазии интимы после установки стента использование человеческих судна (IMA) в иммунодефицитных модель крысы.
Abstract
Доклинические в моделях естественных исследований по расследованию pathobiological и патофизиологические процессы в развитии гиперплазии интимы после стентирования судна имеют решающее значение для поступательного 1,2 подходы.
Обычно используются модели на животных включают мышей, крыс, кроликов и свиней 3-5. Тем не менее, перевод этих моделей в клинических условиях остается сложной, поскольку эти биологические процессы, которые уже изучали животных суда, но никогда не выступал прежде в человеческой модели исследования 6,7. В этом видео мы демонстрируем новые гуманизированные модели для преодоления этого разрыва поступательно. Указанные процедуры воспроизводимый, легко и быстро выполнять и подходит для изучения развития гиперплазии интимы и применимость различных стентов.
Это видео показывает, как выполнить стента техники в человеческих сосудах с последующей трансплантацией в иммунодефицитных крыс иопределяет происхождение пролиферирующих клеток человека.
Protocol
1. Внутренней грудной артерии (IMA) подготовка
- Артериальной эндотелия оголенных при прохождении 2-французски артериального катетера Фогарти эмболэктомия (Baxter Healthcare, Дирфилд, штат Иллинойс, США). Катетер извлекается по всей длине судна в два раза, чтобы обеспечить повреждение эндотелия.
- Используйте любой человек стент длиной 8 мм и 2,5 мм, 3 мм в диаметре (например, Translumina, Yukon стента). ВНИМАНИЕ: диаметр стента не должна превышать диаметра сосуда более чем на 10%, чтобы избежать пре-и пост-стента стеноза. ВНИМАНИЕ: Не включайте длины стента в одном исследовании.
- Развертывание стента помощью соответствующего давления баллон (который отмечен на стент пакет) для достижения желаемого диаметра.
- Магазин стентированной IMA в 4 ° C RPMI + гепарин (500 IE/10 мл) на льду до трансплантации.
2. Подготовка животных
РНЕ Nude (Crl: NIH-Foxn1rnu) крысах (300-350 г) являются хоуСЭД в обычных условиях в scantainer вентилируемых шкафах, кормили стандартной крысы чау и автоклавного libidum объявление воды.
- Обезболить крыс с ИФ (2,5-3%) с помощью индукции камеры.
- Бритье волос брюшной и поместить крысу на спину и положите маску на нос и рот, чтобы не отставать анестезии.
- Лечить области живота широко используя Прово-йод, следующего использования 80% этанола - повторить этот шаг дважды. Проверьте рефлексы зажимая задние ноги, чтобы быть уверенным, что крысы достаточно анестезии.
- При микроскопическом зрения, выполнять верхняя срединная лапаротомия, чтобы разоблачить инфраренального брюшной аорты.
- Поместите кишечника в физиологическом увлажненной перчатки. Сложите перчатки вокруг кишечника, чтобы предотвратить потерю влаги.
- Проанализируйте аорты с инфраренального область бифуркации, осторожно, чтобы не нанести ущерб отраслям сосудов.
- Использование микро зажимы, чтобы остановить аортальный кровоток. Поместитепроксимальный зажим первым, а затем дистальная зажимом.
- Удаление приложения. 0,5-0,7 мм сегмент аорты и сбросить оставшиеся аорты с гепарином (200 единиц).
- Возьмите стентированной IMA и сократить его в достаточной длины и поместите его в щель.
- Подключите IMA получателю аорты, запустив швов использованием 8-0 проленовой шва (Ethicon, Нордерштедт, Германия).
- Осторожно откройте первую черепной зажим и хвостовой зажим.
- Там должен быть видимый импульс в пересаженной IMA и на дистальном конце аорты.
- Поместите кишечника обратно в брюшную полость.
- Флеш живот подогретого стерильного физиологического раствора.
- Закройте мышечного слоя брюшной стенки использование 6-0 проленовой работает швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия).
- В то время как крысы все еще находится в наркоз, вводят 4-5 мг / кг подкожно Carprofen.
- Администрирование послеоперационного обезболивания при необходимости (например, Carprofen или мелоксикам) в течение 3 дней после SurgЭри.
3. Представитель Результаты
Для гистологии, образцы были зафиксированы в 4%-ного формалина, обезвоживали в серии градуированных алкоголя, и проникли в смеси (ММА I) 80% метилметакрилата и 20% дибутилфталата на 1 день, ММА я с 1% сухого пероксида бензоила для 1 день, и я MMA с 3% перекисью бензоила сухой (ММА III) в течение 1-2 дней при температуре 4 ° C. После этого образцы полимеризуется в свежем ММА III в стеклянные ампулы в водяную баню на предварительно полимеризованный базы. Медленная полимеризация достигается путем удержания флаконах при температуре 26 ° С в течение ночи, повышение температуры до 28 ° C на следующее утро, а затем повышение температуры постепенно на 0,5 ° C в течение 12 ч до полимеризации произошло. Полимеризованного блоки были секционного 5 мкм толщины, используя Микро-HM 360 микротома оборудованы ножом карбида вольфрама.
Чтобы определить происхождение пролиферирующих клеток (рис. 1), сlides окрашивали антителами идентификации каждого зеленого флуоресцентного белка крысы (GFP) или MHC-I и человеческие клетки гладкой мускулатуры. Для этих исследований, человеческий IMA инкубировали с GFP ген-репортер ночь использованием лентивирусов частиц для стабильного трансдукции клеток IMA. Разделение дочерние клетки человеческого происхождения могут быть определены, выражая GFP. После депарафинизации, тепло-индуцированной эпитоп поиск выполняется путем нагрева слайдов антиген поиска решения с использованием пароход. Изображение-IT FX сигнал усилителя может быть использован для блокирования шаг. Клетки человеческого происхождения идентифицируются с помощью мыши моноклональных антител против GFP (1:100 разводят в основной растворитель антител (Dako)), а в дальнейшем помечены с козьим-анти-IgG мыши, Alexa Fluor 488 (1:1000 разводят в вторичными антителами разбавителя ). Гладкомышечных клеток были отмечены кролика polycolonal против гладкой мускулатуры α-актина (1:100 разводят в основной растворитель антитела), а затем козел-анти-IgG кролика, Alexa Fluoт 555 (1:1000 разводят в вторичными антителами растворители). Каждый шаг антител инкубацию проводили при 37 ° С в течение 1 часа в три раза PBS стиральная между ними. Ядра окрашивали DAPI в течение 10 минут. После монтажа слайды, используя продлить Золото реагент antifade, образцы были проанализированы с помощью конфокальной микроскопии.
Рисунок 1. Неоинтимы клеток человека гладкомышечных клеток.. Зеленый = анти GFP, маркировки клеток человеческого происхождения; красный = анти человека гладкий актин мышечных клеток, синий = DAPI, выявления клеточных ядер B: зеленый = анти крысы MHC-I, маркировка клетки крысы происхождения; красный = анти человека гладкий актин мышечных клеток, синий = DAPI, выявления клеточных ядер. Пролиферирующих клеток определены как гладкомышечных клеток и положительным для GFP, но и негативные для крыс MHC-I молекулы. Таким образом, пролиферирующие клетки человеческого происхождения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя различные модели в естественных условиях исследования существующих исследовать развитие гиперплазии интимы после стентирования, эти модели по-прежнему сталкиваются поступательное препятствия преодолеть. Кроме того, в больших моделях животных дорогие и специальные жилищные условия, а также хирургическое оборудование доступно не для всех лабораторий.
Использование человеческих IMA для изучения развития человеческой интимы распространение и в стентов рестеноз был изучен до ex-situ в орган культур 8,9. Новая модель гуманизированные IMA представляет собой поступательный подход к решению проблемы в стентов рестеноз в естественных условиях, путем имплантации человека IMA в брюшной аорты положение иммунодефицитных крыс. IMA человека являются идеально подходит размерам брюшной аорты крыс. Таким образом, наша представленная модель является воспроизводимым, легко и быстро выполнять, не требует специальной хирургической подготовки, инедорого.
Идентификация неоинтимы клеток человека гладкомышечных клеток закрывает поступательного разрыв в клинических условиях и показывает возможность исследовать человека патофизиологические процессы в живом организме.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят Кристиана Pahrmann за ее вклад. Особая благодарность Ethicon, Нордерштедт, Гамбург (Германия) для обеспечения шовного материала.
Финансирование
Соня Schrepfer получил грант от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992 / 3 1 и SCHR992/4-1).] Работа выполнена при поддержке ISHLT Shumway развития карьеры грантов 2010 года и исследования Фалька финансирования (Стэнфордский университет).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 French Fogarty catheter | Baxter Internationl Inc. | 120602F | |
| Yukon Stent | Translumina GmbH, Hechingen, Germany | Use the stent of your choice according to your study protocol | |
| RPMI media | Biochrom AG | Nr.F1275 | |
| heparin | Baxter Internationl Inc. | 2B0953 | |
| isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Provo-Iodine | Betadine Puredue Pharma | EAN:5995327165830 | |
| 80% ethanol | Geyer | ETV 80/0500 | |
| Micro clamp | Harvard Apparatus | PY2-61-0186 | |
| Sutures 8-0 | Johnson & Johnson | 2808G | |
| Sutures 6-0 | Johnson & Johnson | 1698 H | |
| Carprofen | Feizer Vet | PZN:0110208 | |
| Metamizol | Ratiopharm | ||
| Target retrieval solution, pH9 | Dako | S2368 | |
| Image-iT FX signal enhancer | Invitrogen | I36933 | |
| mouse monoclonal anti-GFP antibody | BD Biosciences | 632381 | |
| primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | |
| secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin | Abcam | ab5694 | |
| goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21430 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346 (2009).
- Oyamada, S. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-e95 (2011).
- Chamberlain, J. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44 (2010).
- Deuse, T. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134 (2008).
- Finn, A. V. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012 (2009).
- Tellez, A. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524 (2010).
- Suzuki, Y., Yeung, A. C., Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383 (2009).
- Holt, C. M. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
- Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).
