Summary
Abstract
Развитие культуры эпителиальных органотипической плот предоставил исследователям эффективным в пробирке системы, которая точно повторяет эпителиальной дифференцировки. Есть много применений для этой системы. Например, способность к росту трехмерных органотипической культуры плот кератиноцитов было важной вехой в изучении вируса папилломы человека (ВПЧ) 1. Жизненный цикл вируса папилломы человека тесно связана с дифференциацией плоского эпителия 2. Органотипической эпителиальных культуры плот, как показано здесь воспроизводить весь жизненный цикл вируса папилломы, в том числе вирус производства 3,4,5. Кроме того, эти культуры обладают плот диспластических поражений аналогичных тем, которые наблюдаются на в естественных условиях заражение ВПЧ. Таким образом, эта система также может быть использована для изучения клетки эпителиального рака, а также влияние препаратов на эпителиальной дифференцировки клеток в целом. Первоначально разработанная Asselineau и Prunieras
Protocol
1. Подготовка к органотипической культур Плот
- Сетки металла плоту много сначала обрабатывают хромовой кислоты серной, чтобы удалить все остатки, которые могут повлиять на процесс дифференциации. Погрузитесь сетки металла в стеклянный стакан, содержащий серную кислоту в течение одного часа, а затем непрерывно промывать ночь с водопроводной водой. После того, как быстро промыть, множество сетей должны быть промыты в течение 3-5 часов в дистиллированной воде.
- Чтобы обеспечить поддержку плоты, согните трех сторон плоту около 0,5 см, на равном расстоянии друг от друга. Металлические решетки должны быть в автоклаве.
- Подготовка 10X буфер восстановления путем добавления 2,2 г NaHCO3 и 4,8 г Hepes. Растворите в 100 мл 0,05 М NaOH. Фильтр стерилизовать и хранить в 5 мл аликвоты при -20 ° C.
- Подготовка 10X DMEM без бикарбоната натрия. Фильтр стерилизовать и хранить в 5 мл аликвоты при -20 ° C.
- Подготовить мышь эпидермального фактора роста: Растворите 100 мг ЭФР и 10 мг BSA каждый в 10 мл деионизированной DDH 2 0. Комбинат EGF и BSA и добавить 80 мл дистиллированной DDH 2 0 для общего объема 100 мл. Фильтр-стерилизации, аликвоты (5 мл) и хранить в -20 ° C. За каждый литр E среднего добавить 5 мл 1 мг / мл ЭФР (конечная концентрация 5 нг / мл).
2. Подготовка Коллаген Гели
- Один коллагеновый гель требуется для каждого плота. Коллагена должны быть на льду, чтобы предотвратить его затвердевания. Каждый коллагеновый гель требует 3 мл коллагена смесь, состоящую из: 2,4 мл холодной крысы хвост коллагена типа I (конечной концентрации 3-4 мг / мл), 0,3 мл 10х буфер восстановления, 0,3 мл 10 раз DMEM and1-2 × 10 6 мышь 3T3 фибробласты J2 как фидерных клеток. Для решения высокой концентрации коллагена хвост крысы, развести в 0,02 М уксусной кислоты для достижения правильной рабочей концентрации.
- Определить количество коллагена гели (плоты), вам нужно, а затем рассчитать мастер смеси на сумму коллагена, 10X reconstitution буфера, 10X DMEM и J2 фибробластов требуется. Включите достаточно в каждом мастер смесь в течение 3-4 дополнительных гели из-за вязкости коллагена.
- Для подготовки коллагеновый гель, trypsinize J2 фибробластов и нейтрализовать со средой. Смешайте все фибробластов и места в 50 мл конические пробирки. Подсчитайте клеток, чтобы определить количество плотов, которые могут быть сделаны. Опять же, 1-2х10 6 фибробластов требуется в коллагеновый гель и, следовательно, на плоту. Спином вниз клетки на низкой скорости.
- Аспирируйте среды от фибробластов гранул и ресуспендируют в соответствующей сумме 10X буфер восстановления, 10X DMEM и коллагена количество плотов рассчитаны. Добавить коллагена последнего для предотвращения затвердевания геля из слишком быстро. После того, коллаген добавил, смешать быстро, но осторожно, чтобы предотвратить введение пузырьков в геле. Гель должен быть красновато-оранжевый цвет, что свидетельствует о правильном рН. Если гель смесь слишком желтым, добавьте пару капель фильтр стерилизовать 1NNaOH и смесь осторожно, чтобы получить правильный цвет.
- Добавьте 3 мл коллагена: фибробластов смеси скважин на 6 и культуры блюдо. Коллагена смесь следует пипеткой медленно вниз стороне каждой лунке, чтобы избежать образования пузырьков. Поместите пластину в 37 ° C культуре ткани инкубатора и позволяет укрепить в течение 30 минут.
- Через 30 минут, добавить 3 мл E среду с ЭФР в начало укрепил коллагеновый гель и вернуть пластины в инкубатор. Гели должны храниться при температуре 37 ° C, по крайней мере один день, но использовались в течение четырех дней. Оптимальные результаты достигаются через два дня инкубации.
3. Подготовка к дифференциации кератиноцитов
- Низкий кератиноцитов проход следует выращивать около 70% слияния. Каждый плот требуется 1-2х10 6 кератиноцитов. Trypsinize кератиноцитов и нейтрализовать с электронной среде с ЭФР. Подсчитайте клеток, чтобы определить количество плотов, которые могут быть сделаны. Спином вниз клеток при низких специальноиздание Ресуспендируйте осадок в 1 мл E среду с ЭФР для каждой культуры рассчитывается плот.
- Аспирируйте среды от коллагена гели, наклоняя 6 лунками. Добавить 2 мл свежей среды E с ЭФР для каждого геля. Для каждого геля, осторожно добавить 1 мл ресуспендированного кератиноцитов в 2 мл E среду уже присутствует в скважине. Осторожно пипетки кератиноцитов плюс 2 мл средства массовой информации и пусть падение каплям назад на гель. Встряхиванием или раскачивание пластины может привести к неравномерному распределению клетки с одной стороны коллагеновый гель. Поместите пластину в 37 ° C инкубатора.
- Клетки должны быть выращены до слияния, заменив E среднего ежедневно. Клетки сливной когда среда изменений в желтый день после того, как изменения в среде. Это обычно занимает 2-4 дня. Если среда не изменилась по четвертый день, переходите к следующему шагу.
4. Изготовление плота культур
- Использование стерильного пинцета разместить стерильной сетки плот металла, наклонился вниз сторон, В 10 см блюдо. Аспирируйте среды от коллагеновый гель. Чтобы ослабить гель из сторон хорошо, идите по всему периметру гель стерильным шпателем использование вверх и вниз. Чтобы удалить коллагеновый гель, наклоните слегка пластины и снять, поставив под шпателем. Положите коллагеновый гель на металлической сетке без образования пузырьков между сеткой и геля. Два гели могут быть размещены на каждой сетке.
- Для того, чтобы воздух-жидкость, добавить E среде без EGF медленно на дно блюда, так что плот сетки касаются СМИ, но коллагеновый гель не является. СМИ не должны приходить через отверстия в сетке. Добавить среде медленно, чтобы избежать образования пузырьков под сеткой, так как это будет препятствовать единый дифференциации. Инкубируйте плотов при 37 ° С и изменить среду через день сохранении воздух-жидкость. Урожай плотах через 14 дней.
5. Представитель Результаты
При тон протокол выполняется правильно с первичным кератиноцитов, эта процедура приведет к хорошо дифференцированных эпителия, где различные слои кожи очевидны. Это будет достигнуто путем гистологического исследования путем окрашивания участков плот культур гематоксилином и эозином (H & E), как показано на рисунке 1b. H & E окраски также полезны для изучения морфологии плоты и эффект от вирусов и противовирусных веществ на способность клеток к стратификации и дифференциации. Например, плоты из ВПЧ-увековечены первичных человеческих кератиноцитов (HFK-31) заметно толще по сравнению с плотов из нормальных человеческих кератиноцитов крайней плоти (HFK), что отражает увеличение скорости распространения и способность белков ВПЧ поддерживать дифференциации клеток активных В клеточного цикла (рис. 1б) 10. Это приводит к сохранению ядра всей эпителия, в то время как нормальные кератиноциты выйти из клеточного цикла при дифференцировании, в результате распадаядерной оболочки. Чтобы более подробно изучить дифференциацию, иммуногистохимия могут быть выполнены, чтобы изучить специфические маркеры дифференциации, в том числе цитокератины, а также involucrin и филаггрина. Различные цитокератины выражаются в определенных стадиях дифференцировки 7. Как показано на рисунке 2, цитокератин 10 (K10) не выражается в базального слоя, и только в suprabasal слоев, которые состоят из клеток, постепенно дифференциации. В ВПЧ плоты, выражение K10 задерживается по сравнению с нормальным кератиноцитов, что опять же отражает влияние белков ВПЧ на дифференциацию кератиноцитов. Иммуногистохимическое также может быть использован для изучения профиля экспрессии вирусных генов. Показанный на рисунке 3, является представителем окрашивания изучения экспрессии белка ВПЧ E1 = E4, которая поздно белков, экспрессия которых ограничивается верхних слоев эпителия. Как и ожидалось, не окрашивание наблюдается в плот культур от нормальных Хумап плоти кератиноцитов.
Рисунок 1.) Очерк способ получения органотипической культуры плот из первичных кератиноцитов и эпителиальных клеточных линий. B) гематоксилин-эозином в органотипической культуры плот полученные от кератиноцитов человека крайняя плоть стабильно поддержания ВПЧ-31 (HFK-31) эписомы, или от нормальных человеческих кератиноцитов крайней плоти (HFK). Отдельные эпителиальные слои будут определены, а также коллаген вилкой.
Рисунок 2. Цитокератин 10 (K10) выражение ограничено suprabasal слоев эпителия. Иммуногистохимическое был выполнен на сечений органотипической культуры плот полученные от HFK-31 клеток, а также нормальное HFKs использованием антител к К10. Сотовые ДНК контрастным DAPI. Изображения были получены с помощью конфOCAL флуоресцентной микроскопии. Стрелки указывают базального слоя эпителия.
Рисунок 3. ВПЧ E1 = Е4 белка производится в конце продуктивной фазе жизненного цикла вируса. Иммуногистохимическое был выполнен на сечений органотипической культуры плот полученные от HFK-31 клеток, а также нормальное HFKs с использованием антител к E1E4. Сотовые ДНК контрастным DAPI. Изображения были получены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Стрелки указывают базального слоя эпителия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем метод, который может быть использован для изучения дифференциации эпителиальных в целом, но также может быть легко адаптирована для изучения вирусного патогенеза, а также эффективности потенциальных лекарственных препаратов. Многие вирусы целевой эпителиальных клеток в качестве основного очага инфекции, как и в случае с ВПЧ, или в определенный момент жизненного цикла вируса, как и вирусы герпеса. Несмотря на экономический рост органотипической культуры плоту много времени, способность точно повторять в естественных условиях дифференциации эпителиальных обеспечивает чрезвычайно полезный метод для изучения вируса: взаимодействие клетки-хозяина. Чтобы успешно вырастить полностью дифференцированных эпителия есть важные шаги, которые должны быть признаны. Для того, чтобы сохранить способность дифференцироваться в плот культуры, необходимо иметь достаточное количество фибробластов подачи в коллагеновый гель для поддержания кератиноцитов монослоя. Плохо дифференциации плот культур также может быть из-за слишком низкой плотности кератиноцитовна коллаген: фибробластов гель, неправильная конструкция плота, или неспособность изменить средства массовой информации каждый день. Еще один параметр, который необходимо учитывать, чтобы гарантировать качество эпителиальных дифференциации типа фибробластов подачи используется. По процедуре, описанной здесь, мыши 3T3 J2 фибробласты были использованы. В то время как другие фибробласты могут использоваться в качестве питателей, рекомендуется, что фибробласты, которые делятся быстро или потенциально могут мигрировать к кожной поверхности не должно быть used7. Хотя этот протокол предусматривает сбор плотах через 14 дней, плоты могут быть собраны до этого момента времени, а также после. Тем не менее, после 14 дней плоты будут постепенно становиться тоньше. В дополнение к секционирования плот культур для иммуногистохимического анализа, плоты могут быть собраны для РНК и ДНК, а также вирус производства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Салли Робертс (Университет Бирмингема, Бирмингем Великобритания) за любезное дар E1E4 антител. Эта работа была поддержана грантом Национального института рака (4R00CA137160-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| E medium11 | |||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections--a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
