Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires

Summary

Un

Abstract

Le développement de cultures organotypiques radeau épithéliales a fourni aux chercheurs un système efficace dans le système in vitro qui reproduit fidèlement la différenciation épithéliale récapitule. Il ya beaucoup d'utilisations de ce système. Par exemple, la capacité de croître des cultures tridimensionnelles radeau organotypiques de kératinocytes a été un jalon important dans l'étude du virus du papillome humain (VPH) ^1. Le cycle de vie du VPH est étroitement liée à la différenciation de l'épithélium pavimenteux ^2. Organotypiques cultures radeau épithéliales comme démontré ici de reproduire le cycle de vie complet du virus du papillome, y compris la production de virus ^3,4,5. En outre, ces cultures présentent des lésions dysplasiques radeau similaires à ceux observés lors de l'infection in vivo par le VPH. Par conséquent ce système peut également être utilisée pour étudier les cancers des cellules épithéliales, ainsi que l'effet des drogues sur la différenciation des cellules épithéliales en général. Initialement développé par Asselineau et Prunieras et al. ^7, le système épithélial organotypique culture radeau a mûri pour devenir un général, modèle de culture relativement facile, ce qui implique la croissance des cellules sur le collagène se branche maintenue à l'interface air-liquide (figure 1A). Au cours de 10-14 jours, les cellules de stratifier et de différencier, formant un épithélium sur toute son épaisseur qui produit la différenciation spécifiques cytokératines. Radeaux récoltées peuvent être examinés histologiquement, ainsi que par des techniques classiques moléculaires et biochimiques. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour la génération des cultures primaires de radeau des kératinocytes humains. La même technique peut être utilisée avec des lignées de cellules épithéliales, et peut facilement être adapté pour une utilisation avec du tissu épithélial à partir de biopsies normales ou malades ^8. De nombreux virus cibles soit l'épithélium cutané ou muqueux, dans le cadre de leur cycle de vie réplicative. Au cours des dernières années, la possibilité d'utiliser le culte radeau organotypiqueres comme une méthode d'étude des interactions virus-hôte cellulaire a été montré pour plusieurs virus de l'herpès, ainsi que les adénovirus, parvovirus, poxvirus et ^9. Cultures organotypiques radeau peut donc être adaptée afin d'examiner la pathogenèse virale, et sont les seuls moyens pour tester de nouveaux agents antiviraux pour les virus qui ne sont pas cultivables dans des lignées cellulaires permanentes.

Protocol

1. Préparation pour les cultures organotypiques Raft

1. Les grilles métalliques radeau bien d'abord être traités avec de l'acide sulfurique chromique pour enlever tout résidu qui pourrait interférer avec le processus de différenciation. Immerger les grilles métalliques dans un récipient en verre contenant de l'acide sulfurique pendant une heure, puis de façon continue rincés pendant la nuit avec l'eau du robinet. Après la nuit de rinçage, les grilles de radeau doit être rincé pendant 3-5 heures dans de l'eau bidistillée.
2. Pour fournir un soutien pour les radeaux, pliez trois côtés du radeau d'environ 0,5 cm à égale distance les uns des autres. Les grilles métalliques doit alors être autoclavés.
3. Préparer le tampon de reconstitution 10X en ajoutant 2,2 g NaHCO3 et 4,8 g Hepes. Dissoudre dans 100 ml de 0,05 M NaOH. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C.
4. Préparer le 10X DMEM sans bicarbonate de sodium. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C.
5. Préparer le facteur de croissance épidermique de la souris: Dissoudre 100 mg de l'EGF et 10 mg de BSA chaque dans 10 ml désionisée ddH ₂ 0. Combinez FEM et de la BSA et ajouter à 80 ml ​​d'eau désionisée ddH ₂ 0 pour un volume total de 100 ml. Filtrez-stériliser, partie aliquote (5 ml) et un magasin dans le -20 ° C. Pour chaque litre de milieu E, ajoutez 5 ml de 1 mg / ml EGF (concentration finale de 5 ng / ml).

2. Préparation de gels de collagène

1. Un gel de collagène est nécessaire pour chaque radeau. Le collagène doit être maintenu sur de la glace pour l'empêcher de se solidifier. Chaque gel de collagène nécessite 3 ml de mélange de collagène consistant en: 2,4 ml de collagène de type à froid de queue de rat I (concentration finale 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampon de reconstitution 10X, 10X 0,3 ml DMEM et1-2 X 10 ⁶ souris 3T3 J2 fibroblastes comme cellules nourricières. Pour les solutions à forte concentration de collagène de queue de rat, diluer dans 0,02 M d'acide acétique pour obtenir la concentration de travail correcte.
2. Déterminer le nombre de gels de collagène (radeaux), vous devrez, puis calculer un mélange maître pour la quantité de collagène, reconstit 10Xtampon ution, 10X DMEM et J2 fibroblastes nécessaire. Inclure suffisamment chaque Master Mix pour 3-4 gels supplémentaires dus à la viscosité du collagène.
3. Pour préparer le gel de collagène, trypsiniser les J2 fibroblastes et neutraliser avec le milieu. Mélanger tous les fibroblastes et les placer dans un flacon de 50 ml conique. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Encore une fois, le 1-2x10 ⁶ fibroblastes sont requis par un gel de collagène et donc par radeau. Isoler les cellules à faible vitesse.
4. Aspirer le milieu de la fibroblastes et une pastille de remettre en suspension dans la quantité appropriée de tampon de reconstitution 10X, 10X DMEM et du collagène pour le nombre de radeaux calculés. Ajouter le collagène dernière pour empêcher le gel de se solidifier trop rapidement. Une fois que le collagène est ajouté, mélanger rapidement, mais avec précaution pour prévenir l'introduction de bulles dans le gel. Le gel doit être d'une couleur orange rougeâtre, indiquant le bon pH. Si le mélange de gel est trop jaune, ajouter quelques gouttes de 1N, stérilisée par filtrationNaOH et mélanger doucement afin d'obtenir la bonne couleur.
5. Ajouter 3 ml du collagène: mélange des fibroblastes dans les puits d'une boîte de culture à 6 puits. Le mélange de collagène devrait être introduit à la pipette lentement sur le côté de chaque puits pour éviter de générer des bulles. Placer la plaque à 37 ° C incubateur de culture de tissu et laisser se solidifier pendant 30 minutes.
6. Après 30 minutes, ajouter 3 ml de milieu E avec de l'EGF au sommet du gel de collagène solidifié et retourner la plaque dans l'incubateur. Les gels doivent être conservés à 37 ° C pendant au moins un jour, mais utilisé dans les quatre jours. Résultats optimaux après deux jours d'incubation.

3. Préparer les kératinocytes différenciation

1. Kératinocytes passage bas devrait être augmenté pour atteindre environ 70% de confluence. Chaque radeau nécessite 1-2x10 ⁶ kératinocytes. Trypsiniser les kératinocytes et neutraliser avec le milieu E avec de l'EGF. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Isoler les cellules à faible SPEéd. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu E avec de l'EGF pour chaque culture radeau calculée.
2. Aspirer le milieu des gels de collagène en inclinant la plaque à 6 puits. Ajouter 2 ml de milieu E frais avec de l'EGF à chaque gel. Pour chaque gel, ajouter prudemment de 1 ml de kératinocytes remis en suspension les 2 ml de milieu E déjà présent dans le puits. Délicatement la pipette les kératinocytes, plus les 2 ml des médias, puis laisser tomber goutte à goutte de retour sur le gel. Agitant ou en faisant tourner la plaque peut entraîner la distribution inégale des cellules d'un côté du gel de collagène. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C.
3. Les cellules doivent être cultivées à confluence, remplaçant le milieu E par jour. Les cellules sont confluentes lorsque les changements de milieu au jaune un jour après un changement dans le milieu. Cela prend généralement 2-4 jours. Si le milieu n'a pas changé par quatre jours, passez à l'étape suivante.

4. Rendre les cultures Raft

1. Utilisez une pince stérile pour placer une grille métallique stérile radeau, se pencha vers le bas côtés, Dans une boîte de 10 cm. Aspirer le milieu de gel de collagène. Pour desserrer le gel sur les côtés du puits, rendez-vous autour du périmètre du gel avec une spatule stérile en utilisant un mouvement ascendant et descendant. Pour retirer le gel de collagène, inclinez légèrement la plaque et soulever en plaçant un sous spatule. Fixer le gel de collagène sur la grille métallique sans générer des bulles entre la grille et le gel. Deux gels peuvent être placés sur chaque grille.
2. Afin de rendre l'interface air-liquide, ajouter du milieu E sans EGF lentement vers le fond du plat de sorte que la grille de radeau est en contact avec les médias, mais le gel de collagène n'est pas. Les supports ne devrait pas venir au travers des trous dans la grille. Ajouter le support lentement pour éviter de générer des bulles sous la grille, car cela permettra d'éviter la différenciation uniforme. Incuber les radeaux à 37 ° C et changer le milieu tous les deux jours maintien de l'interface air-liquide. Récolter les radeaux après 14 jours.

5. Les résultats représentatifs

Lorsque te protocole est effectuée correctement avec des kératinocytes primaires, cette procédure se traduira par un épithélium bien différencié où les différentes couches de la peau sont évidentes. Ce sera atteint grâce à l'examen histologique par coloration des sections de cultures radeau pour l'hématoxyline et l'éosine (H & E), comme indiqué dans la figure 1B. Coloration H & E est également utile d'examiner la morphologie de radeaux et de l'effet des virus ou des composés antiviraux sur la capacité des cellules de stratifier et de se différencier. Par exemple, radeaux fabriqués à partir de HPV-immortalisées primaires de kératinocytes humains (HFK-31) sont sensiblement plus épais par rapport aux radeaux fabriqués à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK), reflétant une augmentation du taux de prolifération et la capacité des protéines HPV à maintenir les cellules de différenciation actifs dans le cycle cellulaire (figure 1B) ^10. Il en résulte en matière de rétention des noyaux à travers l'épithélium, alors que les kératinocytes normaux sortent du cycle cellulaire lors de la différenciation, ce qui entraîne une rupture de laenveloppe nucléaire. Examiner de plus près la différenciation, immunohistochimie peut être effectuée à examiner marqueurs de différenciation spécifiques, notamment cytokératines, ainsi que involucrine, et filaggrine. Cytokératines différentes sont exprimés à des stades spécifiques de la différenciation ^7. Comme le montre la figure 2, la cytokératine 10 (K10) n'est pas exprimé dans la couche basale, et ne se trouve dans les couches suprabasales qui se composent de cellules progressivement de différenciation. En radeaux HPV positives, l'expression de K10 est retardée par rapport à celle des kératinocytes normaux, ce qui reflète l'influence des protéines contre le VPH sur la différenciation des kératinocytes. L'immunohistochimie peut également être utilisée pour examiner le profil d'expression des gènes viraux. La figure 3 est une coloration représentant examinant l'expression de la protéine E1 HPV ^ E4, qui est une protéine dont la fin de l'expression est restreinte aux couches supérieures de l'épithélium. Comme prévu, aucune coloration n'est observée dans les cultures de radeau de la normale HUMAn kératinocytes de prépuce.

Figure 1. Un Plan) de la méthode pour la préparation de cultures organotypiques radeau à partir de kératinocytes primaires ou de lignées de cellules épithéliales. B) coloration hématoxyline et éosine des cultures organotypiques radeau générés à partir de kératinocytes de prépuce humain maintenir de façon stable contre le VPH-31 (HFK-31) épisomes, ou à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK). Les couches individuelles sont identifiées épithéliales, ainsi que le bouchon de collagène.

Figure 2. Cytokératine 10 (K10) l'expression est restreinte aux couches suprabasales de l'épithélium. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales en utilisant un anticorps à K10. L'ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l'aide confocal microscopie à fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l'épithélium.

Figure 3. Le VPH E1 ^ E4 protéines est produite à la fin de la phase productive du cycle de vie virale. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales à l'aide d'anticorps E1E4. L'ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l'aide microscopie confocale de fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l'épithélium.

Discussion

Nous décrivons ici une méthode qui peut être utilisé pour étudier la différenciation épithéliale en général, mais peut également être facilement adapté pour étudier la pathogenèse virale, ainsi que l'efficacité de traitements potentiels. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales, soit que le site primaire de l'infection, comme dans le cas du VPH, ou à un certain moment dans le cycle de vie du virus, comme avec des herpèsvirus. Bien que de plus en plus les cultures organotypiques radeau prend du temps, la capacité de reproduire fidèlement dans la différenciation épithéliale in vivo constitue une méthode extrêmement utile d'examiner le virus: les interactions de la cellule hôte. Pour se développer avec succès un épithélium complètement différencié il ya quelques étapes essentielles qui doivent être reconnus. Afin de conserver la capacité de se différencier dans les cultures du radeau, il faut avoir un nombre suffisant de mangeoires fibroblastes dans le gel de collagène pour maintenir la monocouche de kératinocytes. Faible différenciation dans les cultures radeau peut aussi être due à une densité trop faible des kératinocytessur le collagène: gel des fibroblastes, la construction radeau impropre, ou de l'échec de changer les médias tous les jours. Un paramètre supplémentaire qui doit être envisagé pour assurer la qualité de la différenciation épithéliale est le type de mangeoire des fibroblastes utilisés. Pour la procédure décrite ici, 3T3 de souris J2 fibroblastes ont été utilisés. Alors que les fibroblastes d'autres peuvent être utilisés comme départs, il est recommandé que les fibroblastes qui se divisent rapidement, ou qui pourraient migrer vers la surface cutanée ne pas être used7. Bien que ce protocole prévoit pour la récolte des radeaux après 14 jours, les radeaux peuvent être récoltés avant ce point du temps, comme après. Cependant, après 14 jours, les radeaux vont progressivement devenir plus mince. En plus de la coupe cultures radeau pour une analyse immunohistochimique, radeaux peuvent également être récoltés pour l'ARN et l'ADN, ainsi que la production de virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010