Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten

Summary

Ein

Abstract

Die Entwicklung von organotypischen Kulturen epithelialen Floß hat die Forscher mit einer effizienten In-vitro-System zur Verfügung gestellt, der naturgetreu rekapituliert epithelialen Differenzierung. Es gibt viele Einsatzmöglichkeiten für dieses System. So hat die Fähigkeit zur dreidimensionalen organotypischen Floß Kulturen von Keratinozyten wachsen war ein wichtiger Meilenstein in der Erforschung des humanen Papillomavirus (HPV) ^1. Der Lebenszyklus des HPV ist eng mit der Differenzierung von Plattenepithel ² verknüpft. Organotypische epithelialen Floß Kulturen wie hier gezeigt reproduzieren das gesamte Papillomavirus Lebenszyklus, einschließlich Virus-Produktion ^3,4,5. Darüber hinaus weisen diese Floß Kulturen Dysplasien der vergleichbar, die sich auf In-vivo-Infektion mit HPV. Daher kann dieses System auch verwendet werden, um Epithelzellen Krebsarten, sowie die Wirkung von Medikamenten auf Epithelzellendifferenzierung im allgemeinen zu untersuchen. Zitat von Asselineau und Prunieras entwickelt et al. ^7, der organotypischen Kultur epithelialen Floß-System in einer allgemeinen, relativ leicht Kultur Modell, das das Wachstum von Zellen auf Kollagen umfasst reifen Stecker gehalten bei einem Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (1A). Im Laufe von 10-14 Tagen, die Zellen Schichtung und Differenzierung, die Bildung eines vollständigen Dicke Epithel, das differenzierungsspezifische Cytokeratine produziert. Geerntet Flöße können histologisch untersucht werden, sowie von Standard-molekularen und biochemischen Techniken. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung von Raft-Kulturen aus primären humanen Keratinozyten. Die gleiche Technik kann mit bestimmten epithelialen Zelllinien verwendet werden, und kann leicht für die Verwendung mit Epithelgewebe von normalen oder kranken Biopsien ⁸ angepasst werden. Viele Viren zielen entweder auf die Haut oder Schleimhaut Epithel als Teil ihrer replikativen Lebenszyklus. In den vergangenen Jahren mit der Machbarkeit von organotypischen Floß Kultnahmen als Methode zur Untersuchung Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen seit mehreren Herpesviren, sowie Adenoviren, Parvoviren, und Pockenviren ⁹ gezeigt. Organotypische Floß Kulturen können somit an viralen Pathogenese zu untersuchen, und sind die einzigen Mittel, um neuartige antivirale Mittel für jene Viren, die nicht kultivierbaren in permanenten Zelllinien zu testen.

Protocol

1. Vorbereitung für Organotypische Floßkulturen

1. Die Metall-Gitter viel Floß zuerst mit Chromsäure Schwefelsäure behandelt werden, um alle Rückstände, die mit der Differenzierung können, zu entfernen. Tauchen Sie ein Metallgitter in einem Becherglas mit Schwefelsäure für eine Stunde, dann kontinuierlich über Nacht mit Leitungswasser abgespült. Nach der Nacht spülen, sollte Floß Grids für 3-5 Stunden in doppelt destilliertem Wasser abgespült werden.
2. Um die Unterstützung für den Flößen bereitzustellen, biegen drei Seiten des Floßes etwa 0,5 cm in gleichem Abstand voneinander. Die Metallgitter sollten dann autoklaviert werden.
3. Bereiten Sie die 10X Rekonstitutionspuffer durch Zugabe von 2,2 g NaHCO3 und 4,8 g HEPES. Gelöst in 100 ml 0,05 M NaOH. Filtern sterilisieren und lagern in 5 ml Aliquots bei -20 ° C.
4. Bereiten Sie die 10X DMEM ohne Natriumbicarbonat. Filtern sterilisieren und lagern in 5 ml Aliquots bei -20 ° C.
5. Planen Maus epidermalen Wachstumsfaktor: 100 mg von EGF und 10 mg BSA jeweils in 10 ml entionisiertem ddH ₂ 0. Kombinieren Sie EGF und BSA und fügen Sie zu 80 ml ​​deionisiertem ddH ₂ 0 für ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter-sterilisiert, Aliquot (5 ml) und Laden in der -20 ° C. Für jeden Liter E-Medium mit 5 ml von 1 mg / ml EGF (Endkonzentration 5 ng / ml).

2. Herstellung von Kollagen-Gelen

1. Ein Kollagengel für jede Reihe erforderlich. Das Kollagen sollten auf Eis, um es von Verfestigung zu verhindern gehalten werden. Jeder Kollagengel erfordert 3 ml Collagen Mischung bestehend aus: 2,4 ml kaltem Rattenschwanz Kollagen Typ I (Endkonzentration 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X Rekonstitutionspuffer, 0,3 ml DMEM 10X and1-2 x 10 ⁶ Maus 3T3 J2 Fibroblasten als Feeder-Zellen. Für hohe Konzentration von Lösungen Rattenschwanzkollagen, in 0,02 M Essigsäure verdünnen, um die korrekte Arbeit Konzentration zu erreichen.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der Kollagen-Gelen (Flöße) Sie brauchen, und berechnet dann einen Master-Mix für den Betrag von Kollagen, 10X reconstitution Puffer, 10x DMEM und J2 Fibroblasten erforderlich. Einschließen genug in jeder Master-Mix für 3-4 zusätzliche Gele aufgrund der Viskosität des Kollagens.
3. Um das Kollagen-Gel vorzubereiten, trypsinieren die J2 Fibroblasten und neutralisieren mit Medium. Kombinieren Sie alle Fibroblasten und in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zählen der Zellen, um die Anzahl von Flößen, die gemacht werden können bestimmen. Wiederum sind 1-2x10 ⁶ Fibroblasten pro Kollagengel erforderlich, und somit pro Floß. Spin-Down der Zellen bei niedrigen Drehzahlen.
4. Absaugen des Mediums aus dem Fibroblasten-Pellets und Resuspendieren in der entsprechenden Menge der Rekonstitutionspuffer 10X, 10X DMEM und Kollagen für die Anzahl von Flößen berechnet. In der letzten Kollagen, das Gel aus erstarrenden zu schnell zu verhindern. Sobald das Kollagen hinzugefügt wird, schnell mischen, sondern sanft, um die Einführung von Blasen in das Gel zu verhindern. Das Gel sollte eine rötlich-orange Farbe, was auf dem richtigen pH-Wert sein. Wenn das Gel Gemisch ist zu gelb, fügen Sie ein paar Tropfen sterilfiltriert 1NNaOH und vorsichtig mischen, um die richtige Farbe zu erhalten.
5. 3 ml des Kollagens: Fibroblasten-Gemisch auf die Vertiefungen einer 6-Well-Kulturschale. Die Kollagen-Mischung sollte langsam die Seite jedes Well pipettiert werden, um zu vermeiden, Erzeugen von Blasen. Die Platte wird in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator und lassen Sie ihn 30 Minuten lang erstarren.
6. Nach 30 Minuten 3 ml Medium E mit EGF an der Spitze des Kollagen-Gel verfestigt und die Platte zurück in den Inkubator. Die Gele bei 37 ° C für mindestens einen Tag aufbewahrt werden, verwendet innerhalb von vier Tagen. Optimale Resultate kommen nach zwei Tagen Inkubation.

3. Vorbereiten Keratinozyten zur Differenzierung

1. Niedrigen Gang Keratinozyten sollte auf etwa 70% Konfluenz gezüchtet werden. Jedes Floß erfordert 1-2x10 ⁶ Keratinozyten. Trypsinieren die Keratinozyten und neutralisieren mit E-Medium mit EGF. Zählen der Zellen, um die Anzahl von Flößen, die gemacht werden können bestimmen. Spin-Down der Zellen bei niedrigen spehrsg. Das Pellet in 1 ml Medium mit EGF-E für jedes Floß Kultur berechnet.
2. Absaugen des Mediums aus den Kollagengelen durch Kippen der 6-Well-Platte. 2 ml frisches Medium E mit dem EGF bei jedem Gel. Für jedes Gel, vorsichtig 1 ml des resuspendierten Keratinozyten zur 2 ml E-Medium bereits in dem Bohrloch. Pipette vorsichtig die Keratinozyten plus die 2 ml Medien und dann fallen lassen tropfenweise wieder auf das Gel. Schütteln oder Schwenken der Platte kann zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen zu einer Seite des Kollagengels führen. Die Platte wird in der 37 ° C Inkubator.
3. Die Zellen sollten bis zur Konfluenz gezüchtet werden und ersetzt das Medium E täglich. Die Zellen konfluent sind, wenn das Medium eine gelbe Farbe einen Tag nach einer Änderung im Medium. Dies dauert in der Regel 2-4 Tage. Wenn das Medium nicht von Tag vier geändert, um dem nächsten Schritt fort.

4. Making the Floßkulturen

1. Verwenden einer sterilen Pinzette, um ein steriles Metall Floß Netz zu stellen, beugte sich hinunter Seiten, In eine 10 cm-Schale. Saugen Sie das Medium aus Kollagen-Gel. Um das Gel von den Seiten des Bohrlochs zu lösen, um den Umfang des Gels gehen mit einem sterilen Spatel unter Verwendung eines Auf-und Abbewegung. Um das Kollagen-Gel entfernen, neigen Sie die Platte leicht und heben, indem Sie einen Spachtel darunter. Legen Sie den Kollagengel Auf dem Gitter ohne Erzeugen von Blasen zwischen dem Gitter und dem Gel. Zwei Gele können auf jedem Raster platziert werden.
2. Um eine Luft-/Flüssigkeits-Schnittstelle zu machen, fügen E-Medium ohne EGF langsam auf den Boden der Schale, so das Floß Gitter berührt die Medien, sondern das Kollagengel ist. Die Medien sollten nicht durch die Löcher in dem Gitter kommen. Fügen Sie das Medium langsam zu vermeiden Erzeugen von Blasen unter dem Raster, da diese einheitliche Differenzierung verhindern. Inkubieren der Flöße bei 37 ° C und ändern das Medium alle zwei Tage Aufrechterhaltung der Luft-/Flüssigkeits-Schnittstelle. Ernten Sie die Flöße nach 14 Tagen.

5. Repräsentative Ergebnisse

Wenn ter Protokoll richtig mit primären Keratinozyten durchgeführt wird dieses Verfahren in einem gut differenzierten Epithel, wo die verschiedenen Schichten der Haut ergeben sich führen. Diese durch die histologische Untersuchung durch Färbung Abschnitte Floß Kulturen für Hämatoxylin und Eosin (H & E), wie in 1B gezeigt, erreicht werden. H & E-Färbung ist auch nützlich, um die Morphologie der Flöße und die Wirkung von Viren oder antiviralen Verbindungen auf die Fähigkeit der Zellen zur Schichtung und Differenzierung zu untersuchen. Zum Beispiel werden Flöße aus HPV-immortalisierten primären humanen Keratinozyten (HFK-31) machte vor allem dicker auf Flößen aus normalen menschlichen Keratinozyten Vorhaut (HFK) verglichen, was auf eine erhöhte Rate von Proliferation und die Fähigkeit der HPV-Proteine ​​zu erhalten differenzierenden Zellen aktiv im Zellzyklus (1B) ^10. Das führt zum Rückstau von Kernen im gesamten Epithel, während die normalen Keratinozyten Verlassen des Zellzyklus auf Differenzierung, was zu einem Zusammenbruch derKernhülle. Um genauer zu untersuchen Differenzierung kann Immunhistochemie durchgeführt, um spezifische Differenzierung Marker, einschließlich Zytokeratine sowie Involucrin und Filaggrin zu untersuchen. Verschiedene Zytokeratine sind in bestimmten Phasen der Differenzierung ⁷ ausgedrückt. Wie in 2 gezeigt ist, ist Cytokeratin 10 (K10) nicht in der Basalschicht ausgedrückt und wird nur in den Suprabasalschichten, der aus Zellen bestehen schrittweise Differenzierung vorhanden. In HPV-positiven Flöße, wird die Expression des K10 im Vergleich zu der normalen Keratinozyten, wiederum als den Einfluss von HPV-Proteinen auf Differenzierung der Keratinozyten verzögert. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um die Expression von viralen Genen zu untersuchen. In Abbildung 3 ist eine repräsentative Färbung, die Expression der HPV-Protein E1 ^ E4, die eine späte Protein, dessen Expression in die obersten Schichten des Epithels beschränkt ist. Wie erwartet, wird keine Färbung in Floß Kulturen von normalen Huma beobachtetn Vorhaut Keratinozyten.

Abbildung 1. A) Darstellung von Verfahren zur Herstellung von organotypischen Kulturen Floß aus primären Keratinozyten oder epithelialen Zelllinien. B) Hämatoxylin-und Eosin-Färbung von organotypischen Kulturen Floß aus menschlicher Vorhaut Keratinozyten stabil halten HPV-31 (HFK-31) Episomen, oder aus normalen menschlichen Keratinozyten Vorhaut (HFK) generiert. Die einzelnen Epithelschichten identifiziert, sowie die Kollagen-Stecker.

Abbildung 2. Cytokeratin 10 (K10) Ausdruck wird in den suprabasalen Schichten des Epithels beschränkt. Die Immunhistochemie wurde an Querschnitten von organotypischen Raft-Kulturen von HFK-31-Zellen, ebenso wie normale HFKs Verwendung eines Antikörpers gegen K10 erzeugt wird. Zelluläre DNA wurde mit DAPI gegengefärbt. Bilder wurden unter Verwendung confÖcal Fluoreszenzmikroskopie. Die Pfeile zeigen die Basalschicht des Epithels.

Abbildung 3. Der HPV-E1 ^ E4-Protein wird spät in die produktive Phase des viralen Lebenszyklus produziert. Die Immunhistochemie wurde an Querschnitten von organotypischen Raft-Kulturen von HFK-31-Zellen, ebenso wie normale HFKs Verwendung von Antikörpern gegen E1E4 erzeugt wird. Zelluläre DNA wurde mit DAPI gegengefärbt. Bilder wurden unter Verwendung der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Die Pfeile zeigen die Basalschicht des Epithels.

Discussion

Wir beschreiben hier eine Methode, die verwendet werden, um epitheliale Differenzierung im allgemeinen studieren kann, kann aber auch einfach an viralen Pathogenese, sowie die Wirksamkeit von potenziellen Therapeutika zu studieren. Viele Viren Ziel Epithelzellen entweder als primäre Ort der Infektion, wie im Fall von HPV, oder an irgendeinem Punkt in dem viralen Lebenszyklus, wie bei Herpesviren. Obwohl wachsende organotypischen Kulturen Floß ist zeitaufwendig, die Fähigkeit, treu in vivo epithelialen Differenzierung rekapitulieren bietet eine extrem nützliche Methode, um Viren zu untersuchen: Wirtszelle Interaktionen. Um erfolgreich einen ausdifferenzierten Epithel gibt es einige kritische Schritte die bestätigt werden muss. Um die Fähigkeit, in Raft-Kulturen unterscheiden zu erhalten, muss man eine ausreichende Anzahl von Fibroblasten Zuführungen der Kollagengel die Keratinozyten Monoschicht zu halten. Schlechte Differenzierung in Floß Kulturen kann auch darauf zurückzuführen sein, eine zu geringe Dichte von Keratinozytenauf dem Kollagen: Fibroblasten-Gel, unsachgemäße Floßbau oder Misserfolg ändern die Medien jeden Tag. Ein weiterer Parameter, der als die Qualität der Epitheldifferenzierung werden müssen, damit ist die Art der Fibroblasten-Feeder verwendet. Für die hier beschriebene Vorgehensweise, wurden Maus-3T3 J2 Fibroblasten verwendet. Während andere Fibroblasten als Zubringer verwendet werden können, wird empfohlen, dass Fibroblasten, teilen sich rasch, oder möglicherweise bis zu migrieren die Hautoberfläche nicht used7 sein. Obwohl dieses Protokoll fordert für die Ernte von den Flößen nach 14 Tagen, kann Flöße vor diesem Zeitpunkt, wie auch nach geerntet werden. Doch nach 14 Tagen die Flöße werden zunehmend dünner. Neben Schneiden Raft-Kulturen für die immunhistochemische Analyse, können auch Flöße für RNA und DNA, sowie die Virus-Produktion geerntet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010