Summary
एक
Protocol
1. Organotypic बेड़ा संस्कृति के लिए तैयार
- धातु बेड़ा ग्रिड बहुत पहले को क्रोमिक सल्फ्यूरिक एसिड के साथ इलाज किया जा करने के लिए कि भेदभाव प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकता है किसी भी अवशेषों को हटा दें. एक घंटे के लिए सल्फ्यूरिक एसिड युक्त एक गिलास बीकर में विसर्जित धातु ग्रिड, तो नल का पानी के साथ लगातार रात भर से rinsed. बाद कुल्ला रातोंरात, बेड़ा ग्रिड दोहरा आसुत जल में 3-5 घंटे के लिए rinsed होना चाहिए.
- Rafts के लिए सहायता प्रदान करने के लिए, समान दूरी पर एक दूसरे से 0.5 सेमी के बारे में बेड़ा की तीन पक्षों मोड़. धातु ग्रिड तो autoclaved किया जाना चाहिए.
- 2.2 छ NaHCO3 और 4.8 ग्राम Hepes जोड़कर 10X पुनर्गठन बफर तैयार. 0.05 एम NaOH की 100 मिलीलीटर में भंग. फ़िल्टर बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर aliquots में स्टोर
- सोडियम बिकारबोनिट के बिना 10X DMEM तैयार करते हैं. फ़िल्टर बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर aliquots में स्टोर
- माउस epidermal वृद्धि कारक तैयार: EGF की 100 मिलीग्राम और 10 मिलीग्राम बी के भंग10 मिलीलीटर में प्रत्येक एसए 2 DDH 0 विआयनीकृत. EGF और बीएसए का मिश्रण है और 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए विआयनीकृत DDH 2 0 80 मिलीलीटर जोड़ें. फ़िल्टर बाँझ, अशेष भाजक (5 मिलीलीटर) और -20 डिग्री सेल्सियस में दुकान ई मध्यम के प्रत्येक लीटर के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल EGF (अंतिम एकाग्रता 5 एनजी / एमएल) की 5 मिलीलीटर जोड़ें.
2. कोलेजन जैल की तैयारी
- एक कोलेजन जेल हर बेड़ा के लिए आवश्यक है. कोलेजन solidifying से रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए. ठंड चूहा पूंछ कोलेजन मैं (अंतिम एकाग्रता 3-4 मिलीग्राम / एमएल), 0.3 मिलीग्राम 10X पुनर्गठन बफर, 0.3 मिलीग्राम 10X DMEM and1-2 माउस 10 6 एक्स प्रकार के 2.4 मिलीलीटर प्रत्येक कोलेजन जेल कोलेजन की निर्वाचकगण के मिश्रण के 3 मिलीग्राम की आवश्यकता है फीडर कोशिकाओं के रूप में 3T3 fibroblasts J2. चूहे की पूंछ कोलेजन के उच्च एकाग्रता के समाधान के लिए, 0.02 एम एसिटिक एसिड में पतला करने के लिए सही काम कर रहे एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए.
- कोलेजन जैल (rafts) की संख्या तुम्हारी जरूरत है और फिर कोलेजन की राशि, 10X reconstit के लिए एक मास्टर मिश्रण की गणना का निर्धारणution बफर, 10X DMEM के J2 fibroblasts की आवश्यकता है. प्रत्येक मास्टर मिश्रण में 3-4 अतिरिक्त कोलेजन की चिपचिपाहट के कारण जैल के लिए पर्याप्त शामिल हैं.
- कोलेजन जेल तैयार, J2 fibroblasts trypsinize है और मध्यम के साथ बेअसर. एक 50 मिलीलीटर चोटीदार शीशी में fibroblasts और जगह मिश्रण. कोशिकाओं गिनती करने के लिए rafts कि बनाया जा सकता है की संख्या का निर्धारण करने के लिए. फिर, 1-2x10 6 fibroblasts कोलैजेन जेल प्रति आवश्यक हैं और इस तरह बेड़ा प्रति. कम गति पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
- Fibroblast गोली तथा resuspend के से 10X पुनर्गठन बफर, 10X DMEM के और गणना rafts का संख्या के लिए कोलेजन की उचित मात्रा में मध्यम महाप्राण (व्यंजन). कोलेजन भी जल्दी solidifying से जेल को रोकने के लिए पिछले जोड़ें. एक बार कोलेजन जोड़ा जाता है, जल्दी मिश्रण है, लेकिन धीरे जेल में बुलबुले की शुरूआत को रोकने. जेल एक लाल नारंगी रंग, सही पीएच का संकेत होना चाहिए. यदि जेल मिश्रण भी पीला है, फिल्टर निष्फल 1N की बूंदों के एक जोड़े को जोड़नेNaOH और मिश्रण धीरे सही रंग प्राप्त करने के लिए.
- कोलेजन के 3 मिलीग्राम जोड़ें: एक अच्छी तरह से संस्कृति 6 डिश के कुओं लिए तंतुप्रसू मिश्रण. बुलबुले पैदा करने से बचने के प्रत्येक अच्छी तरह से की ओर धीरे धीरे नीचे कोलेजन मिश्रण pipetted किया जाना चाहिए. एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस और 30 मिनट के लिए जमना होने की अनुमति देते हैं.
- 30 मिनट के बाद, EGF साथ जम कोलेजन जेल के शीर्ष करने के लिए ई मध्यम के 3 मिलीग्राम और जोड़ने के इनक्यूबेटर करने के लिए थाली लौटने. जैल कम से कम एक दिन के लिए 37 ° सी में रखा जाना चाहिए लेकिन चार दिनों के भीतर इस्तेमाल किया. इष्टतम परिणाम ऊष्मायन के दो दिनों के बाद होते हैं.
3. भेदभाव के लिए तैयारी keratinocytes
- कम बीतने keratinocytes confluency के लिए लगभग 70% हो जाना चाहिए. प्रत्येक बेड़ा 1 - 2x10 6 keratinocytes की आवश्यकता है. Keratinocytes Trypsinize और EGF साथ ई के माध्यम से बेअसर. कोशिकाओं गिनती करने के लिए rafts कि बनाया जा सकता है की संख्या का निर्धारण करने के लिए. नीचे कम विशेष कोशिकाओं स्पिनएड. EGF साथ प्रत्येक बेड़ा संस्कृति की गणना के लिए ई के माध्यम के 1 मिलीग्राम में गोली Resuspend.
- कोलेजन जैल से झुकने 6 अच्छी तरह से थाली से मध्यम महाप्राण (व्यंजन). प्रत्येक जेल के लिए EGF के साथ ताजा ई मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें. प्रत्येक जेल के लिए, ध्यान से ई पहले से ही अच्छी तरह से में मौजूद मध्यम 2 मिलीलीटर resuspended keratinocytes के 1 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे keratinocytes pipet से अधिक मीडिया के 2 मिलीग्राम और फिर गिरावट जेल पर वापस ड्रॉप के लिहाज से करते हैं. हिलती या थाली कमाल कोलेजन जेल के एक तरफ करने के लिए कोशिकाओं की असमान वितरण में हो सकता है. 37 ° सी इनक्यूबेटर में प्लेट रखें.
- कोशिकाओं confluency हो जाना चाहिए, ई मध्यम दैनिक जगह. कोशिकाओं मिला हुआ है जब मध्यम में परिवर्तन के बाद पीला एक दिन के लिए मध्यम परिवर्तन. यह आमतौर पर 2-4 दिन लगते हैं. यदि मध्यम चार दिन से नहीं बदला है, तो अगले चरण पर जाएँ.
4. बेड़ा संस्कृति बनाना
- बाँझ संदंश का प्रयोग करने के लिए एक बाँझ धातु बेड़ा ग्रिड जगह, पक्षों नीचे तुला, एक 10 सेमी पकवान में. कोलेजन जेल से मध्यम महाप्राण (व्यंजन). अच्छी तरह से की तरफ से जेल ढीला, एक बाँझ एक ऊपर और नीचे गति का उपयोग रंग के साथ जेल की परिधि के चारों ओर जाओ. कोलेजन जेल को निकालने के लिए, थाली थोड़ा झुकाव और एक रंग नीचे रखने से उठा. ग्रिड और जेल के बीच बुलबुले पैदा करने के बिना धातु ग्रिड पर कोलेजन जेल रखना. दो जैल प्रत्येक ग्रिड पर रखा जा सकता है.
- क्रम में एक अंतरफलक हवा तरल बनाने के लिए, धीरे धीरे EGF बिना ई मध्यम पकवान की तह तक तो बेड़ा ग्रिड मीडिया को छू रहा है जोड़ सकते हैं लेकिन कोलेजन जेल नहीं है. मीडिया ग्रिड में छेद के माध्यम से नहीं आना चाहिए. ग्रिड के तहत बुलबुले पैदा करने, के रूप में इस वर्दी भेदभाव को रोकने से बचने के माध्यम धीरे जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर rafts सेते हैं और मध्यम हर दूसरे दिन बदल हवा तरल अंतरफलक को बनाए रखने. 14 दिनों के बाद फसल rafts.
5. प्रतिनिधि परिणाम
टी जबवह प्रोटोकॉल सही ढंग से प्राथमिक keratinocytes के साथ किया जाता है, इस प्रक्रिया में एक अच्छी तरह से विभेदित उपकला जहां त्वचा की विभिन्न परतों के स्पष्ट कर रहे हैं में परिणाम देगा. इस histological परीक्षा के माध्यम से hematoxylin और लाल भामसान रंग (एच एंड ई) के लिए बेड़ा संस्कृतियों, के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया वर्गों धुंधला हो जाना द्वारा प्राप्त किया जाना है. एच ई धुंधला हो जाना भी है rafts और कोशिकाओं की क्षमता को विभक्त हो जाना और अंतर पर वायरस या antiviral यौगिकों के प्रभाव की आकारिकी की जांच करने के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, एचपीवी अमर प्राथमिक मानव keratinocytes (HFK 31) से बना rafts विशेष रूप से मोटा सामान्य मानव चमड़ी keratinocytes (HFK) के से बनाया rafts, प्रसार और एचपीवी प्रोटीन फर्क कोशिकाओं को सक्रिय बनाए रखने की क्षमता की वृद्धि दर को दर्शाती है सेल चक्र में (चित्रा 1 बी) 10. उपकला भर नाभिक बनाए रखने में यह परिणाम है, जबकि सामान्य keratinocytes भेदभाव पर सेल चक्र से बाहर निकलने की एक बे्रकडाउन में जिसके परिणामस्वरूपपरमाणु लिफाफा. को और अधिक बारीकी से भेदभाव की जांच करने के लिए, immunohistochemistry विशिष्ट भेदभाव मार्करों, cytokeratins, के रूप में अच्छी तरह से, और involucrin filaggrin की जांच करने के लिए किया जा सकता है. अलग cytokeratins 7 भेदभाव के विशिष्ट चरणों में व्यक्त कर रहे हैं. 10 cytokeratin (K10) चित्रा 2 में दिखाया गया है, बेसल परत में व्यक्त नहीं है, और केवल suprabasal परतों कि उत्तरोत्तर फर्क कोशिकाओं से मिलकर बनता है में पाया. एचपीवी सकारात्मक rafts में, K10 की अभिव्यक्ति सामान्य keratinocytes, फिर keratinocyte भेदभाव पर एचपीवी प्रोटीन के प्रभाव को दर्शाती है की तुलना में देरी हो रही है. Immunohistochemistry भी वायरल जीनों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 चित्र में दिखाया एक प्रतिनिधि एचपीवी प्रोटीन E1 ^ E4, जो एक देर प्रोटीन जिनकी अभिव्यक्ति है उपकला के ऊपरवाला परतों के लिए प्रतिबंधित है की अभिव्यक्ति की जांच धुंधला है. जैसी उम्मीद थी, नहीं धुंधला हो जाना बेड़ा संस्कृतियों में सामान्य ह्यूमा से मनाया जाता हैचमड़ी keratinocytes एन.
चित्रा 1. प्राथमिक keratinocytes या उपकला कोशिका लाइनों से organotypic बेड़ा संस्कृतियों की तैयारी के लिए विधि का एक) को रेखांकित करें. बी) organotypic बेड़ा मानव चमड़ी stably एचपीवी (HFK 31)-31 episomes, या सामान्य मानव चमड़ी keratinocytes (HFK) के से बनाए रखने keratinocytes से उत्पन्न संस्कृतियों के Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना. व्यक्तिगत उपकला परतों की पहचान कर रहे हैं के रूप में कोलेजन प्लग के रूप में अच्छी तरह से.
चित्रा 2. Cytokeratin 10 अभिव्यक्ति (K10) उपकला के suprabasal परतों के लिए प्रतिबंधित है. Immunohistochemistry organotypic बेड़ा HFK 31-कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य HFKs K10 के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर से उत्पन्न संस्कृतियों के पार वर्गों पर किया गया था. सेलुलर डीएनए DAPI के साथ counterstained किया गया था. छवियाँ% s का उपयोग कर कब्जा कर लिया गयाocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. तीर उपकला बेसल परत से संकेत मिलता है.
चित्रा 3. एचपीवी E1 ^ E4 प्रोटीन वायरल जीवन चक्र का उत्पादक चरण में देर से उत्पादन किया है. Immunohistochemistry organotypic बेड़ा HFK 31-कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सामान्य HFKs E1E4 के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर से उत्पन्न संस्कृतियों के पार वर्गों पर किया गया था. सेलुलर डीएनए DAPI के साथ counterstained किया गया था. छवियाँ confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. तीर उपकला बेसल परत से संकेत मिलता है.
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Discussion
हम यहाँ एक विधि का वर्णन है कि सामान्य में उपकला भेदभाव के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन भी आसानी से करने के लिए वायरल रोगजनन, साथ ही संभावित चिकित्सा की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. कई वायरस उपकला कोशिकाओं या तो संक्रमण का प्राथमिक साइट के रूप में, लक्ष्य के रूप में एचपीवी के मामले में, या वायरल जीवन चक्र में कुछ बिंदु पर herpesviruses के साथ के रूप में. मेजबान सेल बातचीत: हालांकि organotypic बेड़ा संस्कृतियों से बढ़ समय लगता है, ईमानदारी से vivo में उपकला भेदभाव में पुनरावृत्ति करना वायरस की जांच के लिए एक अत्यंत उपयोगी तरीका प्रदान करता है की क्षमता है. सफलतापूर्वक एक पूरी तरह विभेदित उपकला बढ़ने वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि स्वीकार किया जाना चाहिए रहे हैं. क्रम में बेड़ा संस्कृतियों में अंतर करने की क्षमता बनाए रखने के लिए, एक कोलेजन जेल में एक तंतुप्रसू भक्षण के लिए पर्याप्त संख्या है keratinocyte monolayer बनाए रखने चाहिए. बेड़ा संस्कृतियों में गरीब भेदभाव भी keratinocytes की वजह से बहुत कम घनत्व हो सकता हैकोलेजन पर: fibroblast जेल, अनुचित बेड़ा निर्माण, या विफलता के लिए मीडिया को हर रोज बदलने के. एक अतिरिक्त पैरामीटर है कि को उपकला भेदभाव की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए इस्तेमाल किया तंतुप्रसू फीडर के प्रकार है. के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित, माउस 3T3 J2 fibroblasts इस्तेमाल किया गया है. जबकि अन्य fibroblasts भक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह अनुशंसा की जाती है कि fibroblasts है कि तेजी से विभाजित, या संभावित त्वचीय सतह की ओर पलायन हो सकता है used7 नहीं. हालांकि इस प्रोटोकॉल rafts का 14 दिनों के बाद कटाई के लिए कहता है, rafts के इस समय बिंदु से पहले, के रूप में अच्छी तरह के बाद काटा जा सकता है. हालांकि, 14 दिनों के बाद rafts के उत्तरोत्तर पतली हो जाएगा. Immunohistochemical विश्लेषण बेड़ा संस्कृतियों सेक्शनिंग करने के लिए इसके अलावा, rafts भी शाही सेना और डीएनए के रूप में अच्छी तरह से वायरस उत्पादन के लिए काटा जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के सैली रॉबर्ट्स (बर्मिंघम, बर्मिंघम, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय) E1E4 एंटीबॉडी की तरह उपहार के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (4R00CA137160 03) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| E medium11 | |||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
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