Summary
Abstract
organotypic 상피 뗏목 문화의 발달은 체외 시스템을 충실히 recapitulates 상피 분화에 효율적으로 연구자를 제공합니다. 이 시스템에 대한 많은 용도가 있습니다. 예를 들어, keratinocytes의 입체 organotypic 뗏목 문화를 성장하는 능력은 인간 papillomavirus (HPV) 1의 연구에 중요한 이정표가되었습니다. HPV의 라이프 사이클은 긴밀하게 편평 상피 2의 분화에 링크되어 있습니다. 같은 Organotypic 상피 뗏목 문화가 여기에 바이러스 생산 3,4,5 포함한 전체 papillomavirus 수명주기를 재현 보여주었다. 또한, 이러한 뗏목 문화가 HPV와 생체내 감염에 따라 관찰 비슷한 dysplastic 병변을 나타냅니다. 따라서이 시스템은 또한 상피 세포 암뿐만 아니라, 일반적으로 상피 세포 분화에 대한 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 원래 Asselineau 및 Prunieras 개발한
Protocol
1. Organotypic 뗏목 문화를위한 준비
- 금속 뗏목 격자가 훨씬 먼저 분화 과정을 방해할 수있는 찌꺼기를 제거하는 삼가의 크롬을 함유하는 제품 황산으로 처리됩니다. 한 시간 만이라도 황산이 들어있는 유리 비커에 잠그다 금속 격자는 다음 지속적으로 수돗물로 씻어서 하룻밤. 린스 하룻밤 후, 뗏목 격자가 이중으로 증류수에 3-5시간 위해 씻어서되어야합니다.
- 보트에 대한 지원을 제공하기 위해 서로 동등한 거리에서 0.5 cm에 대한 뗏목 세 가지 측면을 구부. 금속 격자 그런 다음 autoclaved해야합니다.
- 2.2 g NaHCO3 및 4.8 g의 Hepes을 추가하여 10X reconstitution 버퍼를 준비합니다. 0.05 M NaOH의 100 ML에 디졸브. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장
- 나트륨 중탄산염없이 10X DMEM을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장
- 마우스 표피 성장 인자를 준비 : EGF의 100 MG와 B의 10 밀리그램을 디졸브SA 10 ML에서 각각 ddH 2 0를 deionized. EGF와 BSA를 결합 및 100 ML의 총 볼륨의 deionized ddH 2 0 80 ML에 추가합니다. 필터 소독, 나누어지는 (5 ML) 및 -20 ° C.에 저장 전자 매체의 각 리터에 대해 1 밀리그램 / ML EGF (최종 농도 5 NG / ML) 5 ML에 추가합니다.
2. 콜라겐 젤의 작성
- 하나는 콜라겐 젤은 각 뗏목이 필요합니다. 콜라겐이 응고하지 않도록 얼음에 보관해야합니다. 추위 쥐 - 꼬리 콜라겐 유형 I (최종 농도 3-4 밀리그램 / ML), 0.3 ML 10X reconstitution 버퍼, 0.3 ML 10X DMEM and1-2 X 10 6 마우스의 2.4 ML : 각 콜라겐 젤은 구성된 콜라겐 믹스 3 ML이 필요합니다 피더 세포와 같은 3T3 J2 섬유아 세포. 쥐의 꼬리 콜라겐의 높은 농도 솔루션의 경우 올바른 작동 농도를 달성하기 위해 0.02 M 초산에 희석.
- 당신은 콜라겐의 양을, 10X reconstit위한 마스터 믹스를 계산 후 필요합니다 콜라겐 젤 (보트)의 개수를 결정ution 버퍼, 10X DMEM과 J2 섬유아 세포가 필요합니다. 콜라겐의 점성으로 인해 3-4 여분 젤류 각 마스터 믹스에 충분히 포함합니다.
- 콜라겐 젤을 준비하려면, J2 섬유아 세포를 trypsinize와 매체로 무력화. 50 ML 원뿔 유리병의 모든 섬유아 세포와 장소를 결합. 만들 수 보트의 수를 결정하는 세포를 세어보세요. 다시 말하지만, 1-2x10 6 섬유아 세포는 뗏목 당 따라서 콜라겐 젤별로 요구하고있다. 낮은 속도로 세포를 내려 봐.
- 10X reconstitution 버퍼, 10X DMEM과 계산 보트의 수를위한 콜라겐의 적절한 금액 fibroblast 펠렛과 resuspend에서 매체를 기음. 너무 빨리 응고에서 젤을 방지하기 위해 콜라겐이 마지막에 추가합니다. 콜라겐이 추가되면 젤로 거품의 도입을 방지하기 위해 부드럽게 빠르게 섞는다지만. 겔은 올바른 산도 나타내는 붉은 오렌지 색상이어야합니다. 겔 혼합물이 너무 노란색 경우 필터 소독 1N의 안약 몇 가지 추가NaOH와 혼합 부드럽게 정확한 색상을 구하십시오.
- 콜라겐 3 ML 추가 : fibroblast 혼합물을 6 아니라 문화 접시의 우물에. 콜라겐 혼합물은 거품을 발생하지 않도록 천천히 각 우물의 측면 아래로 pipetted해야합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 금속판을 놓고 30 분 동안 응고 수 있습니다.
- 30 분 후에, 경화 콜라겐 젤 위쪽에 EGF와 전자 매체 3 ML을 추가하고 배양기에 플레이트를 반환합니다. 젤은 최소한 하루에 37 ° C에서 보관 아니고 넷 일 이내에 사용해야합니다. 최적의 결과는 부화 두 가지 일 후에 발생합니다.
3. 차별 화를위한 준비 Keratinocytes
- 낮은 통로 keratinocytes는 약 70 % confluency로 성장해야한다. 각 뗏목은 1-2x10 6 keratinocytes가 필요합니다. keratinocytes을 Trypsinize 및 EGF와 전자 매체로 무력화. 만들 수 보트의 수를 결정하는 세포를 세어보세요. 낮은 spe에서 세포를 다운 던가에드. 계산된 각 뗏목 문화에 대한 EGF와 전자 매체의 1 ML에 펠렛을 Resuspend.
- 틸팅 6 잘 판에 의해 콜라겐 젤에서 매체를 기음. 각 겔에 대한 EGF와 함께 신선한 전자 매체는 2 ML을 추가합니다. 각 겔 들어, 조심스럽게 잘에 이미 존재 전자 매체의 2 ML에 resuspended keratinocytes 1 ML을 추가합니다. 다음 부드럽게 pipet keratinocytes을 더한 미디어의 두 ML하고 가을 드롭이 많다는 다시 젤 향해 보자. 떨고하거나 번호판을 출렁 이는 것은 콜라겐 겔 중 한쪽으로 세포의 분포가 불규칙이 생길 수 있습니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
- 세포는 매일 전자 매체를 대체, confluency로 성장해야한다. 세포가 합류하는 경우 중간에 변경 후 노란색 언젠가 매체 변경됩니다. 이것은 보통 2~4일 소요됩니다. 매체가 하루 네에 의해 변경되지 않은 경우 다음 단계로 진행합니다.
4. 뗏목 문화 만들기
- 멸균 금속 뗏목 격자를 배치 멸균 집게를 사용하여, 양측 내려가 보자, 10cm 접시에. 콜라겐 겔에서 매체를 기음. 잘의 측면에서 젤을 느슨하게하려면, 동작을 위아래를 사용하여 멸균 주걱으로 젤의 주위에 이동하십시오. 콜라겐 젤을 제거하려면 약간 접시를 기울이고 주걱의 아래를 삽입하여 리프트. 그리드와 젤 사이에 기포를 생성하지 않고 금속 격자에 콜라겐 젤 놓는다. 두 젤류는 각 격자에 둘 수 있습니다.
- 공기 - 액체 인터페이스를 만들기 위해서는, 뗏목 격자가 미디어를 감동적 있도록 접시의 바닥에 천천히 EGF없이 전자 매체를 추가하지만, 콜라겐 젤이 아닙니다. 미디어 그리드에 구멍을 통과해서는 안됩니다. 이 균일한 분화를 차단하므로 그리드 아래에 거품을 발생하지 않도록 천천히 매체를 추가하십시오. 37 ° C에서 보트를 부화하고 공기 - 액체 인터페이스를 유지하고 매일 매체를 변경합니다. 십사일 후 보트를 수확.
5. 대표 결과
때 t그 프로토콜이 기본 keratinocytes에서 제대로 수행됩니다, 성형 수술은 피부의 다른 레이어는 증거들이 잘 차별 상피집니다. 이것은 같은 그림 1B에 나타난 hematoxylin 및 eosin (H & E)의 뗏목 문화의 부분을 더럽히는 것으로 histological 시험을 통해 달성될. H & E 염색법은 보트와 계충화하다와 차별화하는 세포의 능력에 바이러스 또는 항바이러스 화합물의 효과의 형태를 검사하는 것도 유용합니다. 예를 들어, HPV-불후의 기본 인간 keratinocytes (HFK-31)로 만든 보트가 특히 두꺼운 확산의 증가 속도와 차별화 세포 활성 유지하는 HPV 단백질의 능력을 반영, 정상적인 인간의 포피를 keratinocytes (HFK)로 만든 보트와 비교된다 세포주기의 (그림 1B) 10. 상피 전역의 핵 보유에이 결과, 정상 keratinocytes가의 붕괴가 발생, 분화에 따라 세포주기를 종료 반면,핵 봉투. 더 자세히 분화를 조사하려면, immunohistochemistry는 cytokeratins뿐만 아니라, involucrin, 그리고 filaggrin 포함하여 특정 분화 마커를 조사하기 위해 수행할 수 있습니다. 다른 cytokeratins는 분화 7의 특정 단계에서 표현됩니다. 그림 2에 표시된 바와 같이, cytokeratin 10 (K10)가 기초 레이어로 표현되지 않으며 오직 점진적으로 차별화 세포로 구성되어 suprabasal 레이어에서 발견된다. HPV 긍정적인 보트에서 K10의 표현이 다시 keratinocyte 분화에 HPV 단백질의 영향을 반영하는 정상 keratinocytes, 그에 비해 지연될 수 있습니다. Immunohistochemistry은 또한 바이러스 유전자의 표현 프로필을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3에 표시된 것은 표현 상피의 맨 위에 레이어로 제한됩니다 늦은 단백질은 HPV 단백질 E1 ^ E4의 표현을 검토 대표적인 염색법이다. 예상했던대로 아무 염색법 정상 huma에서 뗏목 문화에서 관찰되지 않습니다포피의 keratinocytes 그렇죠.
그림 1. 기본 keratinocytes이나 상피 세포 라인에서 organotypic 뗏목 문화를 준비하기위한 방법의) 개요. 안정적으로 HPV-31 (HFK-31) episomes, 또는 정상적인 인간의 포피를 keratinocytes (HFK)에서을 유지하는 인간의 포피를 keratinocytes에서 발생 organotypic 뗏목 문화 B) Hematoxylin 및 eosin 염색법. 각각의 상피 층은 물론 콜라겐 플러그로서 식별됩니다.
그림 2. Cytokeratin 10 (K10) 표현식은 상피의 suprabasal 레이어로 제한됩니다. Immunohistochemistry은 K10에 항체를 사용하여 HFK-31 세포뿐만 아니라 정상 HFKs에서 생성된 organotypic 뗏목 문화의 교차 부분에서 수행되었다. 세포의 DNA는 DAPI로 counterstained되었다. 이미지는 conf 파일을 사용 잡혔었지ocal 형광 현미경. 화살표는 상피의 기저 계층을 나타냅니다.
그림 3. HPV E1 ^ E4 단백질은 후반 바이러스 생활주기의 생산 단계에서 생산된다. Immunohistochemistry은 E1E4에 항체를 사용하여 HFK-31 세포뿐만 아니라 정상 HFKs에서 생성된 organotypic 뗏목 문화의 교차 부분에서 수행되었다. 세포의 DNA는 DAPI로 counterstained되었다. 이미지가 공촛점 형광 현미경을 사용하여 캡처했다. 화살표는 상피의 기저 계층을 나타냅니다.
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Discussion
여기서 일반적으로 상피 분화를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하지만, 또한 쉽게 바이러스성 pathogenesis뿐만 아니라 잠재적인 치료제의 효능을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다. 많은 바이러스 herpesviruses와 마찬가지로 HPV의 경우처럼, 또는 바이러스 생활주기의 어느 시점에서 감염의 주 사이트로서 중 상피 세포를 타겟팅합니다. 숙주 세포의 상호 작용 : organotypic 뗏목 문화를 성장하는 것은 많은 시간이 소요, 바이러스를 검사하는 매우 유용한 방법을 제공 충실히 생체내 상피 분화에 요점을 되풀이하는 능력이지만. 성공적으로 완전히 차별화된 상피 성장을 위해서는 인정되어야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 뗏목 문화에 차별하는 능력을 유지하기 위해, 하나는 keratinocyte 단일층을 유지하기 위해 콜라겐 겔의 fibroblast 모이통의 충분한 숫자가 있어야합니다. 뗏목 문화의 가난한 차별도 keratinocytes의 밀도가 너무 낮은로 인해 수콜라겐의 : fibroblast 젤, 부적 절한 뗏목 건설, 또는 미디어가 매일 변경하는 오류입니다. 상피 분화의 품질을 보장하기 위해 고려되어야 하나 추가 매개 변수가 사용되는 fibroblast 피더의 종류입니다. 절차는 여기에 설명된 내용은, 마우스 3T3 J2 섬유아 세포가 사용되었습니다. 다른 섬유아 세포는 피더로 사용할 수 있지만, 그것은 급속도로 나눌 섬유아 세포 그런하실 것을 권장합니다, 또는 잠재적으로 used7 아닐 피부 표면까지 마이그레이션할 수 있습니다. 이 프로토콜 14 일 후에 보트의 수확을 위해 호출했지만, 보트이 시점 이전뿐 아니라 이후 수확 할 수 있습니다. 그러나, 14 일 후에 보트는 점차적으로 얇은 될 것입니다. immunohistochemical 분석을 위해 뗏목 문화를 sectioning 외에도 보트는 RNA와 DNA뿐만 아니라 바이러스 생산을위한 수확 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
저자 E1E4 항체의 종류 선물 샐리 로버츠 (버밍엄 대학, 버밍햄 영국) 감사드립니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (4R00CA137160-03)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| E medium11 | |||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections--a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
