Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

Summary

Een

Abstract

De ontwikkeling van organotypische epitheliale raft culturen heeft onderzoekers met een efficiënt in vitro systeem dat trouw recapituleert epitheliale differentiatie. Er zijn vele toepassingen van dit systeem. Zo heeft de mogelijkheid om drie-dimensionale organotypische raft culturen van keratinocyten te groeien is een belangrijke mijlpaal in de studie van het humaan papillomavirus (HPV) ^1. De levenscyclus van HPV is nauw gekoppeld aan de differentiatie van plaveiselepitheel ^2. Organotypische epitheliale raft culturen zoals blijkt hier weer de hele papillomavirus levenscyclus, inclusief antivirusprogramma productie ^3,4,5. Bovendien zijn deze raft culturen vertonen dysplastische laesies gelijk aan die waargenomen tijdens het in-vivo-infectie met HPV. Vandaar dit systeem kan ook worden gebruikt om kanker epitheelcellen, alsmede de werking van geneesmiddelen op epitheliale celdifferentiatie in het algemeen te bestuderen. Oorspronkelijk ontwikkeld door Asselineau en Prunieras et al.. ^7, de organotypische epitheliale vlot cultuur systeem is uitgegroeid tot een algemeen, relatief eenvoudig cultuur model, dat de groei van cellen gaat op de collageen-stekkers gehandhaafd op een lucht-vloeistof interface (figuur 1a). In de loop van 10-14 dagen, de cellen stratificeren en differentiëren, die een volledige dikte epitheel dat differentiatie-specifieke cytokeratines produceert. Geoogst vlotten kan histologisch worden onderzocht, en door standaard moleculair en biochemische technieken. In dit artikel wordt beschreven een methode voor het genereren van vlot culturen van primaire humane keratinocyten. Dezelfde techniek kan worden gebruikt vastgesteld epitheliale cellijnen en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met epitheelweefsel van normale of zieke biopten ^8. Veel virussen doel ofwel de cutane of mucosale epitheel als onderdeel van hun replicatieve levenscyclus. In de afgelopen jaren is de haalbaarheid van het gebruik organotypische vlot cultgelen als methode bestuderen virus-gastheercel interacties werd tot meerdere herpesvirussen, alsmede adenovirussen, parvovirussen en poxviruses ^9. Organotypische raft culturen kan dus worden aangepast aan de virale pathogenese te onderzoeken, en zijn de enige middelen om nieuwe antivirale middelen te testen op de virussen die niet kweekbare in permanente cellijnen.

Protocol

1. Voorbereiding voor organotypische Raft Culturen

1. De metalen roosters veel vlot eerst worden behandeld met chroomzuur zwavelzuur om resten die kunnen interfereren met de differentiatie te verwijderen. Dompel metalen roosters in een bekerglas met zwavelzuur gedurende een uur, vervolgens continu 's nachts gespoeld met leidingwater. Na het 's nachts spoelen, moet vlot roosters worden gespoeld gedurende 3-5 uur in tweemaal gedestilleerd water.
2. Voor ondersteuning van de vlotten voorzien buig drie zijden van het vlot ongeveer 0,5 cm op gelijke afstand van elkaar. De metalen roosters moet dan worden geautoclaveerd.
3. Bereid de 10X reconstitutie buffer door het toevoegen van 2,2 g NaHCO3 en 4,8 g Hepes. Los in 100 ml 0,05 M NaOH. Filter sterilisatie en opslaan in 5 ml fracties bij -20 ° C.
4. Bereid de 10X DMEM zonder natriumbicarbonaat. Filter sterilisatie en opslaan in 5 ml fracties bij -20 ° C.
5. Bereid je muis epidermale groeifactor: Los 100 mg van het EFG en 10 mg van BSA elk in 10 ml gedeïoniseerd DDH ₂ 0. Combineer EGF en BSA en aan 80 ml ​​gedeioniseerd DDH ₂ 0 een totaal volume van 100 ml. Filter-steriliseren, aliquot (5 ml) en bewaar deze in de -20 ° C. Per liter E medium 5 ml 1 mg / ml EGF (eindconcentratie 5 ng / ml).

2. Bereiding van collageengels

1. Een collageen gel is vereist voor elke vlot. Het collageen worden op ijs gehouden om te voorkomen stollen. Elke collageen gel vereist 3 ml van collageen mengsel bestaande uit: 2,4 ml koud Rat-tail collageen type I (eindconcentratie 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X reconstitutie buffer, 0,3 ml 10X DMEM en1-2 x 10 ⁶ muis 3T3 fibroblasten J2 als feeder cellen. Voor hoge concentratie oplossingen rattenstaart collageen, verdund in 0,02 M azijnzuur totdat de juiste concentratie te bereiken.
2. Bepaal het aantal van collageen gels (vlotten) dan zul je nodig hebt en berekent een master mix voor de hoeveelheid collageen, 10X reconstitution buffer, 10x DMEM en J2 fibroblasten vereist. Neem genoeg elke master mix 3-4 extra gels door de viscositeit van het collageen.
3. Om het collageen gel voor te bereiden, trypsinize de J2 fibroblasten en neutraliseren met medium. Combineer alle fibroblasten en plaats in een 50 ml conische flacon. Tel de cellen om het aantal vlotten dat gemaakt kan worden bepaald. Nogmaals, zijn 1-2x10 ⁶ fibroblasten nodig per collageen gel en dus per vlot. Draai de cellen af ​​bij lage snelheid.
4. Zuig het medium van de fibroblast pellet en resuspendeer in de juiste hoeveelheid 10X reconstitutie buffer, 10X DMEM en collageen voor het aantal berekende vlotten. Voeg de collageen laatste om de gel te voorkomen dat stolling te snel. Zodra het collageen wordt toegevoegd, snel te mixen, maar voorzichtig aan de introductie van bellen te voorkomen dat in de gel. De gel moet een rood-oranje tint, een indicatie van de juiste pH. Indien het gel mengsel te geel, voeg een paar druppels filter-gesteriliseerd 1NNaOH en schud zachtjes om de juiste kleur te verkrijgen.
5. 3 ml van het collageen: fibroblast mengsel om de putjes van een 6 goed kweekschaal. Het collageen mengsel moet worden gepipetteerd langzaam langs de zijkant van elk putje om te voorkomen dat het genereren van bubbels. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator weefselkweek en laten stollen 30 minuten.
6. Na 30 minuten, 3 ml E medium EGF aan de bovenkant van de gestolde collageen gel en geven de plaat aan de incubator. De gels worden bewaard bij 37 ° C gedurende ten minste een dag maar gebruikt in vier dagen. Optimale resultaten komen na twee dagen incubatie.

3. Voorbereiden Keratinocyten voor differentiatie

1. Lage doorgang keratinocyten worden gekweekt tot ongeveer 70% confluentie. Elke raft vereist 1-2x10 ⁶ keratinocyten. Trypsinize de keratinocyten en neutraliseren met E medium met EGF. Tel de cellen om het aantal vlotten dat gemaakt kan worden bepaald. Draai de cellen bij lage speed. Resuspendeer de pellet in 1 ml van E medium met EGF voor elke berekende vlot cultuur.
2. Zuig het medium van de collageengels door kanteling van de 6 wells plaat. Voeg 2 ml verse E medium met EGF aan elke gel. Voor elke gel wordt voorzichtig 1 ml geresuspendeerde keratinocyten de 2 ml E medium reeds aanwezig in de wel. Voorzichtig pipet de keratinocyten plus de 2 ml van de media en dan laten vallen druppelsgewijs terug op de gel. Schudden of schommelen van de plaat kan in ongelijkmatige verdeling van cellen met een zijde van het collageen gel. Plaats de plaat in de 37 ° C incubator.
3. De cellen worden gekweekt tot confluentie vervanging van de E medium dag. De cellen zijn confluent bij het medium wordt geel een dag na een verandering in medium. Dit duurt meestal 2-4 dagen. Als het medium is niet veranderd door de vierde dag, ga dan naar de volgende stap.

4. Het maken van de Raft culturen

1. Gebruik steriele pincet in een steriele metalen vlot het net te plaatsen, gebogen zijkanten naar beneden, In een 10 cm schotel. Zuig het medium van collageen gel. Om de gel los van de zijkanten van de goot, rond de omtrek van de gel met een steriele spatel met een op en neer bewegen. Om het collageen gel te verwijderen, iets schuin de plaat en til door het plaatsen van een spatel eronder. Leg de collageen gel op het metalen rooster zonder het genereren van bellen tussen het rooster en de gel. Twee gels kunnen worden geplaatst op elk rooster.
2. Om een ​​lucht-vloeistof grensvlak te maken, E medium langzaam toe te voegen zonder EGF aan de bodem van de schotel, zodat het vlot rooster raakt de media, de gel collageen is. De media zou niet door de openingen in het rooster. Voeg langzaam het medium om te voorkomen dat het genereren van bellen onder het rooster, omdat dit de uniforme differentiatie te voorkomen. Incubeer de vlotten bij 37 ° C en wijzigen medium om de andere dag behoud van de lucht-vloeistof grensvlak. Oogst de vlotten na 14 dagen.

5. Representatieve resultaten

Bij het thij protocol correct wordt uitgevoerd met primaire keratinocyten, zal deze procedure resulteert in een goed gedifferentieerde epithelium waarbij de verschillende lagen van de huid zijn evident. Dit wordt bereikt door histologisch onderzoek door kleuring delen van vlot culturen hematoxyline en eosine (H & E), zoals weergegeven in figuur 1B. H & E kleuring is nuttig de morfologie van vlotten en het effect van virussen of antivirale verbindingen op het vermogen van cellen om stratificeren en differentiëren. Bijvoorbeeld, vlotten uit HPV-geïmmortaliseerde primaire keratinocyten (HFS-31) name dikker dan vlotten uit normale humane voorhuid keratinocyten (HFS), hetgeen een verhoogde snelheid van proliferatie en de mogelijkheid van HPV eiwitten te handhaven differentiërende cellen actieve in de celcyclus (figuur 1B) ^10. Dit resulteert in behoud van kernen in het epitheel, dat normale keratinocyten de celcyclus verlaten na differentiatie, waardoor een afbraak van denucleaire envelop. Uitvoerig onderzoek differentiatie kan immunohistochemie worden uitgevoerd om differentiatie merkers, zoals cytokeratinen alsmede involucrine en filaggrine onderzoeken. Verschillende cytokeratines worden uitgedrukt in specifieke fasen van differentiatie ^7. Zoals getoond in figuur 2 is cytokeratine 10 (K10) die niet in de basale laag, en alleen in de suprabasale lagen bestaan ​​uit cellen progressief differentiëren. In HPV positieve vlotten is de expressie van K10 vertraagd ten opzichte van de normale keratinocyten weer als gevolg van de invloed van HPV eiwitten op keratinocytdifferentiatie. Immunohistochemie kan ook gebruikt worden om de expressie van virale genen profiel onderzoeken. In figuur 3 is een representatief kleuring onderzoek van de expressie van het eiwit HPV E1 ^ E4, een late eiwit waarvan de expressie beperkt tot de bovenste lagen van het epitheel. Zoals verwacht, is er geen vlekken waargenomen in raft culturen van de normale Human voorhuid keratinocyten.

Figuur 1. A) Overzicht van de werkwijze voor de bereiding organotypische raft culturen van primaire keratinocyten of epitheliale cellijnen. B) Hematoxyline en eosine kleuring van organotypische raft culturen gegenereerd op basis van menselijke voorhuid keratinocyten stabiel handhaven van HPV-31 (HFK-31) episomen, of van normale menselijke voorhuid keratinocyten (HFK). De individuele epitheellagen worden geïdentificeerd, en de plug collageen.

Figuur 2. Cytokeratine 10 (K10) expressie beperkt tot de suprabasale lagen van het epitheel. Immunohistochemie werd uitgevoerd op een doorsnede van organotypische vlot culturen gegenereerd HFS-31 cellen, en normale HFKs met een antilichaam K10. Cellulaire DNA werd tegengekleurd met DAPI. Beelden werden vastgelegd met behulp van confokale fluorescentie microscopie. Pijlen geven de basale laag het epitheel.

Figuur 3. De HPV E1 ^ E4-eiwit wordt geproduceerd laat in de productieve fase van de virale levenscyclus. Immunohistochemie werd uitgevoerd op een doorsnede van organotypische vlot culturen gegenereerd HFS-31 cellen, en normale HFKs met antilichamen tegen E1E4. Cellulaire DNA werd tegengekleurd met DAPI. Beelden werden vastgelegd met behulp van confocale fluorescentie microscopie. Pijlen geven de basale laag het epitheel.

Discussion

Hier beschreven een methode die kan worden gebruikt om epitheliale differentiatie in het algemeen te bestuderen, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan virale pathogenese, en de effectiviteit van potentiële therapeutische bestuderen. Veel virussen gericht epitheelcellen of als voornaamste van infectie zoals in het geval van HPV of ergens in de virale levenscyclus, zoals bij herpesvirussen. Hoewel groeiende organotypische raft culturen is tijdrovend, de mogelijkheid om trouw herhalen in-vivo-epitheliale differentiatie biedt een zeer nuttige methode om virus te onderzoeken: gastheer cel interacties. Om succesvol te groeien van een volledig gedifferentieerd epitheel zijn er een aantal kritische stappen die moeten worden erkend. Om het vermogen om te differentiëren vlot culturen behouden moet men een voldoende fibroblast feeders in de collageengel de keratinocyt monolaag handhaven. Slechte differentiatie vlot culturen kan ook door een te lage densiteit van keratinocytenop het collageen: fibroblast gel, onjuiste vlot de bouw, of het niet te veranderen in de media elke dag. Een extra parameter die moeten worden beschouwd als de kwaliteit van epitheliale differentiatie waarborgen is de gebruikte fibroblast feeder. Voor de hier beschreven procedure werd muis 3T3 fibroblasten J2 gebruikt. Terwijl andere fibroblasten worden gebruikt als voeders, verdient het aanbeveling fibroblasten die snel verdelen of zou kunnen migreren van de dermale oppervlak niet used7. Hoewel dit protocol vereist voor het oogsten van de vlotten na 14 dagen, kan vlotten worden voordat dit tijdstip, en na. Echter, na 14 dagen de vlotten zullen geleidelijk dunner. Naast segmenteermiddelen vlot culturen immunohistochemische analyse kan vlotten worden geoogst RNA en DNA, alsmede virusproductie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010