Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av Organotypic Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

Published: February 22, 2012 doi: 10.3791/3668

Summary

En

Abstract

Utviklingen av organotypic epiteliale flåte kulturer har gitt forskere med en effektiv in vitro system som trofast sammenfatter epitelial differensiering. Det er mange bruksområder for dette systemet. For eksempel har evnen til å vokse tredimensjonale organotypic flåte kulturer av keratinocytter vært en viktig milepæl i studiet av humant papillomavirus (HPV) 1. Livssyklusen til HPV er tett knyttet til differensiering av plateepiteldysplasi to. Organotypic epiteliale flåte kulturer som demonstreres her gjengi hele papillomavirus livssyklus, inkludert virus produksjon 3,4,5. I tillegg er disse flåte kulturene stille dysplastiske lesjoner som ligner de som ble observert på in vivo infeksjon med HPV. Derfor dette systemet kan også brukes til å studere epithelial celle kreft, samt effekten av narkotika på epithelial celledifferensiering generelt. Opprinnelig utviklet av Asselineau og Prunieras et al. 7, har organotypic epiteliale flåten kultur system modnet til en generell, relativt enkel kultur modell, som innebærer vekst av celler på kollagen plugges opprettholdes på en luft-væske-grensesnittet (Figur 1a). I løpet av 10-14 dager, cellene stratify og differensiere, danner en full tykkelse epitel som produserer differensiering-spesifikke cytokeratins. Høstes flåter kan bli undersøkt histologisk, samt av standard biokjemiske og molekylærbiologiske teknikker. I denne artikkelen beskriver vi en metode for generering av flåte kulturer fra primære humane keratinocytter. Den samme teknikken kan brukes med etablerte epiteliale cellelinjer, og kan lett tilpasses for bruk med epitelvev fra normale eller syke biopsier 8. Mange virus målet enten kutan eller mucosal epitel som en del av deres replicative livssyklus. I løpet av de siste årene, muligheten for å bruke organotypic flåte kulttiltak som en metode for å studere virus-vert celle interaksjoner har blitt vist i flere herpesviruses, samt adenoviruses og parvoviruses og poxviruses 9. Organotypic flåte kulturer kan slik tilpasses undersøke viral patogenese, og er den eneste måten å teste nye antivirale midler for de virus som ikke er dyrkbar i permanente cellelinjer.

Protocol

1. Forberedelse til Organotypic Raft kulturer

  1. Metallet flåte rister mye første behandles med kromsyre svovelsyre for å fjerne eventuelle rester som kan forstyrre differensiering prosessen. Fordype metall tavler i et glass begerglass som inneholder svovelsyre i en time, deretter kontinuerlig skylles over natten med vann fra springen. Etter natten skylling, bør flåte grid skylles i 3-5 timer i dobbelt destillert vann.
  2. Å gi støtte til flåter, bøye tre sider av flåten ca 0,5 cm på lik avstand fra hverandre. Metallet nett bør deretter autoklaveres.
  3. Klargjør 10X rekonstituering buffer ved å legge til 2.2 g NaHCO3 og 4,8 g Hepes. Løs i 100 ml 0,05 M NaOH. Filtrer sterilisere og lagre i 5 ml alikvoter ved -20 ° C.
  4. Klargjør 10X DMEM uten natrium bikarbonat. Filtrer sterilisere og lagre i 5 ml alikvoter ved -20 ° C.
  5. Forbered mus epidermal vekstfaktor: Løs 100 mg av EGF og 10 mg av BSA hver i 10 ml avionisert DDH 2 0. Kombiner EGF og BSA og legg til 80 ml ​​avionisert DDH 2 0 for et samlet volum på 100 ml. Filter-sterilisere, alikvoter (5 ml) og lagrer i -20 ° C. For hver liter av E medium tilsett 5 ml 1 mg / ml EGF (endelig konsentrasjon 5 ng / ml).

2. Utarbeidelse av kollagen Gels

  1. En kollagen gel kreves for hver flåte. Kollagen bør holdes på is for å hindre den fra solidifying. Hver kollagen gel krever 3 ml kollagen blanding bestående av: 2,4 ml kald Rat-tail kollagen type I (endelig konsentrasjon 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X rekonstituering buffer, 0,3 ml 10X DMEM And1-2 X 10 6 mus 3T3 J2 fibroblaster som mater celler. For høy konsentrasjon løsninger av rotte halen kollagen, fortynnes i 0,02 M eddiksyre for å oppnå riktig arbeidshøyde konsentrasjon.
  2. Bestem antall kollagen gels (flåter) du trenger og deretter beregne en master mix for mengden av kollagen, 10X reconstitution buffer, 10X DMEM og J2 fibroblaster nødvendig. Inkluder nok i hvert Master Mix for 3-4 ekstra gels grunn av viskositeten av kollagen.
  3. For å forberede kollagen gel, trypsinize de J2 fibroblaster og nøytraliser med medium. Kombiner alle fibroblaster og plasser i en 50 ml konisk hetteglass. Tell cellene for å bestemme antall flåter som kan gjøres. Igjen, er 1-2x10 6 fibroblaster kreves per kollagen gel og dermed per flåte. Spinn ned celler på lav hastighet.
  4. Aspirer mediet fra fibroblast pellet og resuspender i riktig mengde 10X rekonstituering buffer, 10X DMEM og kollagen for antall flåter beregnet. Legg til kollagen siste for å hindre at gel fra solidifying altfor fort. Når kollagen er lagt til, bland raskt, men forsiktig for å hindre introduksjon av bobler i gel. Gelen være en rødlig oransje farge, som indikerer riktig pH. Hvis gelen blandingen er for gul, legg et par dråper filter-steriliseres 1NNaOH og bland forsiktig for å få riktig farge.
  5. Legg 3 ml av kollagen: fibroblast blanding til brønnene til en 6 vel kultur parabolen. Kollagen Blandingen skal pipetteres langsomt nedover siden av hver brønn for å unngå å generere bobler. Sett platen i en 37 ° C vev kulturinkubatoren og la stivne i 30 minutter.
  6. Etter 30 minutter, tilsett 3 ml E medium med EGF til toppen av størknet kollagen gel og returnere platen til inkubatoren. De gels bør holdes på 37 ° C i minst en dag, men brukes innen fire dager. Optimale resultater oppstå etter to dagers inkubasjon.

3. Forberede keratinocytter for differensiering

  1. Lave passasje keratinocytter bør vokst til ca 70% confluency. Hver flåte krever 1-2x10 6 keratinocytter. Trypsinize de keratinocytter og nøytralisere med E medium med EGF. Tell cellene for å bestemme antall flåter som kan gjøres. Spinn ned cellene ved lav SPEed. Resuspender pelleten i 1 ml av E medium med EGF for hver flåte kultur beregnes.
  2. Aspirer mediet fra kollagen gel ved å vippe den 6 brønnen plate. Tilsett 2 ml av frisk E medium med EGF til hver gel. For hver gel, tilsett forsiktig 1 ml resuspendert keratinocytter til 2 ml E medium allerede finnes i brønnen. Forsiktig pipettér keratinocytter pluss 2 ml av media, og deretter la falle dråpe-messig tilbake på gel. Risting eller rocking platen kan føre til ujevn fordeling av celler til én side av kollagen gel. Sett platen i 37 ° C inkubator.
  3. Cellene må dyrkes for å confluency, erstatte E medium daglig. Cellene er konfluent Da mediet endres til gult en dag etter en endring i medium. Dette tar vanligvis 2-4 dager. Dersom mediet ikke har endret seg etter dag fire, gå videre til neste trinn.

4. Å gjøre flåten kulturer

  1. Bruk steril tang til å plassere en steril metall flåte rutenett, bøyde sider ned, Inn i en 10 cm form. Aspirer mediet fra kollagen gel. For å løsne geleen fra sidene av brønnen, gå rundt omkretsen av gel med en steril spatel med en opp og ned bevegelse. For å fjerne kollagen gel, vippe platen litt og løft ved å plassere en slikkepott under. Legg kollagen gel på metal nettet uten å generere bobler mellom rutenettet og gel. To geler kan plasseres på hver rute.
  2. For å gjøre en luft-væske-grensesnittet, legg E medium uten EGF sakte til bunnen av fatet så flåten rutenettet berører media, men kollagen gel er ikke. Mediene bør ikke komme gjennom hullene i nettet. Legg til medium sakte for å unngå å generere bobler under rutenettet, da dette vil hindre uniform differensiering. Inkuber flåter ved 37 ° C og endre medium annenhver dag opprettholde luft-væske-grensesnittet. Høste flåtene etter 14 dager.

5. Representative Resultater

Når than protokollen er utført riktig med primære keratinocytter, vil denne prosedyren gi et godt differensiert epitel hvor de forskjellige lagene av huden er åpenbare. Dette oppnås gjennom histologisk undersøkelse ved farging deler av flåte kulturer for hematoxylin og eosin (H & E), som vist i Figur 1b. H & E farging er også nyttig å undersøke morfologi flåter og effekten av virus eller antivirale forbindelser på evnen til cellene å stratifisere og differensiere. For eksempel er flåter laget av HPV-udødeliggjorde primære humane keratinocytter (HFK-31) særlig tykkere enn flåter laget av normale menneskelige foreskin keratinocytter (HFK), som reflekterer en økt forekomst av spredning og evnen til HPV proteiner for å opprettholde differensierende celler aktiv i cellen syklus (Figur 1B) 10. Dette resulterer i oppbevaring av kjerner i hele epitelet, mens normale keratinocytter gå ut av cellen syklus på differensiering, noe som resulterer i en nedbrytning avkjernefysisk konvolutt. For mer nøye undersøke differensiering, kan immunhistokjemi utføres for å undersøke spesifikke derivasjon markører, inkludert cytokeratins, samt involucrin og filaggrin. Ulike cytokeratins uttrykkes på bestemte stadier av differensiering 7. Som vist i figur 2, er cytokeratin 10 (K10) ikke uttrykt i basal laget, og er bare funnet i de suprabasal lag som består av celler gradvis differensierende. I HPV positive flåter, er uttrykk for K10 forsinket sammenlignet med normale keratinocytter, igjen reflekterer påvirkning av HPV proteiner på keratinocyte differensiering. Immunhistokjemi kan også brukes til å undersøke uttrykket profilen viral gener. Vist i figur 3 er en representant farging undersøke uttrykk for HPV protein E1 ^ E4, som er en sen protein som uttrykk er begrenset til de øverste lag av epitelet. Som forventet er ingen farging observeres i raft kulturer fra normal Human foreskin keratinocytter.

Figur 1
Figur 1. A) Omriss av metode for å forberede organotypic flåte kulturer fra primære keratinocytter eller epiteliale cellelinjer. B) Hematoxylin og eosin farging av organotypic flåte kulturer generert fra humane foreskin keratinocytter stabilt opprettholde HPV-31 (HFK-31) episomes, eller fra normale menneskelige foreskin keratinocytter (HFK). De enkelte epiteliale lag er identifisert, samt kollagen pluggen.

Figur 2
Figur 2. Cytokeratin 10 (K10) uttrykk er begrenset til de suprabasal lag av epitelet. Immunhistokjemi ble utført på tverrsnitt av organotypic flåte kulturer generert fra HFK-31 celler, samt normale HFKs bruke et antistoff til K10. Cellular DNA ble kontrafarget med DAPI. Bilder ble tatt med confocal fluorescens mikroskopi. Piler indikerer basal laget av epitel.

Figur 3
Figur 3. HPV E1 ^ E4 protein er produsert sent i den produktive fasen av viral livssyklus. Immunhistokjemi ble utført på tverrsnitt av organotypic flåte kulturer generert fra HFK-31 celler, samt vanlige HFKs bruker antistoffer mot E1E4. Cellular DNA ble kontrafarget med DAPI. Bilder ble tatt med confocal fluorescens mikroskopi. Piler indikerer basal laget av epitel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en metode som kan brukes til å studere epitelial differensiering generelt, men kan også lett tilpasses for å studere viral patogenese, samt effekten av potensielle legemiddelselskap. Mange virus målrette epitelceller enten som det primære stedet for infeksjon, som i tilfelle av HPV, eller på et tidspunkt i viral livssyklus, som med herpesviruses. Selv om voksende organotypic flåte kulturer er tidkrevende, muligheten til å trofast rekapitulere in vivo epitelial differensiering gir en svært nyttig metode for å undersøke viruset: vertscellen interaksjoner. For å lykkes vokse en fullt differensiert epitel er det noen viktige skritt som må anerkjennes. For å beholde evnen til å differensiere i raft kulturer, må man ha et tilstrekkelig antall fibroblast matere i kollagen gel for å opprettholde keratinocyte monolayer. Dårlig differensiering i raft kulturer kan også skyldes for lav tetthet av keratinocytterpå kollagen: fibroblast gel, feil flåte konstruksjon, eller unnlatelse av å endre media hver dag. En ekstra parameter som må vurderes for å sikre kvaliteten på epithelial differensiering er den type fibroblast mater brukt. For prosedyren beskrevet her, ble mus 3T3 J2 fibroblaster brukt. Mens andre fibroblaster kan brukes som feeders, anbefales det at fibroblaster som deler seg raskt, eller potensielt kan migrere opp til dermal overflaten ikke være used7. Selv om denne protokollen krever høsting av flåtene etter 14 dager, kan flåter høstes før dette tidspunkt, samt etter. Men etter 14 dager flåtene vil gradvis bli tynnere. I tillegg til seksjonering flåte kulturer for immunhistokjemisk analyse, kan flåter også høstes for RNA og DNA, samt virus produksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham Storbritannia) for den type gave E1E4 antistoff. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute (4R00CA137160-03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) BD Biosciences 354236
DMEM without NaHC03 Invitrogen 12100-061
NaHC03 Sigma-Aldrich S5761
Hepes Calbiochem 391338
Stainless Steel metal grids Williams and Mettle Co. CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor BD Biosciences 354010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
  2. Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).
  3. Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).
  4. Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
  5. Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
  6. Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
  7. Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
  8. Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
  9. Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
  10. Wilson, R., Laimins, L. A. Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).
  11. zur Hausen, H. Papillomavirus infections--a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).

Tags

Immunologi epitel organotypic flåte kultur virus keratinocytter papillomavirus
Generering av Organotypic Raft Cultures fra primære humane keratinocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anacker, D., Moody, C. Generation of More

Anacker, D., Moody, C. Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668, doi:10.3791/3668 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter