Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

Summary

Um

Abstract

O desenvolvimento de culturas organotípicas de jangada epiteliais forneceu investigadores com um eficiente sistema in vitro que fielmente diferenciação recapitula epitelial. Há muitos usos para esse sistema. Por exemplo, a capacidade de crescer tridimensionais culturas organotípicas de jangada de queratinócitos foi um passo importante no estudo do papilomavírus humano (HPV) ^1. O ciclo de vida de HPV é rigidamente ligada à diferenciação de epitélio escamoso ^2. Organotípicas culturas jangada epiteliais como demonstrado aqui reproduzir o ciclo de vida papilomavírus, incluindo a produção de vírus ^3,4,5. Além disso, estas culturas jangada exibem lesões displásicas semelhantes aos observados após infecção in vivo com HPV. Assim, o presente sistema pode também ser usado para estudar cancros de células epiteliais, bem como o efeito de drogas na diferenciação de células epiteliais em geral. Originalmente desenvolvido pela Asselineau e Prunieras et al. ^7, o sistema de cultura organotípico epitelial jangada amadureceu em geral um modelo de cultura, relativamente fácil, o qual envolve o crescimento de células em colagénio liga mantida a uma interface ar-líquido (Figura 1A). Ao longo de 10-14 dias, as células estratificar e diferenciar, formando um epitélio espessura total que produz-diferenciação específicos citoqueratinas. Jangadas colhidas pode ser examinado histologicamente, bem como por técnicas padrão de moleculares e bioquímicos. Neste artigo, é descrito um método para a geração de culturas primárias de jangada de queratinócitos humanos. A mesma técnica pode ser usada com estabelecidas linhas de células epiteliais, e pode facilmente ser adaptado para uso com o tecido epitelial a partir de biópsias normais ou doentes ^8. Muitos vírus alvo tanto o epitélio cutâneo ou da mucosa, como parte de seu ciclo de vida replicativo. Ao longo dos últimos anos, a viabilidade do uso culto jangada organotípicoUres como um método de estudo das interacções vírus-hospedeiro de células tem sido demonstrado para herpesvírus vários, bem como adenovírus, parvovírus, e poxvírus ^9. Culturas organotípicas de jangada pode assim ser adaptado para examinar patogénese virai, e são os únicos meios para testar novos agentes antivirais para aqueles vírus que não são cultiváveis ​​em linhas de células permanentes.

Protocol

1. Preparação para culturas Jangada organotípicas

1. As grelhas de jangada de metal muito primeiro ser tratados com ácido sulfúrico crómico para remover qualquer resíduo que poderia interferir com o processo de diferenciação. Grelhas de metal imergir em um copo de vidro contendo ácido sulfúrico durante uma hora, em seguida, lavado continuamente durante a noite com água da torneira. Após o enxaguamento durante a noite, as grades de jangada deve ser lavado durante 3-5 horas em água destilada duas vezes.
2. Para fornecer suporte para as jangadas, dobre três lados da jangada cerca de 0,5 cm a igual distância uns dos outros. As grelhas de metal deve então ser autoclavados.
3. Preparar o tampão de reconstituição 10X por adição de 2,2 g de NAHCO3 e 4,8 g de Hepes. Dissolver em 100 ml de 0,05 M de NaOH. Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 5 ml a -20 ° C.
4. Preparar o DMEM 10X sem bicarbonato de sódio. Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 5 ml a -20 ° C.
5. Preparar factor de crescimento epidérmico do rato: Dissolver 100 mg de EGF e 10 mg de BSA cada um em 10 mL de água desionizada DDQ ₂ 0. Combinar EGF e BSA e adicionar a 80 ml ​​de desionizada DDQ ₂ 0 para um volume total de 100 ml. Filtre-esterilizar alíquota, (5 ml) e guarde na -20 ° C. Para cada litro de meio E adicionar 5 ml de 1 mg / ml EGF (concentração final de 5 ng / ml).

2. Preparação de géis de colágeno

1. Um gel de colágeno é necessário para cada balsa. O colagénio deve ser mantido em gelo para evitar que ele solidificação. Cada gel de colagénio requer 3 ml de mistura de colagénio que consiste em: 2,4 ml de colagénio do tipo frio Rat cauda-de-I (concentração final de 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampão de reconstituição 10X, 0,3 ml de DMEM 10X e1-2 do rato X 10 ⁶ 3T3 J2 fibroblastos como células alimentadoras. Para soluções de concentração elevada de colagénio da cauda de rato, diluir em 0,02 M de ácido acético para se atingir a concentração correcta de trabalho.
2. Determinar o número de géis de colágeno (balsas), você vai precisar e, em seguida, calcular um master mix para a quantidade de colágeno, reconstit 10Xtampão ution, DMEM 10X e J2 fibroblastos necessário. Incluem o suficiente em cada mistura de mestre para 3-4 géis extra devido à viscosidade do colagénio.
3. Para preparar o gel de colágeno, trypsinize os J2 fibroblastos e neutralizar com o meio. Misture todos os fibroblastos e coloque em um frasco de 50 ml cônico. Contar as células para determinar o número de jangadas que podem ser feitas. Mais uma vez, 1-2x10 ⁶ fibroblastos são obrigados por gel de colágeno e, assim, por balsa. Gire para baixo as células em baixa velocidade.
4. Aspirar o meio a partir do fibroblasto sedimento e ressuspender na quantidade apropriada de tampão de reconstituição 10X, 10X e DMEM colagénio para o número de jangadas calculados. Adicionar o colagénio última para evitar que o gel de solidificação muito rapidamente. Uma vez que o colagénio é adicionado, misturar rapidamente, mas com cuidado para evitar a introdução de bolhas no gel. O gel deve ser de uma cor laranja avermelhada, indicativo de que o pH correcto. Se a mistura de gel é muito amarelo, adicionar um par de gotas de filtro esterilizado 1NNaOH e misturar suavemente para se obter a cor correcta.
5. Adicionar 3 ml de colagénio: mistura de fibroblastos para os poços de uma placa de cultura de 6 poços. A mistura de colágeno deve ser pipetado lentamente para o lado de cada poço para evitar a geração de bolhas. Colocar a placa em um 37 ° C incubador de cultura de tecidos e deixa-se solidificar durante 30 minutos.
6. Após 30 minutos, adicionar 3 ml de meio de E com EGF para o topo do gel de colagénio solidificado e retornar a placa para a incubadora. Os géis deve ser mantida a 37 ° C durante pelo menos um dia, mas utilizadas dentro de quatro dias. Resultados óptimos ocorrer após dois dias de incubação.

3. Os queratinócitos Preparando para Diferenciação

1. Queratinócitos baixa passagem deve ser aumentado para cerca de 70% de confluência. Cada balsa exige 1-2x10 ⁶ queratinócitos. Trypsinize os queratinócitos e neutralizar com meio E com EGF. Contar as células para determinar o número de jangadas que podem ser feitas. Gire para baixo as células a SPE baixoed. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de E com EGF para cada cultura jangada calculado.
2. Aspirar o meio a partir dos géis de colagénio por da inclinação da placa de 6 poços. Adicionar 2 ml de meio fresco E com EGF para cada gel. Para cada gel, cuidadosamente adicionar 1 ml de queratinócitos ressuspensos para a 2 ml de meio E já presente no poço. Gentilmente pipeta os queratinócitos mais a 2 ml de mídia e, em seguida, deixar para trás queda gota a gota, para o gel. Agitação ou agitando a placa pode resultar na distribuição desigual de células para um lado do gel de colagénio. Colocar a placa na incubadora a 37 ° C.
3. As células devem ser cultivadas até à confluência, substituindo o meio E por dia. As células são confluentes quando as alterações médias para um dia amarelo após uma mudança de meio. Isso normalmente leva 2-4 dias. Se o meio não mudou por quatro dias, proceda para a próxima etapa.

4. Fazendo as culturas Jangada

1. Use uma pinça estéril, colocar uma grade jangada estéril metal, dobrados para baixo os lados, Em um prato de 10 cm. Aspirar o meio a partir de gel de colagénio. Para soltar o gel a partir dos lados do poço, a volta do perímetro do gel com uma espátula estéril usando um movimento para cima e para baixo. Para remover o gel de colagénio, incline a placa e levante colocando um debaixo espátula. Colocar o gel de colagénio na grelha de metal sem a geração de bolhas entre a grade eo gel. Dois géis podem ser colocadas em cada grade.
2. A fim de fazer uma interface ar-líquido, adicionar meio E sem EGF lentamente para o fundo do prato de modo a grade jangada está a tocar os meios de comunicação, mas o gel de colagénio não é. A mídia não deve vir através dos buracos na grade. Adicionar lentamente o meio para evitar a geração de bolhas sob a grade, como isso vai impedir a diferenciação uniforme. Incubar as jangadas a 37 ° C e alterar o meio de todos os outros dias mantendo a interface ar-líquido. Colha as balsas depois de 14 dias.

5. Os resultados representativos

Quando tele protocolo é efectuada correctamente com queratinócitos primários, este procedimento irá resultar em um epitélio bem diferenciado onde as diferentes camadas da pele são evidentes. Este ser alcançada através de exame histológico pela coloração seções de culturas de jangada para hematoxilina e eosina (H & E), como mostrado na Figura 1B. HE também é útil para examinar a morfologia de jangadas eo efeito de vírus ou de compostos antivirais sobre a capacidade das células para a estratificação e diferenciar. Por exemplo, jangadas feitas a partir de HPV-imortalizadas primárias de queratinócitos humanos (HFK-31) são notavelmente mais espessa em comparação com jangadas feitas a partir de queratinócitos normais de prepúcio humano (HFK), reflectindo um aumento da taxa de proliferação ea capacidade das proteínas de HPV para manter as células de diferenciação activa no ciclo celular (Figura 1B) ^10. Isto resulta em retenção dos núcleos ao longo do epitélio, enquanto que os queratinócitos normais sair do ciclo celular na diferenciação, resultando em um colapso doenvelope nuclear. Para examinar mais de perto a diferenciação, imuno-histoquímica pode ser realizada para examinar marcadores de diferenciação específicos, incluindo citoqueratinas, bem como involucrina, e filagrina. Citoqueratinas diferentes são expressos em fases específicas de diferenciação ^7. Como mostrado na Figura 2, citoqueratina 10 (K10) não é expresso na camada basal, e é encontrado apenas nas camadas suprabasais que consistem em células progressivamente de diferenciação. Em jangadas de HPV positivos, a expressão de K10 é atrasado em comparação com a de queratinócitos normais, novamente reflectindo a influência de proteínas de HPV na diferenciação de queratinócitos. A imuno-histoquímica também pode ser usado para examinar o perfil de expressão de genes virais. Mostrada na Figura 3 é uma coloração representante examinar a expressão da proteína de HPV E1 ^ E4, que é uma proteína tardia cuja expressão é restrita às camadas superiores do epitélio. Como esperado, sem coloração é observada em culturas de jangada de Huma normaisn queratinócitos prepúcio.

Figura 1. Um esboço) de método para a preparação de culturas organotípicas de jangada de queratinócitos primários ou linhas celulares epiteliais. B) coloração de hematoxilina e eosina de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de queratinócitos do prepúcio humano de forma estável mantendo HPV-31 (HFK-31) episomes, ou a partir normais queratinócitos do prepúcio humano (HFK). As camadas individuais epiteliais são identificados, bem como a ficha de colagénio.

Figura 2. Citoqueratina 10 expressão (K10) é limitada às camadas suprabasais do epitélio. A imuno-histoquímica foi realizada em secções transversais de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de HFK-31 células, bem como HFKs normais utilizando um anticorpo para K10. DNA celular foi contrastadas com DAPI. As imagens foram capturadas confmicroscopia de fluorescência Ocal. As setas indicam a camada basal do epitélio.

Figura 3. A E1 HPV ^ proteína E4 é produzido no final da fase produtiva do ciclo de vida virai. A imuno-histoquímica foi realizada em secções transversais de culturas organotípicas de jangada gerados a partir de HFK-31 células, bem como HFKs normais utilizando anticorpos para E1E4. DNA celular foi contrastadas com DAPI. As imagens foram capturadas usando microscopia de fluorescência confocal. As setas indicam a camada basal do epitélio.

Discussion

Descrevemos aqui um método que pode ser usado para estudar a diferenciação epitelial em geral, mas também pode ser facilmente adaptado para estudar patogénese virai, bem como a eficácia da terapêutica potencial. Muitos vírus alvo células epiteliais, quer como o principal local de infecção, como no caso de HPV, ou em algum ponto do ciclo de vida do vírus, tal como com herpesvírus. Embora crescente culturas jangada organotípicas é demorado, a habilidade de recapitular fielmente na diferenciação epitelial vivo fornece um método extremamente útil para analisar vírus: interações da célula hospedeira. Para crescer com sucesso um epitélio totalmente diferenciada há alguns passos críticos que devem ser reconhecidos. A fim de reter a capacidade de diferenciar em culturas de jangada, deve-se ter um número suficiente de alimentadores de fibroblastos no gel de colagénio para manter a monocamada de queratinócitos. Diferenciação pobre em culturas de jangada pode também ser devido a uma densidade muito baixa de queratinócitossobre o colágeno: gel de fibroblastos, construção jangada imprópria, ou a incapacidade de mudar os meios de comunicação todos os dias. Um parâmetro adicional que deve ser considerado para assegurar a qualidade da diferenciação epitelial é o tipo de alimentador de fibroblastos utilizado. Para o procedimento aqui descrito, de rato 3T3 J2 fibroblastos foram utilizados. Enquanto fibroblastos outros podem ser utilizados como alimentadores, recomenda-se que os fibroblastos que se dividem rapidamente, ou poderia potencialmente migrar para a superfície cutânea não ser used7. Embora este protocolo chama para a colheita das jangadas após 14 dias, jangadas podem ser colhidas antes deste ponto de tempo, bem como depois. No entanto, após 14 dias as jangadas se tornará progressivamente mais finos. Em adição à secção culturas jangada para análise imuno-histoquímica, jangadas também pode ser colhido para RNA e DNA, assim como a produção de vírus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010