Summary
يوصف تقنية لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران. وperfused الأكباد وهضمها
Abstract
يتم تعريف تليف الكبد عن طريق الترسيب المفرط للالمصفوفة خارج الخلية بواسطة myofibroblasts المنشط. هناك السلائف متعددة من myofibroblasts كبدي، بما في ذلك الخلايا النجمية كبدي، بوابة الليفية ونخاع العظام الخلايا الليفية المشتقة 1. وكانت الخلايا النجمية كبدي أفضل درس، ولكن يتم التعرف على نحو متزايد الليفية بوابة كمساهمين المهم أن تجمع myofibroblast، ولا سيما في التليف الصفراوي 2. الليفية بوابة الخضوع الانتشار استجابة لإصابات الظهارية الصفراوية، ولعب دورا رئيسيا يحتمل أن تكون في المراحل المبكرة من الصفراوية تندب 3-5. وهناك طريقة لعزل الخلايا الليفية بوابة تسمح للدراسة في المختبر من سكان هذه الخلايا وتؤدي إلى مزيد من الفهم لدور الخلايا الليفية بوابة لعب في التليف الصفراوي.
وتم عزل الخلايا الليفية بوابة باستخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك ثمرة 6 و 7 و لىالنسخة نضح مع الهضم الأنزيمي تليها اختيار حجم 8. وتستفيد من عملية الهضم وتقنية اختيار حجم مقارنة مع تقنية ثمرة هي التي يمكن دراستها الخلايا دون الحاجة للمرور في الثقافة. هنا، نحن تصف نسخة معدلة من هذه التقنية الأصلية التي وصفها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران أن النتائج في عدد السكان نقي نسبيا من الخلايا الأولية.
Protocol
ويتم إجراء كامل في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد حلول الإنزيم
- إعداد حلول انزيم وفق الجدول (1) ومرشح العقيمة باستخدام ميكرومتر 0.22 فلتر. إبقاء حل 1 و 2 في حل درجة حرارة الغرفة وحل 3 في 4 درجات مئوية حتى وقت الاستخدام. يجب على كل الحلول والمعدات ملامسة خلايا معزولة تكون عقيمة.
2. إعداد التجهيزات الإرواء
- رئيس النظام نضح مع HBSS ناقص الكالسيوم 2 + ملغم / 2 +، والتي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: للتأكد من أن سائل الإرواء هي 37 درجة مئوية عندما تصل إلى الكبد، وتحسنت HBSS في حمام ماء تعيين إلى 37 درجة مئوية. بعد أن يمر من خلال مضخة نضح، وغني عن طريق مكثف تغلف الزجاج الذي يتم وصله بجهاز المياه مجموعة دائري إلى 40 درجة مئوية (الشكل 1).
- تعقيم جراحي للعملية شريان الحياة في كوب مع الايثانول 70٪.
3. نضح من الكبد
- تخدير شخص بالغ من الذكور، سبراغ داولي عن طريق الحقن داخل الصفاق من Nembutal (50-100 وزن الجسم مغ / كغ حسب الضرورة للحصول على التخدير الكافي).
- وضع الحيوان في موقف ضعيف على صينية من البلاستيك وتحديد أطرافه إلى علبة مع الشريط.
- تنظيف البطن مع EtOH 70٪.
- جعل شق صغير في الجلد على البطن في خط الوسط. تشريح الجلد بعيدا عن لفافة من خلال جعل كبير على شكل حرف U قطع على البطن. قطع عضلات البطن مع مقص بعد نفس الشكل لكشف التجويف البريتوني.
- فضح الوريد البابي باستخدام قطعة قطن 2 للانتقال بلطف أحشاء البطن إلى الجانب الأيمن.
- تعدى اثنين من الحرير والخيوط الجراحية المعقمة تحت 2.0 في الوريد البابي وربط فضفاضة.
- يقني؛ يدخل القنية في الوريد البابي مع قسطرة مقياس الرابع 16-18 و تأمين القسطرة في مكانها من خلال تشديد TI فضفاضةالغرز إد من الخطوة السابقة (الشكل 2).
- حقن الهيبارين المخفف عن طريق القسطرة رابعا (1 مل من وحدة هيبارين USP 5000 / مل مخففة مع 4 مل من HBSS ناقص الكالسيوم 2 + / 2 ملغ +). وينبغي أن الكبد تبييض.
- توصيل قسطرة الرابع لهذا النظام نضح. يروي مع HBSS ناقص الكالسيوم 2 + / 2 ملغ + بمعدل 20 مل / دقيقة لمدة 10 دقائق. المسح الشامل للIVC السفلي للكبد لتسمح بتصريف الدم وسائل الإرواء. نضح الدم المجمعة من تجويف البطن.
- تغيير السائل نضح في التوصل إلى حل كولاجيناز 0.3٪ (150 ملغ من كولاجيناز من النوع 2 في HBSS 500 مل زائد كا 2 + / + 2 ملغ)، ويروي لمدة 25 دقيقة. الحفاظ على رطوبة الكبد عن طريق تغطية ذلك مع رفرف البطن تشريح سابقا. وضع غطاء طبق بيتري على رفرف في البطن وموقف مصباح الحرارة على المنطقة للحفاظ على درجة الحرارة داخل البطن عند 37 درجة مئوية تقريبا
4. إعداد اله الشجرة الصفراوية
- إزالة الكبد عن طريق رفعها من خارج تجويف البطن مع ملقط ووضعها في صحن زراعة الأنسجة عقيمة ملأت مع وسائل الاعلام الباردة ليبوفيتز لL-15.
- العمل في النسيج غطاء محرك السيارة والثقافة، وانزع كبسولة الكبد وندف بلطف لحمة الكبد وبصرف النظر بالملقط. نقل كبد من خلال عدة اطباق مليئة Liebovitz وسائل الاعلام لL-15 مع الاستمرار في مشط بعيدا لحمة، حتى ترك أخيرا مع الشجرة الصفراوية معزولة. لحمة الكبد هو أسمر اللون، في حين أن شجرة المتبقية الصفراوية أبيض.
- وضع شجرة معزولة الصفراوية في أنبوب 50 مل صقر مليئة 10 مل من الستربتوميسين / البنسلين (10000 وحدة دولية / مل من البنسلين و10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين)؛ ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة.
5. عزل الخلايا الليفية كسر البوابة
- وضع الشجرة الصفراوية في معقم 50 مل أنبوب صقر واللحم المفروم مع مقص العقيمة.
- إضافة كمية صغيرة من سول انزيمution # 1 في أنبوب (حوالي 5 مل) والاستمرار في اللحم المفروم والشجرة الصفراوية حتى تصل إلى اتساق من الطين.
- صب المزيج في زجاجة زجاجية معقمة. تغسل صقر أنبوب مع الحل المتبقي رقم 1، ثم صب عليه في زجاجة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- تصفية الطين من خلال كوب مغطاة بطبقة واحدة من شبكة من النايلون (30 ميكرون حجم المسام).
- نقل أي نوع من الأنسجة المتبقية على رأس شبكة لقنينة زجاجية معقمة بواسطة شبكة غسل مع حل انزيم # 2. تبدأ بصب نصف (25 مل) من الحل في معقم 15 سم طبق بيتري. إزالة بعناية شبكة من الدورق عن طريق الضغط على حواف شبكة دون تلويث منطقة المركز، ثم قلب وعيون وغمس به الى حل في طبق بيتري لإزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية على شبكة. تجاهل شبكة. نقل الحل في طبق بيتري في زجاجة زجاجية معقمة. شطف طبق بيتري مع ريماining 25 مل من محلول رقم 2 وتحويلها الى زجاجة واحدة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- في غضون ذلك، أخذ الراشح في دورق وتصب في أنبوب 50 مل صقر. الطرد المركزي في 1600 دورة في الدقيقة (460 س ز) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح في وسائل الإعلام وresuspend بيليه في 25 مل من محلول رقم 3.
- اتخاذ حل من خطوة 5.5 وتصفية عليه في الدورق معقمة الثانية فشملت 30 ميكرون مع شبكة.
- تجاهل شبكة. منبذة الراشح في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح وresuspend وبيليه مع 25 مل من محلول رقم 3 كما حدث في الخطوة 5.7.
- الجمع بين الكسور 2 من خطوات 5.7 و 5.9 الطرد المركزي ومرة أخرى في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح في وسائل الإعلام وresuspend بيليه في 10 مل من بوابة وسائل الإعلام ثقافة الخلايا الليفية (DMEM/F12 تستكمل مع FBS 10٪ fungizone 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، جنتاميسين 0.3٪، و 0.2٪،).
- عد الخلايا للبقاء، وطبق في أطباق زراعة الأنسجة. اعتمادا على التطبيق المطلوب، 0.5 إلى 5 × 10 6 خلية لكل 10 سم نسيج لوحة ثقافة مناسبة. من الفئران، سبراغ داولي الكبار، وعادة ما نحصل على 2-10000000 خلايا قابلة للحياة.
- تحل محل وسائل الإعلام ثقافة في اليوم التالي لإزالة الحطام غير ملتصقة. بعد ذلك، تحل محل وسائل الإعلام ثقافة كل يوم 2.
6. ممثل النتائج
وتظهر الخلايا الليفية المدخل الرئيسي المعزولة من كبد الفئران الكبار في 1 و 3 و 7 أيام بعد العزلة (الشكل 3). لاحظ أن الخلايا ممدود، مع نموذجي مورفولوجيا الخلايا الليفية. ويمكن ملطخة الخلايا المضادة للأجسام المضادة الإيلاستين (CL55041AP، Cedarlane مختبرات، برلنغتون، NC) للتأكد من نقاء. الليفية بوابة الخضوع لتفريق myofibroblastic في الثقافة. يمكن أن يكون أظهر هذا من قبل المناعية للأكتين العضلات على نحو سلس α (α-SMA، A2547، سيغما، سانت لويس، MO).
الجدول رقم 1. حلول الانزيم.
الشكل 1. ضبط نضح حتى ألف. شكل دائري المياه لارتفاع درجة حرارة العمود. العمود B. تحتوي على وسائل الاعلام نضح. جيم الصمام السيطرة على تدفق المضخة. D. مضخة تدفق. هاء متغير السرعة مضخة تمعجية. واو قارورة فراغ مع بيو النظيفة المنظفات. G. الحرارة مصباح. H. ماء الحمام لوسائل الإعلام نضح الاحترار.
فيقوإعادة 2. في نضح الموضع. A. رابعا القسطرة إدراجها في الوريد البابي، مع تأمين خياطة ومتصلة بشبكة أنابيب التروية عن طريق محبس. ب زجاج ماصة متصلة قارورة فراغ والشفط لإزالة جدار نضح السوائل استنزاف للخروج من IVC مقطوع. أولا الأمعاء. L. الكبد.
الشكل 3. على النقيض مرحلة المناعي وصمة عار من الخلايا الليفية بوابة فأر في الثقافة. الليفية بوابة تربيتها لمدة 1 و 3 و 7 أيام بعد العزلة كانت ثابتة وملطخة للالإيلاستين، α SMA ودابي.
Discussion
الليفية بوابة تلعب دورا هاما في التليف الصفراوي. نحن هنا وصفا لتعديل بروتوكول الأصلية التي نشرتها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران، وتوفير وسيلة مباشرة لدراسة هذه الفئة من السكان الخلايا في المختبر.
هذا النهج يستخدم الهضم البروتيني والترشيح حجم القاعدة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة التي يمكن الحصول عليها من السكان نقي نسبيا من الخلايا دون مرور في الثقافة، وتمكن من دراسة التعبير الجيني أو وظيفية سلوك الخلية بعد عدة أيام من العزلة. هذا الأسلوب يوفر أيضا القدرة على عزل الخلايا من الكبد على حد سواء صحية ومريضة.
واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الهضم الأنزيمي من لحمة الكبد. لضمان نجاح عملية الهضم، من المهم أن تؤكد ينضب تماما أن الدم من الكبد خلال perfu الأوليةسيون عن طريق التأكد من أن هناك ابيضاض حتى من الكبد. لتسهيل هذا، فمن الممكن استخدام مسحة القطن لتدليك بلطف في الكبد بينما perfusing. الإفراط في هضم نتائج حمة الكبد في تحقيق عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة، في حين أن وكيل الهضم سيجعل من الصعب فصل لحمة الكبد من الشجرة الصفراوية. ربما منذ استعدادات pronase يكون التغير في النشاط الأنزيمي بين الكثير مختلفة، وتعظيم الاستفادة من الكمية المستخدمة عندما تكون هناك حاجة إلى وجود عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة.
يجوز تعديل هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد فأر أو الشباب كبد الفئران باستخدام أصغر قسطرة الرابع على مقياس يقني؛ يدخل القنية في الوريد البابي، وخفض حجم حلول نضح بما يتناسب مع وزن الحيوان، وخفض معدل نضح الكبد لحوالي 10 مل / دقيقة.
بوابة الليفية في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic في 10-14 يوما، كما يتضح من α-SMA السابقينpression 9. وقد استخدمت علامات مختلفة للتمييز بين الخلايا الليفية بوابة من الخلايا النجمية كبدي، بما في ذلك fibulin-2، IL-6، الإيلاستين، نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات diphosphohydrolase-2 (NTPDase2)، 1-cofilin وبروتينات الخلايا العصبية مثل synaptophysin 2 و 6 و 10 و 11 . لقد وجدنا أن الإيلاستين هو علامة جيدة لالليفية البوابة، وحتى بعد تمايز myofibroblastic، في حين خسر NTPDase2 بعد الليفية بوابة خضعوا لثقافة بعد عدة أيام 9. ولذلك، فإننا نؤكد عادة عزل الخلايا الليفية المدخل تلطيخ المناعي للالإيلاستين.
الحد من هذه التقنية هو أنه، مباشرة بعد عزل الخلايا الليفية البوابة، وهناك نسبة ضئيلة من الخلايا بما في ذلك تلويث كوبفر والخلايا الصفراوية. والخلايا الليفية بوابة تتفوق هذه الخلايا الملوثة في غضون 2-3 أيام، ومع ذلك، مما يعني أن عدد السكان نقي نسبيا (> 98٪) 9.
SINCE الليفية بوابة في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic على البلاستيك زراعة الأنسجة، وعلينا أن ندرس هذه الخلايا عادة في غضون 7 أيام من العزلة. تتم المحافظة على الخلايا في وسائل الإعلام بوابة الثقافة الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، كما هو موضح في القسم طرق. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا البقاء على قيد الحياة في وسائط النمو التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني لعدة أيام. نحن عادة لا تستخدم وسائل الاعلام المصل منخفضة حتى 24 ساعة على الأقل بعد العزلة. مرة واحدة تخضع لتمايز الخلايا الليفية بوابة myofibroblastic، يمكن passaged هم عدة مرات، وأبقى كما أسهم المجمدة من myofibroblasts.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK05823 (لRGW)، F32 DK083213 (لjww قليلة)، F30 DK081265 (لالو)، وبواسطة منحة من فريد وسوزان الكبد للأطفال Biesecker مركز (لRGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
