Summary
चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts अलग करने के लिए एक तकनीक वर्णित है. यकृत perfused कर रहे हैं और पचा
Abstract
जिगर तंतुमयता से सक्रिय myofibroblasts के बाह्य मैट्रिक्स के अत्यधिक बयान से परिभाषित किया गया है. यकृत myofibroblasts यकृत तारामय कोशिकाओं, पोर्टल fibroblasts और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न fibroblasts 1 सहित कई व्यापारियों, कर रहे हैं. यकृत तारामय कोशिकाओं सबसे अच्छा अध्ययन किया गया है, लेकिन पोर्टल fibroblasts myofibroblast पूल में महत्वपूर्ण योगदान के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, विशेष रूप से पित्त 2 तंतुमयता में. पोर्टल के विषय में fibroblasts पित्त उपकला चोट के जवाब में प्रसार से गुजरना, संभवतः पित्त 3-5 scarring के प्रारंभिक चरणों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है. पोर्टल fibroblasts को अलग करने की एक विधि इस सेल की आबादी के इन विट्रो अध्ययन में अनुमति और भूमिका पोर्टल fibroblasts पित्त फाइब्रोसिस में खेलने का अधिक से अधिक समझने के लिए नेतृत्व होगा.
पोर्टल fibroblasts 6 परिणाम, 7 और ली सहित विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर पृथक किया गया हैएंजाइमी आकार 8 चयन के बाद पाचन के साथ देखें छिड़काव. पाचन और परिणाम तकनीक की तुलना में आकार चयन तकनीक का लाभ यह है कि सेल संस्कृति में पारित होने की आवश्यकता के बिना अध्ययन किया जा सकता है. यहाँ, हम मूल चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts कि प्राथमिक कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध जनसंख्या में परिणाम के अलगाव लिए Kruglov और 8 Dranoff के द्वारा वर्णित तकनीक का एक संशोधित संस्करण का वर्णन करता है.
Protocol
पूरी प्रक्रिया से बाहर कमरे के तापमान पर किया जाता है जब तक अन्यथा निर्दिष्ट.
1. एनजाइम समाधान की तैयारी
- तालिका 1 और बाँझ फिल्टर एक .22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करने के लिए अनुसार एंजाइम समाधान तैयार करें. उपयोग के समय 1 समाधान और कमरा और 4 में 3 समाधान तापमान पर 2 समाधान डिग्री सेल्सियस तक रखें. सभी समाधान और उपकरणों अलग कोशिकाओं के साथ संपर्क में आने बाँझ होना चाहिए.
2. परफ्यूज़न उपकरण की तैयारी
- HbSS शून्य से 2 Ca / 2 मिलीग्राम के साथ प्रधानमंत्री छिड़काव प्रणाली है, जो 37 के लिए गरम है डिग्री सेल्सियस नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए है कि perfusate 37 डिग्री सेल्सियस है जब यह यकृत में आता है, HbSS एक पानी स्नान 37 सी. ° करने के लिए सेट में गर्म है बाद में यह छिड़काव पंप के माध्यम से गुजरता है, यह एक तख्ताबंदीवाला कांच संघनित्र है कि 40 डिग्री सेल्सियस (1 छवि) के लिए एक पानी फैलानेवाला सेट करने के लिए जुड़ा हुआ है के माध्यम से चला जाता है.
- शल्य जीवाणुरहित70% इथेनॉल के साथ एक बीकर में ols.
3. जिगर के छिड़काव
- Nembutal की intraperitoneal इंजेक्शन (50-100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के लिए आवश्यक के रूप में पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त) एक वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहा असंवेदनता उत्पन्न करना.
- एक प्लास्टिक ट्रे पर एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और टेप के साथ ट्रे के लिए अंगों को ठीक.
- 70% EtOH साथ पेट साफ करें.
- त्वचा में midline में पेट पर एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. त्वचा यू के आकार का पेट पर एक बड़ी कटौती करने से दूर प्रावरणी से काटना. एक ही peritoneal गुहा बेनकाब आकार के बाद कैंची के साथ पेट की मांसपेशियों को काटो.
- 2 कपास swabs का उपयोग करने के लिए धीरे दाईं ओर उदरांग कदम पोर्टल शिरा बेनकाब.
- पोर्टल शिरा के नीचे दो बाँझ 2.0 रेशम sutures के दर्रे और शिथिल टाई.
- एक 16-18 गेज चतुर्थ कैथेटर के साथ पोर्टल शिरा Cannulate और शिथिल ती कस द्वारा जगह में कैथेटर सुरक्षितपिछले चरण (छवि 2) से sutures के एड.
- चतुर्थ कैथेटर (हेपरिन 5000 खासियत इकाइयों / एमएल HbSS शून्य से 2 Ca + / मिलीग्राम + 2 के 4 मिलीग्राम के साथ पतला के 1 मिलीग्राम) के माध्यम से पतला हेपरिन इंजेक्षन. जिगर रंग उड़ जाना चाहिए.
- छिड़काव प्रणाली चतुर्थ कैथेटर कनेक्ट. 20/10 मिनट के लिए मिलीग्राम मिनट की दर पर HbSS शून्य से 2 Ca / 2 मिलीग्राम के साथ छिड़कना. IVC के जिगर अवर करने के लिए रक्त और perfusate के जल निकासी की अनुमति आड़ा काट. उदर गुहा से जमा रक्त महाप्राण (व्यंजन).
- एक 0.3% Collagenase (500 मिलीलीटर HbSS प्लस 2 Ca / 2 मिलीग्राम + में टाइप 2 Collagenase के 150 मिलीग्राम) समाधान और 25 मिनट के लिए छिड़कना छिड़काव द्रव बदलें. यह पहले से विच्छेदित पेट प्रालंब के साथ कवर द्वारा जिगर नम रखें. पेट प्रालंब और क्षेत्र से अधिक एक गर्मी दीपक स्थिति पर एक पेट्री डिश कवर डाल करने के लिए लगभग 37 में अंतर पेट तापमान बनाए रखने के लिए डिग्री सेल्सियस
4. वें की तैयारीई पित्त पेड़
- यह संदंश साथ उदर गुहा से बाहर उठाने से जिगर निकालें और यह एक बाँझ ऊतक संस्कृति ठंड लेबोविट्ज़ एल -15 मीडिया से भरा पकवान में जगह है.
- टिशू कल्चर हुड में कार्य करना, जिगर कैप्सूल बंद छील और धीरे संदंश के साथ जिगर पैरेन्काइमा अलावा तंग. कई Liebovitz एल -15 मीडिया के साथ भरा बर्तन के माध्यम से जिगर ले जाएँ, जबकि दूर पैरेन्काइमा तंग करने के लिए जारी है, जब तक अंत में पृथक पित्त पेड़ के साथ छोड़ दिया. जिगर पैरेन्काइमा तन रंग का है, जबकि शेष पित्त पेड़ सफेद है.
- एक 50 मिलीलीटर बाज़ पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / 10 मिलीग्राम (10,000 आइयू / मिलीलीटर पेनिसिलिन और १०००० μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ भरा ट्यूब में अलग पित्त पेड़ प्लेस, बर्फ पर छोड़ 15 मिनट के लिए.
5. पोर्टल के विषय में fibroblast भिन्न का अलगाव
- एक बाँझ 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में पित्त पेड़ प्लेस और बाँझ कैंची के साथ क़ीमा.
- एंजाइम प की एक छोटी राशि जोड़ेंट्यूब में ution # 1 (के बारे में 5 मिलीग्राम) और पित्त पेड़ क़ीमा जारी जब तक यह एक घोल की स्थिरता तक पहुँच.
- एक बाँझ कांच की बोतल में घोल डालो. शेष # 1 समाधान के साथ बाहर धोने बाज़ ट्यूब, तो यह कांच की बोतल में डालना. 37 ° सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100 rpm पर मिलाते साथ सेते हैं.
- एक बीकर नायलॉन जाल (30 माइक्रोन रोमकूप आकार के) की एक परत के साथ कवर के माध्यम से घोल फ़िल्टर.
- एक बाँझ कांच की बोतल के एंजाइम समाधान # 2 के साथ जाल धोने के द्वारा किसी भी जाल के शीर्ष पर शेष ऊतक स्थानांतरण. समाधान के आधे (25 मिलीग्राम) एक बाँझ 15 सेमी पेट्री डिश में डालने का कार्य द्वारा शुरू करो. ध्यान केंद्र क्षेत्र contaminating के बिना जाल के किनारों पकड़े द्वारा बीकर से जाल को निकालने के लिए, तो inverting के जाल और यह पेट्री डिश में समाधान के लिए जाल पर किसी भी शेष ऊतक निकालने में सूई. जाल त्यागें. एक बाँझ कांच की बोतल में पेट्री डिश में समाधान स्थानांतरण. Rema साथ पेट्री डिश कुल्ला.25 मिलीलीटर समाधान # 2 और यह एक ही कांच की बोतल के लिए स्थानांतरण ining. 37 ° सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100 rpm पर मिलाते साथ सेते हैं.
- इस बीच में, बीकर में छानना और एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में डाल देना. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1600 आरपीएम (460 ग्राम एक्स) पर अपकेंद्रित्र.
- इस मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और # 3 समाधान के 25 मिलीलीटर में गोली resuspend.
- 5.5 कदम से समाधान ले लो और यह एक दूसरे बाँझ 30 माइक्रोन जाल के साथ कवर बीकर में फिल्टर.
- जाल त्यागें. 1600 rpm पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छानना अपकेंद्रित्र. महाप्राण (व्यंजन) और # 3 समाधान के 25 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend के रूप में 5.7 चरण में किया गया था.
- कदम 5.7 और 5.9 से 2 भिन्न जुडा है और 1600 rpm पर फिर से कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- इस मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और पोर्टल fibroblast संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर (DMEM/F12 10% FBS, fungizone के 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.3% gentamycin, और 0.2% के साथ पूरक) में गोली resuspend.
- व्यवहार्यता और ऊतक संस्कृति बर्तन में थाली के लिए कोशिकाओं गिनती. वांछित आवेदन पर निर्भर करता है, 0.5-5 6 10 x 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट प्रति कोशिकाओं उपयुक्त हैं. एक वयस्क चूहे Sprague-Dawley से, हम आम तौर पर 2 से 10 लाख व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं.
- संस्कृति मीडिया अगले दिन बदलें गैर पक्षपाती मलबे को हटा दें. इसके बाद, हर 2 दिनों संस्कृति मीडिया की जगह.
6. प्रतिनिधि परिणाम
प्राथमिक पोर्टल वयस्क चूहे जिगर से अलग fibroblasts अलगाव के बाद 1, 3 और 7 दिनों छवि (3) पर दिखाए जाते हैं. सूचना है कि कोशिकाओं, आकारिकी fibroblasts की ठेठ के साथ लम्बी हैं. शुद्धता की पुष्टि कोशिकाओं विरोधी elastin के एंटीबॉडी (CL55041AP, Cedarlane लैब्स, Burlington, नेकां) के साथ कलंकित किया जा सकता है. पोर्टल के विषय में fibroblasts संस्कृति में myofibroblastic भेदभाव से गुजरना. यह में α चिकनी पेशी actin (, A2547, सिग्मा, सेंट लुइस, MO α-SMA) के लिए Immunostaining द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.
1 टेबल एनजाइम समाधान.
आकृति 1. छिड़काव सेट ए. पानी वार्मिंग स्तंभ के लिए फैलानेवाला. बी स्तंभ छिड़काव मीडिया से युक्त. सी. पानी निकलने की टोंटी पंप बहिर्वाह को नियंत्रित. डी. इनफ्लो पम्प. ई. चर गति क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप. एफ जैव साफ़ डिटर्जेंट के साथ वैक्यूम फ्लास्क. जी हीट दीपक. एच. जल स्नान वार्मिंग छिड़काव मीडिया के लिए.
Figu2 फिर से. सीटू छिड़काव में ए. चतुर्थ कैथेटर पोर्टल नस में डाला, सीवन के साथ सुरक्षित और छिड़काव टयूबिंग के माध्यम से पानी निकलने की टोंटी के लिए जुड़ा हुआ है. बी ग्लास विंदुक वैक्यूम फ्लास्क और दीवार चूषण से जुड़े छिड़काव transected IVC के बाहर से draining तरल पदार्थ को निकालने के. मैं आंतों. एल लीवर.
चित्रा 3. चरण विपरीत और immunofluorescence चूहा पोर्टल fibroblasts की संस्कृति में दाग पोर्टल अलगाव के बाद 1, 3, और 7 दिनों के लिए सभ्य fibroblasts. तय किया गया और elastin, α-SMA और DAPI के लिए दाग.
Discussion
पोर्टल के विषय के fibroblasts पित्त फाइब्रोसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम मूल चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts अलग, इन विट्रो में इस सेल की आबादी का अध्ययन करने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करने के लिए Kruglov और 8 Dranoff में प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक संशोधन का वर्णन.
इस दृष्टिकोण प्रोटीज पाचन और आकार के आधार पर निस्पंदन का उपयोग करता है. विधि का प्राथमिक लाभ यह है कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध जनसंख्या संस्कृति में पारित होने के बिना प्राप्त किया जा सकता है, जीन अभिव्यक्ति या अलगाव के बाद कई दिनों कार्यात्मक सेल व्यवहार के अध्ययन को सक्षम करने. इस तकनीक को भी दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त यकृत से कोशिकाओं को अलग करने के लिए क्षमता प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम के यकृत पैरेन्काइमा के enzymatic पाचन है. सफल पाचन सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रारंभिक perfu के दौरान पुष्टि है कि रक्त पूरी तरह से जिगर के बाहर सूखायकीन है कि वहाँ भी जिगर की blanching द्वारा सायन. इस सुविधा के लिए, यह संभव है एक कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए धीरे से यकृत की मालिश जबकि perfusing. व्यवहार्य कोशिकाओं की कम उपज में जिगर पैरेन्काइमा परिणाम की पाचन, जबकि तहत पाचन पित्त पेड़ से जिगर पैरेन्काइमा को अलग करने के लिए मुश्किल कर देगा. चूंकि pronase की तैयारी अलग बहुत, प्रयोग किया जाता राशि के अनुकूलन के बीच enzymatic गतिविधि में परिवर्तनशीलता है जब वहाँ व्यवहार्य कोशिकाओं की कम उपज है की जरूरत हो सकती है.
इस प्रोटोकॉल एक छोटे गेज चतुर्थ कैथेटर का उपयोग पोर्टल शिरा cannulate द्वारा माउस जिगर या युवा चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts, अलग पशु वजन के अनुपात में छिड़काव समाधान की मात्रा कम है, और लगभग 10 से जिगर छिड़काव की दर कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है / एमएल मिनट.
संस्कृति में पोर्टल fibroblasts 10-14 दिनों में myofibroblastic भेदभाव से गुजरना है, के रूप में α-SMA के पूर्व के द्वारा evidenced9 अभिव्यक्ति. विभिन्न मार्करों यकृत तारामय कोशिकाओं fibulin-2, आईएल -6, elastin, से पोर्टल fibroblasts भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है न्यूक्लीओसाइड diphosphohydrolase 2 - (NTPDase2) triphosphate, cofilin की 1 और 2 synaptophysin, 6, 10, 11 के रूप में neuronal प्रोटीन . हमने पाया है elastin कि पोर्टल fibroblasts के लिए एक अच्छा मार्कर है, myofibroblastic भेदभाव के बाद भी, जबकि NTPDase2 के बाद पोर्टल fibroblasts कई 9 दिनों के बाद संस्कृति आया है खो दिया है. इसलिए, हम आम तौर पर elastin के लिए immunofluorescence धुंधला द्वारा पोर्टल fibroblasts की अलगाव की पुष्टि.
इस तकनीक की सीमा यह है कि, पोर्टल तंतुप्रसू अलगाव के तुरंत बाद, Kupffer कोशिकाओं और पित्त कोशिकाओं सहित कोशिकाओं contaminating के एक छोटा सा अंश है. पोर्टल fibroblasts 2-3 दिनों के भीतर इन contaminating के कोशिकाओं को विकसित हो जाना, लेकिन जाएगा, एक अपेक्षाकृत शुद्ध (> 98%) आबादी 9 उपज.
सीnce संस्कृति में पोर्टल fibroblasts टिशू कल्चर प्लास्टिक पर myofibroblastic भेदभाव से गुजरना है, हम आम तौर पर अलगाव के 7 दिनों के भीतर इन कोशिकाओं का अध्ययन. कोशिकाओं के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त पोर्टल fibroblast संस्कृति मीडिया में रखा जाता है, के रूप में तरीकों खंड में वर्णित है. हालांकि, इन कोशिकाओं के विकास मीडिया में कई दिनों के लिए 2% से भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त बच जाएगा. हम आम तौर पर कम सीरम मीडिया के अलगाव के बाद कम से कम 24 घंटे तक प्रयोग नहीं करते. एक बार पोर्टल fibroblasts myofibroblastic भेदभाव से गुजरना, वे कई बार passaged किया जा सकता है और myofibroblasts के जमे हुए स्टॉक के रूप में रखा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम में R01 एनआईएच DK05823 (RGW के लिए), DK083213 F32 (JWW के लिए), DK081265 F30 (ALO करने के लिए), और फ्रेड और थीं Biesecker बाल यकृत केन्द्र (RGW के लिए) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
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