Summary
ラット肝臓からポータル線維芽細胞を単離するための手法が説明されています。肝臓を灌流し、消化され
Abstract
肝線維症は、活性化線維芽細胞による細胞外マトリックスの過剰堆積によって定義されています。肝星細胞、ポータル線維芽細胞および骨髄由来線維芽細胞の1を含む肝筋線維芽細胞の複数の前駆体は、あります。肝星細胞は、最もよく研究されていますが、ポータル線維芽細胞が増加し、特に胆管線維症2で、筋線維芽細胞プールに重要な貢献者として認められています。ポータル線維芽細胞は、潜在的に胆管瘢痕3-5の初期段階で重要な役割を果たして、胆管上皮損傷に応答して増殖を受けています。ポータル線維芽細胞を単離する方法は、この細胞集団の in vitro試験で許可したポータル線維芽細胞は胆管線維症に果たす役割の理解につながる。
ポータル線維芽細胞が伸長6、7、およびLiを含む様々な技法を用いて単離されたサイズ選択8に続いて酵素消化し たバージョン灌流。伸長技術に比べて消化とサイズの選択方法の利点は、細胞が培養中の通路の必要なしに研究することができるということです。ここでは、初代培養細胞の比較的純粋な人口の結果はラットの肝臓からポータル線維芽細胞を単離するためのKruglovとDranoff 8で記述されたオリジナル技法の修正版を記述します。
Protocol
特記のない限り、全体の手順は室温で行われる。
1。酵素溶液の調製
- 表1及び0.22μmフィルターを用いて滅菌フィルターに応じて酵素溶液を調製する。使用時まで4℃、室温および溶液3の溶液1と溶液2°Cを保持します。単離された細胞と接触するすべてのソリューションおよび機器は、無菌でなければなりません。
2。灌流装置の準備
- 首相HBSSマイナスのCa 2 +灌流システム37に温めました/ Mg 2 +を 、℃注：灌流液は、それが肝臓に到達したときに、HBSSを37℃に設定し、水浴中で温めて37℃であることを確認するにはそれは血流ポンプを通過した後、それが40°C（ 図1）水循環·セットに接続されているジャケット付きガラスコンデンサーを通過します。
- に外科的滅菌70％エタノールでビーカーでオール。
3。肝臓の血流
- ネンブタールの腹腔内注射（十分な麻酔を得るために必要に応じて50から100 mg / kg体重）で大人の雄Sprague-Dawleyラットを麻酔。
- プラスチック製のトレイに仰臥位で動物を置き、テープでトレイに手足を固定します。
- 70％EtOHで腹部をきれいにします。
- 正中線で腹部の皮膚に小切開を行います。腹部に大きなU字型のカットを行うことによって離れて筋膜から皮膚を解剖。腹腔を露出するために、同じ形状を以下のはさみで腹部の筋肉を切り取ります。
- 静かに右側に腹部内臓を移動するには、2綿棒を使用して門脈を公開します。
- 門脈の下にある2つの滅菌2.0絹縫合糸を通過し、緩く接続します。
- 大まかにTIを締めて、16から18ゲージの静脈カテーテルの門脈にカニューレを挿入し、場所にカテーテルを固定し前のステップ（ 図2）からEDの縫合糸。
- IVカテーテル（HBSSマイナスのCa 2 + / Mg 2 +の4ミリリットルで希釈したヘパリン5000 USP単位/ mlの1ミリリットル）を介して希釈したヘパリンを注入します。肝臓は白くする必要があります。
- 灌流システムへのIVカテーテルを接続します。 + 10分20ミリリットル/分の速度でHBSSマイナスのCa 2 + / Mgを2で灌流。血液と灌流液の排水を可能にするために肝臓に劣ってIVCをトランセクト。腹腔からプールされた血液を吸引除去する。
- 0.3％コラゲナーゼ溶液（500ml HBSSプラスのCa 2 + / Mg 2 +の 2型コラゲナーゼの150 mg）と25分間灌流する灌流液を変更します。以前に解剖し、腹部フラップとそれを覆うことにより、肝臓を湿った状態に保つ。約37℃で、腹腔内温度を維持するために領域の上腹部フラップ位置の熱ランプ上のペトリ皿のカバーを置く℃に
4。番目の調製電子胆道系
- 鉗子で腹腔からそれを持ち上げて肝臓を取り出して、冷たいリーボビッツのL-15メディアを充填した滅菌組織培養皿に置きます。
- 肝臓カプセルをはがし、組織培養フードで働いて、ゆっくりと鉗子で離れて肝実質をいじめる。最終的に孤立した胆管と左まで、実質を離れていじめるを継続しながらLiebovitzのL-15メディアを充填したいくつかの料理を介して肝臓に移動します。残りの胆管が白であるのに対し、肝実質は、着色された黄褐色です。
- ペニシリン/ストレプトマイシンを10ml（10,000 IU / mlペニシリンおよび10,000μg/ mlのストレプトマイシン）を充填した50mlファルコンチューブに孤立した胆道系を配置し、15分間氷上におきます。
5。ポータル線維芽細胞画分の分離
- 滅菌した50mlファルコンチューブに胆管を配置し、滅菌したハサミでミンチ。
- 酵素ゾルの少量を追加します。チューブにution＃1（約5ml）とは、スラリーの整合性に到達するまで、胆道系をミンチし続けています。
- 滅菌したガラス瓶にスラリーを注ぐ。残りの溶液＃1をファルコンチューブを洗浄し、ガラスの瓶にそれを注ぐ。 30分間、100rpmで振とうしながら37℃でインキュベートします。
- ナイロンメッシュの単層（30ミクロンの細孔サイズ）で覆われたビーカーを介してスラリーをフィルタリングします。
- 酵素溶液＃2にメッシュを洗浄することにより滅菌したガラス瓶にメッシュの上に残った組織を転送します。滅菌した15センチメートルペトリ皿にソリューションの半分（25 ml）を注入することから始めます。慎重にメッシュを反転し、中央部を汚染することなく、メッシュのエッジを保持してビーカーからメッシュを削除し、メッシュ上に残っている組織を除去するためのペトリ皿内の溶液に浸し。メッシュを破棄します。滅菌したガラス瓶にペトリ皿内の溶液を転送します。 remaのペトリ皿をすすぐ25mlのソリューション第2 iningと同じガラスの瓶に移します。 30分間、100rpmで振とうしながら37℃でインキュベートします。
- その間に、ビーカーにろ液を取り、50mlファルコンチューブに注ぐ。室温で5分間1600 rpmで（460×g）で遠心します。
- 培地を吸引除去し、ソリューション＃3 25ml中にペレットを再懸濁します。
- ステップ5.5から解決策を取ると、30ミクロンのメッシュで覆われた第二滅菌ビーカーに入れ、それをフィルタリングします。
- メッシュを破棄します。室温で5分間1600 rpmでろ液を遠心分離します。吸引し、ステップ5.7で行われていたようなソリューション＃3の25ミリリットルでペレットを再懸濁します。
- ステップ5.7と5.9から2分画を組み合わせて、室温で5分間1600 rpmで再び遠心する。
- 吸引は、メディアやポータル線維芽細胞培養培地を10ml（10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.3％ゲンタマイシン、および0.2％ファンギゾンを補充したDMEM/F12）でペレットを再懸濁します。
- 組織培養皿に生存率およびプレートの細胞をカウントします。目的のアプリケーションに応じて、10cmの組織培養プレート当たり0.5〜5×10 6個の細胞が適切である。大人のSprague-Dawleyラットから、我々は、通常2から10000000生細胞を取得します。
- 非接着性の残骸を削除するには、次の日に培地を交換してください。その後、2日毎に培地を交換してください。
6。代表的な結果
成体ラットの肝臓から単離された主要なポータル線維芽細胞を単離後1、3および7日（ 図3）で示されている。細胞は線維芽細胞の形態典型的に、伸長されることに注意してください。細胞は、純度を確認するために、抗エラスチン抗体（CL55041AP、Cedarlane Labsは、バーリントン、ノースカロライナ州）で染色することができます。ポータル線維芽細胞は、培養中の筋線維芽細胞分化を受けています。これは、α-平滑筋アクチン（; A2547、シグマ、セントルイス、MOα-SMA）の免疫染色によって実証することができます。
表1酵素ソリューションを提供しています。
図1。灌流は設定してください。A.地球温暖化列の水循環装置。灌流メディアを含むB.列。 C.コックは、ポンプの流出を制御します。 D.は、ポンプ流入します。 E.は、可変速度蠕動ポンプ。バイオクリーン洗剤でF.真空フラスコ。 G.ヒートランプ。温暖化灌流メディアのH.の水浴中。
ふぃぎゅRE 2。 現場灌流します 。A. IVカテーテルは、縫合糸で固定し、活栓を介して灌流チューブに接続され、門脈に挿入されます。 B.ガラスピペットは、切離IVCの外に排出する灌流液を除去するため真空フラスコと壁吸引に接続されています。 I.の腸。 L.肝。
図3。位相コントラストおよび蛍光抗体法は、培養中のラットの門脈線維芽細胞の染色。単離後1、3、7日間培養ポータル線維芽細胞はエラスチン、α-SMAおよびDAPIに固定して染色した。
Discussion
ポータル線維芽細胞は胆管線維症において重要な役割を果たしている。ここでは、ラット肝臓からポータル線維芽細胞を分離し、in vitroでこの細胞集団を研究するための簡単な方法を提供するためにKruglovとDranoff 8で掲載されたプロトコルの変更を説明します。
このアプローチは、プロテアーゼ消化とサイズベースのろ過を使用しています。メソッドの主な利点は、セルの比較的純粋な人口は、遺伝子発現または数日間隔離後の機能細胞の挙動の研究を可能にし、文化の中で通過せずに取得することができることである。また、この手法は、健康と病気の両方の肝臓から細胞を単離するための可能性を提供しています。
このプロトコルの中で最も重要なステップの一つは、肝実質領域の酵素消化である。成功した消化性を確保するためには、初期perfu中にその血が完全に肝臓の外に排出されていることを確認することが重要であるさらに肝臓が漂白されていることを確認することによってシオン。これを容易にするためには、灌流しながらゆっくりと肝臓をマッサージして綿棒を使用することが可能です。生細胞の収率が低いの肝実質の結果の過剰消化、下の消化が困難胆道系から肝実質を分離することになりますた。プロナーゼの準備は、異なるロット間の酵素活性の変動を持っているので、生細胞の収率が低いがある場合には、使用量の最適化が必要になることがあります。
このプロトコルは、動物の体重に比例して灌流液の体積を減少し、約10に肝灌流率が減少し、門脈をカニューレを挿入するために小さいゲージIVカテーテルを使用してマウスの肝臓や若いラットの肝臓からポータル線維芽細胞を単離するために変更することができるml /分。
α-SMAの元で明らかなように文化のポータル線維芽細胞は、10〜14日で筋線維芽細胞分化を受ける下り坂9。様々なマーカーは、肝星状フィブリン-2を含む細胞は、IL-6、エラスチン、ヌクレオシド三リン酸-2（NTPDase2）、コフィリン-1やシナプトフィジン2、6、10、11などの神経タンパク質からポータル線維芽細胞を区別するために使用されています。我々は、ポータル線維芽細胞が数日9時より後に文化を受けた後NTPDase2が失われている間エラスチンは、さらに筋線維芽細胞分化後、ポータル線維芽細胞の良いマーカーであることを発見した。したがって、我々は通常、エラスチンのための免疫蛍光染色することにより、ポータル線維芽細胞の分離を確認します。
この手法の限界はすぐにポータル線維芽細胞の分離した後、クッパー細胞と胆管細胞などの汚染のわずかな部分がある、ということです。ポータル線維芽細胞は、比較的純粋な人口（> 98％）9を得た、しかし、2〜3日以内に、これらの混入細胞を脱却します。
Siの文化のポータル線維芽細胞は、組織培養プラスチック上筋線維芽細胞分化を受けるNCEは、一般的に分離7日以内に、これらの細胞を研究しています。メソッドのセクションで説明したように細胞は、10％ウシ胎児血清を含むポータル線維芽細胞培養培地で維持されます。しかし、これらの細胞は数日間、2％ウシ胎児血清を含む増殖培地中で生存します。我々は一般的に分離した後少なくとも24時間まで低血清培地を使用しないでください。ポータル線維芽細胞が筋線維芽細胞分化を受けると、それらは数回継代し、筋線維芽細胞の凍結ストックとして保持することができます。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH R01 DK05823（RGWまで）、F32 DK083213（JWWまで）、F30 DK081265（ALOまで）によって、フレッドとスザンヌBiesecker小児肝センター（RGWまで）からの助成金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
