Summary
Een techniek voor het isoleren van portal fibroblasten van rat lever wordt beschreven. Levers zijn perfusie en verteerd
Abstract
Leverfibrose wordt bepaald door de grote afzetting van extracellulaire matrix door geactiveerde myofibroblasten. Er zijn meerdere voorlopers van de lever myofibroblasten, met inbegrip van leverstellaatcellen, portal fibroblasten en beenmerg afgeleide fibroblasten 1. Leverstellaatcellen zijn de best bestudeerde, maar vergeten fibroblasten worden in toenemende mate erkend als belangrijke bijdrage aan de myofibroblast zwembad, met name in biliaire fibrose 2. Portal fibroblasten proliferatie ondergaan in reactie op biliaire epitheliale letsel, mogelijk een sleutelrol spelen in de vroege stadia van biliaire littekens 3-5. Een methode voor het isoleren van portaalsite fibroblasten in staat zou stellen in vitro studie van deze cel bevolking en tot meer begrip van de rol portal fibroblasten spelen in biliaire fibrose.
Portaal fibroblasten werden geïsoleerd met behulp van diverse technieken zoals uitgroei 6, 7 en liver perfusie met enzymatische afbraak gevolgd door maatselectie 8. Het voordeel van de spijsvertering en maatselectie techniek ten opzichte van de uitwas techniek is dat cellen bestudeerd worden zonder de noodzaak passage in cultuur. Hier beschrijven we een gewijzigde versie van het oorspronkelijke techniek beschreven door Kruglov en Dranoff 8 portal voor isolatie van fibroblasten van rattenlever dat resulteert in een relatief zuivere populatie van primaire cellen.
Protocol
De gehele procedure wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
1. Bereiding van enzymoplossingen
- Bereid enzym-oplossingen op basis van tabel 1 en steriele filter met behulp van een 0,22 pm filter. Houd oplossing 1 en 2 oplossing bij kamertemperatuur en de oplossing 3 bij 4 ° C tot gebruik. Alle oplossingen en delen in contact met geïsoleerde cellen moeten steriel.
2. Voorbereiding van de Perfusie Equipment
- Vul de perfusiesysteem met HBSS min Ca2 + / Mg2 +, die is verwarmd tot 37 ° C. Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de perfusievloeistof 37 ° C als het aankomt op de lever, HBSS wordt verwarmd in een waterbad op 37 ° C. Na het passeren van de perfusie pomp gaat door een glazen koeler mantel die een circulatiepomp set verbonden 40 ° C (Fig. 1).
- Steriliseer chirurgische omOLS in een bekerglas met 70% ethanol.
3. Perfusie van de lever
- Verdoven een volwassen mannelijke Sprague-Dawley rat door intraperitoneale injectie van Nembutal (50-100 mg / kg lichaamsgewicht nodig om voldoende anesthesie verkrijgen).
- Plaats het dier in een liggende positie op een plastic bakje en zet de ledematen om de lade met tape.
- Maak de buik met 70% EtOH.
- Maak een kleine incisie in de huid op de buik in de middellijn. Ontleden de huid afstand van de fascia door een grote U-vormige snede in het achterlijf. Snijd de buikspier met een schaar naar aanleiding van de dezelfde vorm naar de peritoneale holte bloot te leggen.
- Expose de poortader met behulp van twee wattenstaafjes om de ingewanden van de buik zachtjes te verplaatsen naar de rechterkant.
- Passeer twee steriele 2,0 zijden hechtdraden onder de poortader en knoop los.
- Canule de poortader met een 16-18 meter IV katheter en zet de katheter op zijn plaats door het aandraaien van de los tied hechtingen van de vorige stap (afb. 2).
- Injecteer verdunde Heparine door IV katheter (1 ml heparine 5000 USP eenheid / ml met 4 ml HBSS minus Ca2 + / Mg2 +). De lever moet blancheren.
- Sluit de IV katheter naar de perfusie-systeem. Doorstroomd met HBSS min Ca2 + / Mg2 + met een snelheid van 20 ml / min gedurende 10 minuten. Transect het IVC inferieur aan de lever afvoer van bloed en perfusaat mogelijk te maken. Zuig gepoolde bloed uit de buikholte.
- Wijzigen perfusievloeistof een 0,3% collagenase oplossing (150 mg van type 2 collagenase in 500 ml HBSS plus Ca2 + / Mg2 +) en doorstroomd 25 minuten. Houd de lever vochtig door het te bedekken met de eerder ontleed buik flap. Plaats een petrischaal kap over de buik-klep en de positie van een warmte lamp boven het gebied om de intra-abdominale temperatuur te behouden op ongeveer 37 ° C.
4. Bereiding van the galwegen
- Haal de lever door deze uit de buikholte met een pincet en plaats deze in een steriele weefselkweek schaal gevuld met koud Leibovitz's L-15 media.
- Werken in de weefselkweek kap, haal de lever capsule en voorzichtig uit elkaar te plagen het leverparenchym met een pincet. Verplaats de lever via verschillende gerechten gevuld met Liebovitz's L-15 media en tegelijkertijd om te plagen weg parenchym, totdat uiteindelijk achter met de geïsoleerde galwegen. De leverparenchym is bruin gekleurd, terwijl de overige galwegen is wit.
- Plaats de geïsoleerde galwegen in een 50 ml Falcon buis gevuld met 10 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml penicilline en 10.000 ug / ml streptomycine), laat op ijs gedurende 15 minuten.
5. Isolatie van de Portal Fibroblast Fraction
- Plaats de galwegen in een steriele 50 ml Falcon buis en gehakt met een steriele schaar.
- Voeg een kleine hoeveelheid enzym solution # 1 in de buis (ongeveer 5 ml) en blijven de galwegen gehakt totdat het de consistentie van een suspensie.
- Giet de brij in een steriele glazen fles. Spoel de falcon tube met de resterende oplossing # 1, dan giet het in de glazen fles. Incuberen bij 37 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 30 minuten.
- Filter de slurry door een bekerglas bedekt met een laag van nylon (30-micron poriegrootte).
- Overdragen weefsel resterende bovenop het gaas een steriele glazen fles door wassen met mesh enzymoplossing # 2. Begin door gieten helft (25 ml) van de oplossing in een steriele 15 cm petrischaal. Verwijder het gaas van de beker door de randen van het gaas zonder besmetting van het middengedeelte, dan inverterende gaas en dompelen in de oplossing in een petrischaal aan een restmateriaal te verwijderen het gaas. Gooi het net. De oplossing in de Petri-schaal in een steriele glazen fles. Spoel de petrischaal met de Remaining 25 ml oplossing # 2 en overbrengen naar dezelfde glazen fles. Incuberen bij 37 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 30 minuten.
- In de tussentijd neemt het filtraat in het bekerglas en giet het in een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer bij 1600 rpm (460 x g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig media en resuspendeer de pellet in 25 ml van de oplossing # 3.
- Neem de oplossing van stap 5.5 en filteren in een tweede steriele beker bedekt met 30-micron mesh.
- Gooi het net. Centrifugeer het filtraat bij 1600 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig en resuspendeer de pellet met 25 ml van de oplossing # 3, zoals werd gedaan in stap 5.7.
- Meng de twee fracties van stap 5.7 en 5.9 en centrifugeer opnieuw bij 1600 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig media en resuspendeer de pellet in 10 ml van de portal fibroblast cultuur media (DMEM/F12 aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, gentamycine 0,3% en 0,2% fungizone).
- Tel cellen voor de levensvatbaarheid en de plaat in weefselkweek gerechten. Afhankelijk van de gewenste toepassing van 0,5 tot 5 x 10 6 cellen per 10 cm weefselkweek plaat geschikt. Van een volwassen Sprague-Dawley rat wij gewoonlijk verkregen 2-10.000.000 levensvatbare cellen.
- Vervang de cultuur media de volgende dag om niet-klevende vuil te verwijderen. Daarna vervang voedingsbodems om de 2 dagen.
6. Representatieve resultaten
Primaire portaal fibroblasten geïsoleerd uit volwassen rattenlever wordt op 1, 3 en 7 dagen na isolatie (Fig. 3). Merk op dat de cellen worden verlengd, met morfologie typisch fibroblasten. Cellen kunnen worden gekleurd met anti-elastine antistoffen (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) om zuiverheid te bevestigen. Portal fibroblasten ondergaan myofibroblastic differentiatie in cultuur. Dit kan worden aangetoond door immunokleuring voor α-gladde actine (α-SMA, A2547, Sigma, St. Louis, MO).
Tabel 1. Enzymoplossingen.
Figuur 1. Perfusie opgezet. A. Water circulatiepomp voor het verwarmen van kolom. B. kolom met perfusie media. C. afsluitkraan het regelen van de pomp uitstroom. D. Pomp instroom. E. met variabele snelheid peristaltische pomp. F. Vacuum kolf met Bio-Clean reinigingsmiddel. G. Heat lamp. H. Waterbad voor het verwarmen van perfusie media.
Figure 2. In situ perfusie. A. IV katheter ingebracht in de poortader, beveiligd met hechtingen en verbonden met de perfusieslang via kraan. B. glas pipet verbonden afzuigkolf en wand zuigkracht perfusievloeistof afvoer van doorgesneden IVC verwijderen. I. darmen. L. lever.
Figuur 3. Fase contrast en immunofluorescentie kleuring van de rat-portaal fibroblasten in de cultuur. Portal fibroblasten gekweekt voor 1, 3, en 7 dagen na isolatie werden gefixeerd en gekleurd voor elastine, α-SMA en DAPI.
Discussion
Portal fibroblasten spelen een belangrijke rol in biliaire fibrose. Hier beschrijven een wijziging van de oorspronkelijke protocol gepubliceerd Kruglov en Dranoff 8 portal voor het isoleren fibroblasten uit rattenlever, die een eenvoudige manier om deze cellen in vitro te bestuderen.
Deze aanpak maakt gebruik van protease spijsvertering en de grootte op basis van filtratie. Het belangrijkste voordeel van de werkwijze is dat een relatief zuivere populatie van cellen kunnen worden verkregen zonder passage in cultuur, waardoor de studie van genexpressie of functionele celgedrag enkele dagen na isolatie. Deze techniek biedt ook de mogelijkheid voor het isoleren van cellen van gezonde en zieke levers.
Een van de meest kritische stappen in dit protocol is de enzymatische vertering van het leverparenchym. Om goed spijsvertering, is het belangrijk dat bloed volledig afgevoerd uit de lever bevestigen tijdens de eerste perfusieCommissie door ervoor te zorgen dat er zelfs wordt het blancheren van de lever. Om dit mogelijk te maken, is het mogelijk om een wattenstaafje gebruiken om zachtjes masseren van de lever, terwijl perfuseren. Over-digestie van het leverparenchym resulteert in een lage opbrengst van levensvatbare cellen, terwijl onder-digestie zal bemoeilijken de leverparenchym scheiden van de galwegen. Omdat de voorbereidingen van pronase hebben variabiliteit in enzymatische activiteit tussen de verschillende partijen, optimalisatie van de gebruikte hoeveelheid kan nodig zijn wanneer er lage opbrengst van levensvatbare cellen.
Dit protocol kan worden aangepast voor het isoleren van portal fibroblasten van muizen lever-of jonge rat lever met behulp van een kleinere maat IV katheter naar de poortader canule, het verminderen van het volume van de bloedtransfusie-oplossingen in verhouding tot dieren gewicht, en het verminderen van de leverperfusie percentage op ongeveer 10 ml / min.
Portal fibroblasten in de cultuur ondergaan myofibroblastic differentiatie in 10-14 dagen, zoals blijkt uit α-SMA expressie 9. Verschillende markers zijn gebruikt om portaal fibroblasten onderscheiden leverstellaatcellen, zoals fibulin-2, IL-6, elastine, nucleoside trifosfaat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2) cofilin-1 en neuronale eiwitten zoals synaptophysine 2, 6, 10, 11 . Wij hebben gevonden dat een goed elastine marker voor portaal fibroblasten, zelfs na myofibroblastic differentiatie, terwijl NTPDase2 verdwijnt na portaal fibroblasten ondergaan cultuur na enkele dagen 9. Daarom hebben we meestal te bevestigen isolatie van portale fibroblasten door immunofluorescentiekleuring voor elastine.
De beperking van deze techniek is dat, direct na portaal fibroblast isolatie is een klein gedeelte van contaminerende cellen inclusief Kupffer-cellen en gal cellen. Portaal fibroblasten zullen groeien deze verontreinigende cellen binnen 2-3 dagen echter waarbij een relatief zuivere populatie (> 98%) 9.
SiNVU-portaal fibroblasten in de cultuur te ondergaan myofibroblastic differentiatie op weefselkweek plastic, hebben we meestal te bestuderen deze cellen binnen de 7 dagen van isolatie. Cellen worden gehandhaafd portaal fibroblast kweekmedia dat 10% foetaal runderserum, zoals beschreven in de volgende sectie. Maar deze cellen overleven groeimedia met 2% foetaal bovine serum enkele dagen. We hebben meestal geen gebruik maken van lage serum media tot minstens 24 uur na isolatie. Zodra portal fibroblasten ondergaan myofibroblastic differentiatie, kunnen ze worden gepasseerd meerdere malen en bleef als bevroren voorraden myofibroblasten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH R01 DK05823 (tot RGW), F32 DK083213 (om JWW), F30 DK081265 (tot ALO), en door een subsidie van het Fred en Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (tot RGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
