Summary
En teknikk for å isolere portal fibroblaster fra rotteleveren er beskrevet. Livers er perfused og fordøyd
Abstract
Leverfibrose er definert av overdreven deponering av ekstracellulær matrix ved aktiverte myofibroblasts. Det er flere forløpere til hepatiske myofibroblasts, inkludert hepatiske stellate celler, portal fibroblaster og beinmarg avledet fibroblaster en. Nedsatt stellate celler har vært den beste studert, men portalen fibroblaster blir stadig mer anerkjent som viktige bidragsytere til myofibroblast bassenget, særlig i biliær fibrose to. Portal fibroblaster gjennomgå spredning i respons til biliær epiteliale skade, potensielt spille en nøkkelrolle i de tidlige stadier av biliær arrdannelse 3-5. En metode for å isolere portalen fibroblaster ville tillate in vitro studie av denne cellen befolkningen og føre til større forståelse for den rollen portalen fibroblaster spille i biliær fibrose.
Portal fibroblaster har vært isolert ved hjelp av forskjellige teknikker, inkludert utvekst 6, 7 og Liver perfusjon med enzymatisk fordøyelse etterfulgt av størrelse valg 8. Fordelen med fordøyelse og størrelsen utvalg teknikk i forhold til utvekst teknikken er at cellene kan studeres uten nødvendigheten av passasjen i kulturen. Her beskriver vi en modifisert versjon av den opprinnelige teknikken beskrevet av Kruglov og Dranoff 8 for isolering av portalen fibroblaster fra rotteleveren som resulterer i en relativt ren populasjon av primære celler.
Protocol
Hele prosedyren utføres ved romtemperatur mindre annet er spesifisert.
1. Utarbeidelse av enzym Solutions
- Forbered enzym løsninger i henhold til tabell 1 og sterilt filter ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter. Hold løsning 1 og løsning 2 ved romtemperatur og løsningen 3 ved 4 ° C til brukstid. Alle løsninger og utstyr som kommer i kontakt med isolerte celler må være steril.
2. Utarbeidelse av Perfusjons utstyr
- Prime perfusjon system med HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 +, som har blitt varmet til 37 ° C. Merk: For å sikre at perfusate er 37 ° C når den ankommer leveren, er HBSS varmet i vannbad satt til 37 ° C. Etter den passerer gjennom perfusjon pumpe, går det gjennom en Jacketed glass kondensator som er koblet til en vann pumpe sett til 40 ° C (Fig. 1).
- Steriliser kirurgisk tilOLS i et beger med 70% etanol.
3. Perfusjon av leveren
- Anesthetize en voksen hann Sprague-Dawley rotte ved intraperitoneal injeksjon av Nembutal (50-100 mg / kg kroppsvekt som er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig anestesi).
- Plasser dyret i liggende stilling på et plastbrett og fikse lemmer til skuffen med tape.
- Rengjør magen med 70% EtOH.
- Lag et lite snitt i huden på magen i midtlinjen. Dissekere huden vekk fra konseptet ved å lage en stor U-formet snitt på magen. Kutt abdominal muskel med saks etter den samme formen for å avdekke bukhulen.
- Utsett portvenen ved hjelp av 2 bomullspinner til å forsiktig flytte abdominal viscera til høyre side.
- Pass to sterile 2,0 silke suturer under portvenen og slips løst.
- Cannulate portalen venen med en 16-18 måler IV kateter og sikre kateteret på plass ved å stramme den løst TIed suturer fra forrige trinn (Fig. 2).
- Injiser fortynnede Heparin gjennom IV kateter (1 ml Heparin 5000 USP Enheter / ml fortynnet med 4 ml HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 +). Leveren bør forvelle.
- Koble IV kateter til perfusjon systemet. Perfuse med HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + med en hastighet på 20 ml / min i 10 minutter. Transekt den IVC dårligere til leveren for å tillate drenering av blod og perfusate. Sug samlet blod fra bukhulen.
- Endre perfusjon væske til en 0,3% collagenase løsning (150 mg av type 2 collagenase i 500 ml HBSS pluss Ca 2 + / Mg 2 +) og perfuse i 25 minutter. Hold leveren fuktig ved å dekke den med tidligere dissekert abdominal klaff. Sett en petriskål deksel over abdominal klaff og posisjon en varmelampe over området for å opprettholde intra-abdominale temperatur på ca 37 ° C.
4. Utarbeidelse av the Leverscintigrafi Tre
- Ta leveren ved å løfte det ut fra bukhulen med pinsett og legg den i et sterilt vev kultur fatet fylt med kaldt Leibovitz L-15 media.
- Arbeid i vevskultur panseret, skrelle av leveren kapselen og forsiktig erte leveren parenchyma hverandre med tang. Flytt leveren gjennom flere retter fylt med Liebovitz L-15 media mens du fortsetter å erte bort parenchyma, helt til slutt igjen med den isolerte galle treet. Leveren parenchyma er tan farget, mens de resterende gallen treet er hvit.
- Plasser den isolerte gallen treet inn en 50 ml falk rør fylt med 10 ml av penicillin / streptomycin (10 000 IE / ml penicillin og 10.000 mikrogram / ml streptomycin), la på is i 15 minutter.
5. Isolasjon av portalen fibroblast Brøk
- Plasser biliær treet i en steril 50 ml falk rør og kjøttdeig med steril saks.
- Legg til en liten mengde enzym solution # 1 inn i røret (ca. 5 ml) og fortsetter å hakke på gallen treet til den når konsistens av en slurry.
- Hell slurry i et sterilt glass flaske. Skyll falk tube med den gjenværende løsningen # 1, og hell det i glass flaske. Inkuber ved 37 ° C med rist ved 100 rpm i 30 minutter.
- Filtrer slurry gjennom et beger dekket med et enkelt lag av nylon mesh (30-micron porestørrelse).
- Overføre noen vev igjen på toppen av mesh til et sterilt glass flaske ved å vaske den mesh med enzymet løsning 2. Start med å helle halvparten (25 ml) av løsningen til et sterilt 15 cm petriskål. Fjern forsiktig mesh fra begeret ved å holde kantene av mesh uten å forurense området i midten, deretter snu mesh og dyppe den i løsningen i petriskål for å fjerne eventuelle gjenværende vev på mesh. Kast mesh. Overfør løsningen i petriskål til et sterilt glass flaske. Skyll petriskål med Remaining 25 ml løsning 2 og overføre den til samme glassflaske. Inkuber ved 37 ° C med rist ved 100 rpm i 30 minutter.
- I mellomtiden, ta filtratet i begerglasset og hell i en 50 ml falk tube. Sentrifuger ved 1600 rpm (460 x g) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer media og resuspender pelleten i 25 ml oppløsning # 3.
- Ta løsningen fra trinn 5,5 og filtrere det inn i en andre sterilt beger dekket med 30-micron mesh.
- Kast mesh. Sentrifuger filtratet ved 1600 rpm i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer og resuspender pelleten med 25 ml # 3 som ble gjort i trinn 5.7.
- Kombiner de 2 fraksjonene fra trinn 5,7 og 5,9 og sentrifuger igjen ved 1600 rpm i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer media og resuspender pelleten i 10 ml av portalen fibroblast dyrkingsmedier (DMEM/F12 supplert med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 0,3% gentamycin, og 0,2% fungizone).
- Telle celler for levedyktigheten og plate i vevskulturstudier retter. Avhengig av ønsket program, 0,5 til 5 x 10 6 celler per 10-cm vevskultur plate er passende. Fra en voksen Sprague-Dawley rotte, vi vanligvis får 2 til 10 millioner levedyktige celler.
- Bytt kultur media neste dag for å fjerne ikke-tilhenger rusk. Deretter erstatte dyrkingsmedier hver 2 dager.
6. Representative Resultater
Primære portalen fibroblaster isolert fra voksen rotteleveren blir vist på 1, 3 og 7 dager etter isolering (Fig. 3). Legg merke til at cellene er langstrakt, med morfologi typisk for fibroblaster. Celler kan farges med anti-elastin antistoff (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) for å bekrefte renhet. Portal fibroblaster gjennomgå myofibroblastic differensiering i kultur. Dette kan påvises ved farging for α-glatt muskulatur aktin (α-SMA, A2547, Sigma, St. Louis, Missouri).
Tabell 1. Enzyme løsninger.
Figur 1. Perfusjon satt opp. A. Vann sirkulasjonspumpe for oppvarming kolonne. B. Kolonne inneholder perfusjon media. C. stoppekran kontrollere pumpe avløp. D. Pumpe tilsig. E. Variabel hastighet peristaltiske pumpen. F. Termokanne med Bio-Clean vaskemiddel. G. varmelampe. H. vannbad for oppvarming perfusjon media.
Figure to. In situ perfusjon. A. IV kateter settes inn i portvenen, sikret med sutur og koblet til perfusjon slangen via stoppekran. B. Glass pipette knyttet til vakuum kolbe og vegg sug å fjerne perfusjon væske tappes ut av transected IVC. I. tarmen. L. Liver.
Figur 3. Fasekontrast og immunfluorescens beis av rotte portalen fibroblaster i kultur. Portal fibroblaster dyrket for 1, 3 og 7 dager etter isolering ble fikset og farget for elastin, α-SMA og DAPI.
Discussion
Portal fibroblaster spiller en viktig rolle i biliær fibrose. Her beskriver vi en endring av den opprinnelige protokollen publisert av Kruglov og Dranoff 8 for å isolere portal fibroblaster fra rotteleveren, og gir en grei måte å studere dette cellepopulasjon in vitro.
Denne tilnærmingen bruker protease fordøyelse og størrelse basert filtrering. Den primære fordelen med metoden er at en relativt ren populasjon av celler kan innhentes uten passasje i kultur, slik at studiet av genuttrykk eller funksjonell celle atferd flere dager etter isolasjon. Denne teknikken gir også muligheten for å isolere cellene fra både friske og syke lever.
En av de mest kritiske trinnene i denne protokollen er den enzymatiske fordøyelsen av nedsatt parenchyma. For å sikre en vellykket fordøyelsen, er det viktig å bekrefte at blod er helt tappet ut av leveren under den innledende perfuSion ved å sørge for at det blir enda blanchering av leveren. For å lette dette, er det mulig å bruke en bomullspinne for å massere leveren mens perfusing. Over-fordøyelse av leveren parenchyma resulterer i en lav yield på levedyktige celler, mens under-fordøyelsen vil gjøre det vanskelig å skille leveren parenchyma fra gallen treet. Siden preparater av pronase ha variasjon i enzymaktivitet mellom ulike masse, optimalisering av beløpet som brukes kan være nødvendig når det er lav yield på levedyktige celler.
Denne protokollen kan endres for å isolere portal fibroblaster fra mus lever-eller ung rotte leveren ved hjelp av en mindre måler IV kateter til cannulate portalen blodåre, redusere volumet av perfusjon løsninger i forhold til dyr vekt, og redusere leveren perfusjon satsen til om lag 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur gjennomgå myofibroblastic differensiering i 10-14 dager, noe som gjenspeiles av α-SMA expression 9. Ulike markører har blitt brukt til å skille portal fibroblaster fra hepatiske stellate celler, inkludert fibulin-2, IL-6, elastin, nukleosid trifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 og nevrale proteiner som to synaptophysin, 6, 10, 11 . Vi har funnet at elastin er en god markør for portal fibroblaster, selv etter myofibroblastic differensiering, mens NTPDase2 er tapt etter portal fibroblaster har gjennomgått kultur etter flere dager 9. Derfor har vi vanligvis bekrefte isolering av portalen fibroblaster ved immunfluorescens farging for elastin.
Begrensningen av denne teknikken er at umiddelbart etter portal fibroblast isolasjon, det er en liten brøkdel av forurensende celler, inkludert Kupffer celler og galle celler. Portal fibroblaster vil vokse disse forurensende celler i løpet av 2-3 dager, men som gir en forholdsvis ren befolkning (> 98%) 9.
SiNCE portalen fibroblaster i kultur gjennomgå myofibroblastic differensiering på vevskultur plast, vi vanligvis studere disse cellene innen 7 dager etter isolasjon. Cellene er opprettholdt i portalen fibroblast kultur medier som inneholder 10% fosterets bovint serum, som beskrevet i metoder delen. Imidlertid vil disse cellene overleve i vekstmedier som inneholder 2% fosterets bovint serum i flere dager. Vi vanligvis ikke bruker lave serum media før minst 24 timer etter isolasjon. Når portalen fibroblaster gjennomgå myofibroblastic differensiering, kan de bli passaged flere ganger og holdt som frosne bestander av myofibroblasts.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH R01 DK05823 (til RGW), F32 DK083213 (til JWW), F30 DK081265 (til ALO), og ved en bevilgning fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
