Summary
En teknik för att isolera portalen fibroblaster från råttlever beskrivs. Levrarna perfunderas och digereras
Abstract
Leverfibros definieras av överdriven avsättning av extracellulär matris genom aktiverade myofibroblaster. Det finns flera föregångare till hepatiska myofibroblaster, inklusive celler hepatiska stellatceller, portal fibroblaster och benmärg som härrör fibroblaster 1. Hepatiska stellatceller celler har varit den bäst studerade, men portal fibroblaster allt erkänns som viktiga bidragsgivare till myofibroblast poolen, särskilt i galla fibros 2. Portal fibroblaster genomgår proliferation som svar på gallan epitelial skada, eventuellt spela en viktig roll i de tidiga stadierna av gallan ärrbildning 3-5. En metod för att isolera portal fibroblaster skulle släppa in vitro studie av denna cell population och leda till större förståelse av den roll portalen fibroblaster spela i gallan fibros.
Portal fibroblaster har isolerats med användning av olika tekniker innefattande utväxt 6, 7 och liver perfusion med enzymatisk nedbrytning följt av storleken val 8. Fördelen med att uppslutningen och storleksselektion teknik jämfört med utväxt teknik är att celler kan studeras utan nödvändigheten av passage genom odlingen. Här beskriver vi en modifierad version av den ursprungliga tekniken beskriven av Kruglov och Dranoff 8 för isolering av portal fibroblaster från råttlever som resulterar i en relativt ren population av primära celler.
Protocol
Hela proceduren genomfördes vid rumstemperatur om inte annat anges.
1. Framställning av enzymlösningar
- Framställ enzymlösningar enligt tabell 1 och sterilt filter med användning av ett 0,22 pm filter. Hålla lösningen 1 och lösning 2 vid rumstemperatur och lösningen 3 vid 4 ° C tills de ska användas. Alla lösningar och utrustning som kommer i kontakt med isolerade celler måste vara sterila.
2. Beredning av Perfusion utrustning
- Prime perfusionssystemet med HBSS minus Ca 2 + / Mg2 +, vilket har värmts till 37 ° C. Obs: För att säkerställa att perfusatet är 37 ° C när den anländer till levern, är HBSS värms i ett vattenbad till 37 ° C. Efter det passerar genom perfusion pumpen, går det genom en mantel av glas kondensor som är ansluten till en vatten cirkulator satt till 40 ° C (fig. 1).
- Sterilisera kirurgiska attoler i en bägare med 70% etanol.
3. Perfusion av levern
- Bedöva en vuxen man Sprague-Dawley råtta genom intraperitoneal injektion av Nembutal (50-100 mg / kg kroppsvikt som krävs för att uppnå adekvat anestesi).
- Placera djuret i ryggläge på en plastbricka och fixa benen för att facket med tejp.
- Rengöra buken med 70% EtOH.
- Göra ett litet snitt i huden på buken i mittlinjen. Dissekera huden bort från fascia genom att göra en stor U-format snitt i buken. Skära den abdominala musklerna med en sax efter samma form för att exponera bukhålan.
- Exponera den portala venen med hjälp av 2 bomullstoppar för att försiktigt röra den abdominala viscera som den högra sidan.
- Pass två sterila 2,0 silkessuturer under portalen ven och knyta löst.
- Kanylera portvenen med en 16-18 gauge intravenös kateter och säkra katetern på plats genom att dra åt löst tied suturer från föregående steg (fig 2).
- Injicera utspädda Heparin genom intravenös kateter (1 ml heparin 5000 USP-enheter/ml utspädd med 4 ml HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 +). Levern ska blanchera.
- Ansluta intravenös kateter till perfusionssystemet. Perfundera med HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + vid en hastighet av 20 ml / min under 10 minuter. Transekt IVC underlägsen levern för att tillåta dränering av blod och perfusat. Aspirera sammanslagna blod från bukhålan.
- Ändra perfusionsfluidumet till en 0,3% kollagenas-lösning (150 mg typ 2 kollagenas i 500 ml HBSS plus Ca 2 + / Mg 2 +) och perfundera under 25 minuter. Håll levern fuktiga genom att täcka den med den tidigare dissekerade buken flik. Sätta en petriskål hölje över den abdominala klaffen och position en värmelampa över det område för att upprätthålla det intra-abdominala temperatur vid ca 37 ° C.
4. Beredning av tee gallträdet
- Avlägsna levern genom att lyfta ut från bukhålan med pincett och placeras i en steril skål för vävnadsodling med kallt Leibovitz L-15 medium.
- Arbetar i vävnadskultur huven, lossnar leverkapseln och försiktigt reta leverparenkym isär med pincetter. Flytta levern genom flera rätter fyllda med Liebovitz s L-15 media samtidigt som man fortsätter att retas bort parenkymet, tills slutligen kvar med isolerade galla trädet. Leverparenkym är brunfärgat, medan den återstående gallträdet är vit.
- Placera den isolerade gallträdet i en 50 ml Falcon-rör fyllt med 10 ml penicillin / streptomycin (10.000 lU / ml penicillin och 10.000 g / ml streptomycin); Lämna på is under 15 minuter.
5. Isolering av portalen Fibroblast Fraktion
- Placera den biliära trädet i en steril 50 ml Falcon-rör och mala med en steril sax.
- Tillsätt en liten mängd enzym solmepannor # 1 i röret (ca 5 ml) och fortsätta att mala den biliära trädet tills den når konsistensen av en uppslamning.
- Hälla uppslamningen i en steril glasflaska. Tvätta ut Falconrör med den återstående lösningen # 1, därefter hälla den i glasflaska. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 100 rpm under 30 minuter.
- Filtrera uppslamningen genom en bägare täckt med ett enda skikt av nylonnät (30-mikron porstorlek).
- Överföra en vävnad som finns kvar på toppen av nätet till en steril glasflaska genom tvättning av ingrepp med enzymlösningen # 2. Börjar med att hälla halv (25 ml) av lösningen till en steril 15 cm petriskål. Försiktigt bort mesh från bägaren genom att hålla kanterna av nätet utan att förorena det centrala området och sedan invertera mesh och doppa den i lösningen i en petriskål för att avlägsna eventuell kvarvarande vävnaden på nätet. Kasta nätet. Överför lösningen i petriskålen i en steril glasflaska. Skölj petriskålen med RemaAtt granska 25 ml lösning # 2 och överför den till samma glasflaska. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 100 rpm under 30 minuter.
- Under tiden tar filtratet i bägaren och häll ut på en 50 ml Falcon-rör. Centrifugera vid 1600 rpm (460 x g) under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera Media och suspendera pelleten i 25 ml lösning # 3.
- Ta lösningen från steg 5,5 och filtrera den i en andra steril bägare täckt med 30-mikron mesh.
- Kasta nätet. Centrifugera extraktet i 1600 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera och återsuspendera pelleten med 25 ml av lösning # 3 såsom gjordes i steg 5.7.
- Kombinera de 2 fraktionerna från steg 5.7 och 5.9 och centrifugera igen vid 1600 rpm under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera mediet och återsuspendera pelleten i 10 ml medium portal fibroblastkultur (DMEM/F12 kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 0,3% gentamycin och 0,2% fungizon).
- Räkna celler med avseende på viabilitet och plattan i vävnadsodlingsskålar. Beroende på den önskade tillämpningen, 0,5 till 5 x 10 6 celler per 10-cm vävnadskulturplatta är lämpliga. Från en vuxen Sprague-Dawley-råtta, får vi typiskt 2 till 10 miljoner livsdugliga celler.
- Byt odlingsmedia nästa dag för att avlägsna icke-vidhäftande skräp. Därefter ersätter Kultur media varje 2 dagar.
6. Representativa resultat
Primära portal fibroblaster isolerade från vuxna råttlever visas vid 1, 3 och 7 dagar efter isolering (fig. 3). Lägg märke till, att cellerna är långsträckta, med morfologi som är typisk för fibroblaster. Celler kan färgas med anti-elastin antikropp (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) för att bekräfta renhet. Portal fibroblaster genomgår myofibroblastic differentiering i kultur. Detta kan visas genom immunfärgning för α-glattmuskelaktin (α-SMA, A2547, Sigma, St Louis, MO).
Tabell 1. Enzymlösningar.
Figur 1. Perfusion inrättas. A. Vatten cirkulationspump för uppvärmning kolumn. B. Kolonn innehållande perfusionsmedia. C. Kranen kontrollera pump utflöde. D. Pump inflöde. E. Variabel hastighet peristaltiska pump. F. Termoskanna med Bio-Clean rengöringsmedel. G. värmelampa. H. Vattenbad för media värmande perfusion.
FIGUre 2. in situ perfusion. A. IV kateter insatt i portalen ven, fäst med sutur och ansluten till perfusionsslangen via kranen. B. glaspipett ansluten till vakuumkolven och vägg sug att ta bort perfusionsvätska rinner ut av transektionerade IVC. I. tarmarna. L. Lever.
Figur 3. Faskontrast och immunofluorescens-färgning av fibroblaster från råtta portal i kultur. Portal fibroblaster odlade under 1, 3 och 7 dagar efter isolering fixerades och färgades för elastin, α-SMA och DAPI.
Discussion
Portal fibroblaster spela en viktig roll i gallan fibros. Här beskriver vi en modifiering av den ursprungliga protokollet publicerats av Kruglov och Dranoff 8 för att isolera portalen fibroblaster från råttlever, vilket ger ett enkelt sätt att studera denna cell population in vitro.
Detta tillvägagångssätt använder proteasdigestion och storlek-baserade filtrering. Den primära fördelen med förfarandet är att en relativt ren population av celler kan erhållas utan passage i kultur, vilket möjliggör studier av genuttryck eller funktionella cellbeteende flera dagar efter isolering. Denna teknik erbjuder också möjligheter för att isolera celler från både friska och sjuka lever.
En av de mest kritiska stegen i detta protokoll är enzymatisk spjälkning av den hepatiska parenkym. För att säkerställa framgångsrik digerering, är det viktigt att bekräfta att blod helt töms ut från levern under den initiala perfunen genom att se till att det ens blekning av levern. För att underlätta detta är det möjligt att använda en bomullspinne för att försiktigt massera levern, medan perfusion. Över-digerering av resultaten leverparenkym i ett lågt utbyte av viabla celler, medan under-digerering kommer att göra det svårt att separera leverparenkym från gallträdet. Eftersom beredningar av pronas har variabilitet i enzymatisk aktivitet mellan olika partier, optimering av den använda mängden kan behövas när det är lågt utbyte av levande celler.
Detta protokoll kan modifieras för att isolera portal fibroblaster från muslever eller ung råttlever genom användning av en mindre gauge intravenös kateter att kanylera portvenen, minskar volymen hos perfusionslösningar i förhållande till djurets vikt och minskning av hastigheten leverperfusion till ca 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur genomgå myofibroblastic differentiering i 10-14 dagar, vilket framgår av α-SMA expression 9. Olika markörer har använts för att särskilja portalen fibroblaster från celler hepatiska stellatceller, inklusive Fibulin-2, IL-6, elastin, nukleosidtrifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), kofilin-1 och neuronala proteiner såsom synaptofysin 2, 6, 10, 11 . Vi har funnit att elastin är en bra markör för portal fibroblaster, även efter myofibroblastic differentiering, medan NTPDase2 går förlorad efter portal fibroblaster har genomgått kultur efter flera dagar 9. Därför bekräftar vi vanligtvis isolering av portalen fibroblaster genom immunofluorescens-färgning för elastin.
Begränsning av denna teknik är att, omedelbart efter portalen fibroblast isolering, det finns en liten fraktion av kontaminerande celler inkluderande Kupffer-celler och gallceller. Portal fibroblaster växer ur dessa kontaminerande celler inom 2-3 dagar, men i utbyte ge en relativt ren population (> 98%) 9.
SiNCE portal fibroblaster i kultur genomgår myofibroblastic differentiering på vävnadsodlingsplast, studerar vi vanligtvis dessa celler inom 7 dagar efter isolering. Cellerna hålls i portal medium fibroblastkultur innehållande 10% fetalt bovint serum, såsom beskrivs i metoddelen. Emellertid kommer dessa celler att överleva i odlingsmediet innehållande 2% fetalt bovint serum under flera dagar. Vi normalt inte använder låga serum media förrän tidigast 24 timmar efter isolering. När portal fibroblaster genomgår myofibroblastic differentiering, kan de passager flera gånger och hålls som frysta lager av myofibroblaster.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH R01 DK05823 (till RGW), F32 DK083213 (till JWW), F30 DK081265 (till ALO), och genom ett bidrag från Fred och Suzanne Biesecker Pediatric Lever Center (till RGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
