Summary
הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו מתעכל
Abstract
לייפת הכבד מוגדר על ידי בתצהיר יתר של תאי מטריקס ידי myofibroblasts מופעל. ישנם סימנים מקדימים מרובים של myofibroblasts בכבד, כולל stellate תאים בכבד, fibroblasts הפורטל מח עצם fibroblasts הנגזרות 1. Stellate תאים בכבד כבר למד הכי טוב, אבל fibroblasts פורטל מוכרים יותר ויותר תורמים חשובים בריכה myofibroblast, בעיקר סיסטיק המרה 2. Fibroblasts פורטל ריבוי עוברים בעקבות פציעה אפיתל המרה, שעלול לשחק תפקיד מפתח בשלבים הראשונים של המרה צלקות 3-5. שיטת בידוד fibroblasts הפורטל יאפשר במחקר במבחנה של אוכלוסייה זו התא להוביל להבנה טובה יותר של תפקיד fibroblasts פורטל משחקים סיסטיק המרה.
Fibroblasts פורטל היו מבודדים תוך שימוש בטכניקות שונות, כולל 6 תוצאה, 7 ו Liזלוף ver עם עיכול אנזימטי ואחריו מבחר בגודל 8. היתרון של מערכת העיכול ובחירת הטכניקה גודל לעומת הטכניקה תוצאה היא לתאים ניתן ללמוד ללא צורך במעבר בתרבות. כאן אנו מתארים גירסה שונה של הטכניקה המקורית שתואר על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 עבור בידוד של fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש המביא אוכלוסייה טהורה יחסית של תאים ראשוניים.
Protocol
ההליך כולו מתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת פתרונות אנזימים
- להכין פתרונות האנזים על פי טבלה 1 מסנן סטרילי באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון. שמור על פתרון 1 פתרון 2 בטמפרטורת החדר פתרון 3 על 4 ° C עד השימוש. כל פתרונות וציוד לבוא במגע עם תאים מבודדים חייב להיות סטרילי.
2. הכנת ציוד זלוף
- ראש מערכת טפטוף עם HBSS מינוס Ca 2 + / Mg 2 +, אשר כבר חימם עד 37 ° C. הערה: כדי להבטיח perfusate היא 37 מעלות צלזיוס כאשר הוא מגיע לכבד, HBSS מחומם באמבט מים מוגדר 37 ° C. לאחר שהוא עובר דרך המשאבה זלוף, זה עובר דרך הקבל כוס במקטורן המחובר למערכת circulator מים עד 40 ° C (איור 1).
- כירורגית כדי לעקרOLS בכוס עם אתנול 70%.
3. טפטוף של הכבד
- להרדים חולדה זכר בוגר Sprague-Dawley בזריקה intraperitoneal הנמבוטאל (50-100 מ"ג / ק"ג משקל גוף לפי הצורך להשיג הרדמה מספקת).
- מניחים את חיה במצב שכיבה על מגש פלסטיק לתקן את הגפיים למגש עם הקלטת.
- לנקות את הבטן עם EtOH 70%.
- לעשות חתך קטן בעור על הבטן על קו האמצע. לנתח את העור הרחק fascia על ידי ביצוע חתך גדול בצורת על הבטן. חותכים את שרירי הבטן במספריים בעקבות אותה צורה לחשוף את חלל הצפק.
- חושפים את הווריד הפורטל באמצעות 2 מטליות כותנה להזיז בעדינות את הקרביים בטן לצד ימין.
- לעבור שני תפרים סטריליים 2.0 משי מתחת הווריד הפורטל ולקשור באופן רופף.
- Cannulate וריד הפורטל עם קטטר 16-18 מד הרביעי ולהבטיח את הקטטר במקום על ידי הידוק רופף TIאד התפרים מהשלב הקודם (איור 2).
- להזריק הפרין בדילול מלא באמצעות קטטר IV (1 מ"ל של הפארין יחידות USP 5000 / מ"ל מדולל של 4 מ"ל HBSS מינוס Ca 2 + / Mg 2 +). הכבד צריך מחוויר.
- חיבור קטטר IV למערכת זלוף. Perfuse עם HBSS מינוס Ca 2 + / 2 + Mg בשיעור של 20 מ"ל / דקה במשך 10 דקות. Transect IVC נחות אל הכבד כדי לאפשר ניקוז של דם perfusate. לשאוב דם נקווה מחלל הבטן.
- לשנות את נוזל זלוף לפתרון collagenase 0.3% (150 מ"ג של collagenase מסוג 2 ב 500 מ"ל HBSS בתוספת Ca 2 + / 2 + Mg) ו perfuse במשך 25 דקות. לשמור על לחות בכבד על ידי כיסוי אותו עם דש גזור הבטן קודם לכן. לשים כיסוי על צלחת פטרי דש בטן עמדה מנורת החום על פני שטח כדי לשמור על הטמפרטורה התוך בטני על כ 37 ° C.
4. הכנת הדואר המרה עץ
- הסר את הכבד על ידי הרמתה מתוך חלל הבטן עם מלקחיים ומניחים אותו בתוך צלחת תרבות סטרילית רקמות מלא L-15 קר של ליבוביץ בתקשורת.
- עבודה בשכונה תרבות רקמות, לקלף את הקפסולה הכבד בעדינות להקניט parenchyma הכבד בנפרד עם מלקחיים. להעביר את הכבד באמצעות כלים שונים מלאים עם L-15 של Liebovitz התקשורת תוך כדי להקניט משם parenchyma, עד שלבסוף נשאר עם עץ מבודד המרה. Parenchyma הכבד הוא בצבע חום, בעוד עץ המרה שנותר לבן.
- מניחים את עץ מבודד המרה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל 10 מ"ל מלא של סטרפטומיצין / פניצילין (10,000 IU / mL פניצילין 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין); להשאיר על קרח במשך 15 דקות.
5. הבידוד של שבר פיברובלסטים Portal
- מניחים את העץ המרה לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל ו בז לקצץ במספריים סטריליות.
- הוספת כמות קטנה של אנזים סולution # 1 לתוך הצינור (כ - 5 מ"ל) ולהמשיך לרכך את העץ המרה עד שהוא מגיע עקביות slurry.
- יוצקים את התערובת לתוך בקבוק זכוכית סטרילית. לשטוף את צינור בז עם פתרון הנותרים # 1, ואז לשפוך אותו לתוך בקבוק זכוכית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל"ד 100 במשך 30 דקות.
- סנן slurry דרך הגביע מכוסה בשכבה אחת של רשת ניילון (30 מיקרון גודל הנקבוביות).
- להעביר את כל הרקמה הנותרת על גבי רשת אל בקבוק זכוכית על ידי שטיפה סטרילית רשת עם פתרון האנזים # 2. להתחיל לשפוך 1/2 (25 מ"ל) של הפתרון לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ סטרילי. מוציאים בזהירות את הרשת מן הגביע על ידי מחזיק את הקצוות של הרשת מבלי לזהם את אזור המרכז, ולאחר מכן היפוך רשת ו טובל אותו פתרון בצלחת פטרי כדי להסיר כל שנותר רקמות על רשת. מחק את הרשת. מעבירים את הפתרון בצלחת פטרי לתוך בקבוק זכוכית סטרילית. יש לשטוף צלחת פטרי עם הרמ"אining 25 מ"ל פתרון # 2 ולהעביר אותו בקבוק זכוכית זהה. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל"ד 100 במשך 30 דקות.
- בינתיים, קחו את תסנין בכוס ויוצקים לתוך צינור פלקון 50 מ"ל. סרכזת ב 1600 סל"ד (460 x ג') במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Aspirate מדיה resuspend גלולה ב 25 מ"ל של פתרון # 3.
- קח את הפתרון משלב 5.5 ולסנן אותו לתוך מבחנה סטרילית 2 מכוסה רשת 30 מיקרון.
- מחק את הרשת. בצנטריפוגה תסנין בסל"ד 1600 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Aspirate ו resuspend גלולה עם 25 מ"ל של פתרון # 3 כפי שנעשה בשלב 5.7.
- לשלב בין 2 שברים של צעדים 5.7 ו -5.9 ו סרכזת שוב בסל"ד 1600 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Aspirate מדיה resuspend גלולה ב 10 מ"ל של מדיה פורטל תרבות פיברובלסטים (DMEM/F12 השלימו עם 10% fungizone FBS 1% פניצילין / סטרפטומיצין, gentamycin 0.3% ו 0.2%).
- ספירת תאים עבור יכולת הקיום ואת הצלחת במאכלים בתרבית רקמה. בהתאם ליישום המבוקש, 0.5 עד 5 x 10 6 תאים לכל צלחת של 10 ס"מ בתרבית רקמה מתאימים. מאת עכברוש Sprague-Dawley מבוגר, אנחנו בדרך כלל להשיג 2 עד 10 מיליון תאים קיימא.
- החלף את המדיה תרבות למחרת כדי להסיר אי - חסיד פסולת. לאחר מכן, להחליף את המדיה כל תרבות 2 ימים.
6. נציג תוצאות
Fibroblasts פורטל ראשיים מבודד הכבד חולדה בוגרת מוצגים 1, 3 ו - 7 ימים לאחר הבידוד (איור 3). שימו לב כי תאים מוארכים, עם טיפוסי המורפולוגיה של fibroblasts. תאים יכולים להיות מוכתם נוגדנים נגד ואלסטין (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) כדי לאשר את טוהר. Fibroblasts פורטל עוברים התמיינות myofibroblastic בתרבות. זו ניתן להדגים על ידי immunostaining של אקטין α-שריר חלק (α-SMA, A2547, Sigma, סנט לואיס, מיזורי).
טבלה 1. פתרונות האנזים.
באיור 1. זלוף להגדיר. א מים circulator עבור עמודה ההתחממות. טור ב 'המכיל התקשורת זלוף. ג שסתום בקרה יצוא המשאבה. משאבת ד יבוא. א משתנה במהירות peristaltic המשאבה. פ תרמוס עם אבקת כביסה ביו נקי. ג מנורת חום. מים ה 'אמבטיה מדיה זלוף ההתחממות.
FiguRe 2. ב זלוף באתרו. א קטטר IV המוחדרת לווריד פורטל מאובטח באמצעות תפר ומחובר צינורות טפטוף דרך שסתום. ב זכוכית פיפטה מחובר תרמוס ו יניקה הקיר כדי להסיר את נוזל זלוף מתנקז transected IVC. ט המעיים. כבד ל.
איור 3. לעומת זאת שלב ו immunofluorescence כתם של הפורטל fibroblasts עכברוש התרבות. Fibroblasts פורטל בתרבית של 1, 3 ו 7 ימים לאחר הבידוד קובעו ונצבעו על ואלסטין, α-SMA ו DAPI.
Discussion
Fibroblasts פורטל לשחק תפקיד חשוב סיסטיק המרה. כאן אנו מתארים שינוי של הפרוטוקול המקורי שפורסם על ידי קרוגלוב ו Dranoff 8 לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד חולדה, המספקת דרך פשוטה לבחון את אוכלוסיית תאים במבחנה.
גישה זו משתמשת העיכול פרוטאז וגודל מבוסס הסינון. היתרון העיקרי של שיטה זו היא אוכלוסיה טהורה יחסית של תאים ניתן להשיג ללא מעבר בתרבות, המאפשר מחקר של ביטוי גנים או התנהגות התא תפקודית מספר ימים לאחר הבידוד. טכניקה זו מציעה גם אפשרות של בידוד תאים כבדי שניהם בריאים וחולים.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא עיכול אנזימטי של parenchyma הכבד. כדי להבטיח עיכול מוצלח, חשוב לוודא דם סחוט לגמרי את הכבד במהלך perfu הראשוניתשיאון על ידי וודא כי יש אפילו לחלוט הכבד. כדי להקל, ניתן להשתמש מטלית כותנה כדי לעסות בעדינות את הכבד תוך המרוססת. יתר על מערכת העיכול של parenchyma תוצאות הכבד בתשואה נמוכה של תאים קיימא, בעוד תת העיכול יקשה להפריד parenchyma הכבד מעץ המרה. מאז ההכנות של pronase יש משונות הפעילות האנזימטית בין מגרשים שונים, אופטימיזציה של כמות משתמשים עשוי להיות נחוץ כאשר יש תשואה נמוכה של תאים קיימא.
פרוטוקול זה עשוי להיות שונה עבור בידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכבר או חולדה צעירה הכבד באמצעות קטטר קטן IV מד כדי cannulate וריד השער, להקטין את היקף פתרונות זלוף ביחס למשקל בעל החיים, ולהפחית את שיעור זלוף הכבד כ 10 mL / min.
Fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic ב 10-14 ימים, כפי שמעידים לשעבר α-SMAדיכאון 9. סמנים שונים שימשו להבחין fibroblasts לפורטל stellate תאים בכבד, כולל fibulin-2, IL-6, אלסטין, nucleoside טריפוספט diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 ו חלבונים עצביים כגון synaptophysin 2, 6, 10, 11 . מצאנו כי ואלסטין הוא סמן טוב fibroblasts הפורטל, גם לאחר התמיינות myofibroblastic, בעוד NTPDase2 אבד לאחר fibroblasts פורטל עברו תרבות אחרי כמה ימים 9. לכן, אנו בדרך כלל לאשר את הבידוד של fibroblasts פורטל ידי מכתים immunofluorescence עבור ואלסטין.
המגבלה של טכניקה זו היא, מיד לאחר בידוד פיברובלסטים הפורטל, יש חלק קטן של זיהום תאים, כולל תאים Kupffer ותאי המרה. Fibroblasts פורטל יתגבר על תאים אלה מזהמים תוך 2-3 ימים, לעומת זאת, מניב האוכלוסייה טהור יחסית (> 98%) 9.
סיNCE fibroblasts פורטל בתרבות עוברים התמיינות myofibroblastic על הפלסטיק תרביות רקמה, אנחנו בדרך כלל ללמוד תאים אלה תוך 7 ימים של בידוד. התאים נשמרים בפורטל תרבות התקשורת פיברובלסטים המכילים 10% בסרום שור עוברית, כמתואר בסעיף שיטות. עם זאת, תאים אלה ישרדו בתקשורת צמיחה המכילים 2% בסרום שור עוברית במשך כמה ימים. אנחנו בדרך כלל לא משתמשים במדיה בסרום נמוכות עד לפחות 24 שעות לאחר בידוד. לאחר fibroblasts פורטל עוברים התמיינות myofibroblastic, ניתן passaged מספר פעמים והמשיך כמו מניות הקפואים של myofibroblasts.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 DK05823 (כדי RGW), F32 DK083213 (כדי JWW), F30 DK081265 (כדי ALO), ועל ידי מענק מטעם פרד סוזן Biesecker מרכז ילדים כבד (כדי RGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
