Summary
쥐의 간장에서 포털 섬유아 세포를 분리를위한 기법을 설명합니다. 간은는 perfused과 소화하고
Abstract
간 섬유증이 활성화 myofibroblasts에 의한 세포외 기질의 과도한 증착에 의해 정의됩니다. 간장 별 모양의 세포, 포털 섬유아 세포 및 골수 유래 섬유아 세포 하나를 포함하여 간장 myofibroblasts의 여러 엽 성의 전구 물질이 있습니다. 간장 별 모양의 전지는 최고의 공부 줬어하지만 포털 섬유아 세포가 점점 특히 담즙의 섬유증 2, myofibroblast 수영장에 중요한 기여자로 인정됩니다. 포털 섬유아 세포는 잠재적으로 담즙이 3-5 흉터의 초기 단계에서 핵심적인 역할을 놀고, 담즙 상피 부상에 대한 응답으로 확산을 받고있다. 포털 섬유아 세포를 분리하는 방식이 세포 인구의 체외 연구에서 허용하고 포털 섬유아 세포가 담즙의 섬유증에서 재생 역할의 큰 이해로 이어질 것입니다.
포털 섬유아 세포가 돋아 나옴 6, 7, 리튬 등 다양한 기술을 사용하여 격리되어사이즈 선택 8 시까지 다음 효소 소화와 버전 재관류. 가지 기법에 비해 소화와 크기를 선택 기법의 장점은 세포 문화에 통과의 필요성없이 공부를 할 수있다는 것입니다. 여기서는 주된 세포의 비교적 순수한 인구시킨 결과가되는 쥐 간암에서 포털 섬유아 세포의 격리를 위해 Kruglov 및 Dranoff 8 시까지 설명한 원래 기술의 수정된 버전을 설명합니다.
Protocol
달리 명시되지 않는 한 모든 절차는 상온에서 수행됩니다.
1. 효소 솔루션의 작성
- 0.22 μm의 필터를 사용하여 표 1과 살균 필터에 따라 효소 솔루션을 준비합니다. 사용 시간까지 용액 1과 4에 실내 온도 및 솔루션 3 용액 2 ° C를 유지. 분리된 세포와 접촉으로 오는 모든 솔루션과 장비는 살균해야합니다.
2. 재관류 장비 준비
- HBSS 마이너스 칼슘 2 + / MG 2 프라임 관류 시스템은 +, 37로 예열되어있는 ° C. 참고 : perfusate 그것이 간장에 도착했을 때, HBSS가 37 ° C.로 설정 물을 욕조에 따뜻하게되어 37 ° C 있는지 확인하려면 그것이 관류 펌프 통과 후, 40 ° C (그림 1) 물 순환 장치 세트에 연결되어 외피 유리 콘덴서를 진행합니다.
- 대한 외과 소독70 % 에탄올로 비커에 ols.
3. 간의 재관류
- Nembutal의 intraperitoneal 주사 (적절한 마취를 얻을 필요에 50-100 밀리그램 / kg 체중)에 의해 성인 남자 Sprague-Dawley 쥐를 마취.
- 플라스틱 트레이에 위로 향한 자세로 동물을 놓고 테이프 트레이에 팔다리를 채운다.
- 70 % EtOH로 복부를 청소합니다.
- 중간선에서 복부의 피부에 작은 절개를합니다. 복부에 큰 U 형 절단함으로써 멀리 근막으로부터 피부를 해부. 복막 구멍을 노출하기 위해 같은 모양을 따라 가위로 복부 근육을 잘라요.
- 부드럽게 오른쪽 복부 내장을 이동이 면봉을 사용하여 포털 정맥을 쉽게받을 수 있습니다.
- 포털 정맥 밑에 둘 멸균 2.0 실크 봉합을 통과하고, 느슨하게 묶어.
- 16-18 게이지 IV 카테터에 포털 정맥을 Cannulate하고 느슨하게 TI를 강화하여 장소에 카테터를 확보이전 단계 (그림 2)에서 에드 봉합.
- IV 카테터 (HBSS 마이너스 칼슘 2 + / MG 2 + 4 ML에 희석 헤파린 5,000 USP 단위 / ML 중 1 ML)를 통해 희석된 헤파린을 주사. 간은 희게한다.
- 관류 시스템에 정맥 주사 카테터를 연결합니다. + 10 분 20 ML / 분 속도로 HBSS 마이너스 칼슘 2 + / MG 2 Perfuse. 혈액 및 perfusate의 배수를 허용하는 간장으로 IVC는 열등 가로로 쪼개다. 복강에서 풀링된 혈액을 기음.
- 0.3 % collagenase 용액 (500 ML HBSS 플러스 칼슘 2 + / MG 2 +의 제 2 형 collagenase 150 MG) 25 분 동안 perfuse로 관류 액을 변경합니다. 이전에 해부하는 복부 플랩로 덮는으로 간 촉촉한 유지. 약 37에서 내부 복부 온도를 유지하기 위해 영역을 통해 복부 플랩 및 위치 가열 램프를 통해 배양 접시 덮개를 올려 ° C.
4. 회의 작성전자 담즙의 나무
- 포셉과 복강으로부터 밖 리프팅하여 간을 제거하고 차가운 Leibovitz의 L-15 미디어로 가득 무균 조직 배양 접시에 넣습니다.
- 간 캡슐 보지, 조직 문화 후드에 근무하고 가볍게 포셉으로 떨어져 간 실질 조직을 괴롭혀. 마지막으로 격리된 담즙의 나무로 남아 때까지 실질 조직을 떠나 애타게 계속하면서 Liebovitz의 L-15 미디어로 가득한 여러 요리를 통해 간을 이동합니다. 남은 담즙의 나무가 흰색이지만 간 실질 조직은 색 황갈색이다.
- 페니실린 / 스트렙토 마이신의 10 ML (10,000 IU / ML 페니실린과 10,000 μg / ML의 스트렙토 마이신)로 가득한 50 ML 팔콘 튜브로 절연 담즙의 나무를 놓고, 15 분 동안 얼음에 둡니다.
5. 포털 Fibroblast 분획의 분리
- 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 담즙의 나무를 놓고 멸균 가위로 말하다.
- 효소 솔의 작은 금액을 추가튜브에 ution # 1 (약 5 ml) 쇼핑하고 슬러리의 일관성에 도달할 때까지 담즙의 나무를 말하다 것을 계속한다.
- 멸균 유리병에 슬러리 하거라. 남은 해결책 # 1 매는 튜브를 씻으 다음 유리병에 넣어서는. 30 분간 100 rpm으로 흔들어으로 37 ° C에서 품어.
- 나일론 메쉬의 단일 레이어 (30 마이크론 기공 크기)으로 덮여 비커를 통해 슬러리를 필터링합니다.
- 효소 용액 # 2와 메쉬를 세척하여 멸균 유리병에 메쉬 위에 남아있는 모든 조직을 전송합니다. 멸균 15cm 배양 접시에 솔루션의 절반 (25 ML)를 붓는하여 시작하십시오. 조심스럽게 메쉬 반전 후, 중심 지역을 훼손하지 않고 메쉬의 가장자리를 개최하여 비커에서 메쉬를 제거하고 메쉬에있는 모든 남아있는 조직을 제거하기위한 배양 접시에있는 솔루션으로 그것을 찍기. 메쉬를 폐기하십시오. 멸균 유리병에 배양 접시에있는 솔루션을 전송합니다. 레마와 페트리 접시를 린스25 ML 솔루션 # 2와 같은 유리병에 전송을 ining. 30 분간 100 rpm으로 흔들어으로 37 ° C에서 품어.
- 그러는 동안, 비커에 여과물을 타고 50 ML 팔콘 튜브에 붓는다. 상온에서 5 분간 1,600 RPM (460 X G)에서 원심 분리기.
- 미디어를 대기음 및 솔루션 # 3의 25 ML에 펠렛을 resuspend.
- 단계 5.5에서 솔루션을 타고 30 마이크론 메쉬로 덮여 두 번째 무균 비커에 그 파일을 필터링합니다.
- 메쉬를 폐기하십시오. 상온에서 5 분간 1,600 rpm으로 여과물을 원심 분리기. 기음과 스텝 5.7로 이루어졌다대로 해결책 # 3의 25 ML과 펠렛을 resuspend.
- 단계 5.7 및 5.9에서이 분수를 결합하고 실온에서 5 분간 1,600 rpm으로 다시 원심 분리기.
- 미디어를 대기음 및 포털 fibroblast 문화 매체의 10 ML (DMEM/F12 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.3 % gentamycin, 및 0.2 % fungizone과 보완)에 펠렛을 resuspend.
- 생존과 조직 문화 요리 접시 세포를 세어보세요. 원하는 응용 프로그램에 따라 10 cm 조직 배양 플레이트 당 0.5-5 X 10 6 세포가 적합합니다. 성인 Sprague-Dawley 쥐에서, 우리는 일반적으로 2-10000000 가능한 세포를 구하십시오.
- 비 점착 성의 잔해를 제거하려면 다음 날 문화 미디어를 교체합니다. 이후, 모든 이일 문화 미디어를 교체하십시오.
6. 대표 결과
성인 쥐의 간 격리 주요 포털 섬유아 세포는 격리 후 1, 3과 7 일 (그림 3)에 표시됩니다. 세포는 섬유아 세포의 형태학 전형으로 늘어나지되는 것을 확인할 수 있습니다. 세포 순도를 확인하기 위해 안티 - 엘라스틴 항체 (CL55041AP, Cedarlane 연구소, 벌링턴, NC) 물들일 수있다. 포털 섬유아 세포는 문화에 myofibroblastic 차별을 받고있다. 이것은 α-평활근의 actin (; A2547, 시그마, 세인트 루이스, 미주리 α-SMA)에 대해 immunostaining에 의해 입증하실 수 있습니다.
표 1. 효소 솔루션.
1 그림. 재관류가 설정할 수 있습니다. A. 온난 칼럼을위한 물 순환 장치. B. 칼럼은 재관류 미디어를 포함하는. C. 꼭지는 펌프 유출을 통제. 디 펌프 유입됩니다. E.은 가변 속도 연동 펌프. 바이오 클린 세제 F. 진공 플라스크. G. 히트 램프. 온난 화 재관류 미디어에 대한 H. 워터는 목욕.
Figu재 2. 현장 재관류합니다. A. IV 카테터는 봉합으로 확보하고 꼭지를 통해 관류 튜빙에 연결, 포털 정맥에 삽입. B. 유리 피펫은 가로로 IVC 밖으로 배수 관류 액을 제거하기 위해 진공 플라스크 및 벽면 흡입에 연결. I.의 창자. 기사를 간.
그림 3. 위상 콘트라스트와 immunofluorescence는 문화에 쥐 포털 섬유아 세포의 얼룩. 격리 후 1, 3, 7 일간 배양해 포탈 섬유아 세포가 엘라스틴, α-SMA 및 DAPI에 대한 고정 및 물들어 있었다.
Discussion
포털 섬유아 세포는 담즙의 섬유증의 중요한 역할을한다. 자, 쥐의 간 포털에서 섬유아 세포를 분리해 체외에서이 세포 인구를 공부하는 간단한 방법을 제공하는 Kruglov 및 Dranoff 8 시까지 발행된 원본 프로토콜의 수정에 대해 설명합니다.
이러한 접근 방식은 테아제 소화와 크기를 기반 여과를 사용합니다. 방법의 주요 장점은 세포의 비교적 순수한 인구가 유전자 발현이나 며칠이 고립 후 기능성 세포 행동을 연구함으로써, 문화의 통로없이 얻을 수있다는 것입니다. 이 기술은 또한 건강하고 병에 걸린 간은 모두에서 세포를 분리의 가능성을 제공합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 간장 실질 조직의 효소 소화입니다. 성공적인 소화를 위해, 그것은 초기 perfu 때에 혈액이 완전히 간 밖으로 빠져나간 것을 확인하는 것이 중요하다심지어는 간 상태가 창백되어 있는지 확인함으로써 시온. 이것을 촉진하기 위해서는 perfusing하면서 부드럽게 간이 마사지하기 위해 면봉을 사용할 수 있습니다. 실행 가능한 세포의 낮은 수확량의 간 실질 조직 결과의 이상 - 소화, 이하 - 소화가 어려운 담즙의 나무에서 간 실질 조직을 분리하는 것입니다 동안. pronase의 준비가 다른 많은, 사용 금액의 최적화 간의 효소 활동의 다양성을 가지고 있기 때문에 가능한 세포의 낮은 수율이있을 때 필요한 경우가 있습니다.
이 프로토콜은, 포털 정맥을 cannulate하는 작은 게이지 IV 카테터를 사용하여 마우스 간 또는 젊은 쥐의 간장에서 포털 섬유아 세포를 분리 동물의 무게에 비례하여 재관류 솔루션의 볼륨을 줄이는 약 10 간 재관류 율을 감소를 위해 수정할 수 있습니다 ML / 분.
문화 포털 섬유아 세포는 α-SMA의 전남편에 의해 입증, 10-14 일 myofibroblastic 차별을 받다pression 9. 각종 마커는 fibulin-2를 포함한 간장 별 모양의 세포, IL-6, 엘라스틴에서 포털 섬유아 세포를 구별하는 데 사용되었습니다 뉴클레오 사이드 triphosphate diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1과 같은 synaptophysin 2, 6, 10, 11 등의 연결 단백질 . 우리는 포털 섬유아 세포 며칠 9시 문화받은 후 NTPDase2이 손실되는 동안 엘라스틴은, 심지어 myofibroblastic 분화 이후, 포털 섬유아 세포에 대한 좋은 마커 것으로 나타났습니다. 따라서 일반적으로 엘라스틴을위한 immunofluorescence 염색법에 의해 포털 섬유아 세포의 절연을 확인합니다.
이 기법의 한계는 바로 포털 fibroblast 절연 후, Kupffer 세포 및 담즙의 세포를 포함한 세포를 오염의 작은 분수가라는 점이다. 포털 섬유아 세포는 비교적 순수한 인구 (> 98%) 9하였으며, 그러나, 2-3 일 이내에 이러한 오염 세포를 자라다 것입니다.
시문화 포털 섬유아 세포는 조직 배양 플라스틱에 myofibroblastic 차별을 받다 제정신, 우리는 일반적으로 고립 7 일 이내에 이들 세포를 공부합니다. 방법 섹션에 설명된대로 전지는 10 % 태아 소 혈청을 포함하는 포털 fibroblast 문화 매체에 보관됩니다. 그러나 이러한 세포는 며칠 동안 2% 태아 소 혈청을 포함하는 성장 미디어에서 살아남을 것입니다. 우리는 일반적으로 분리 후 최소 24 시간 전까지는 낮은 혈청 미디어를 사용하지 마십시오. 포털 섬유아 세포가 myofibroblastic 차별을 받다되면, 그들은 여러 번 passaged 및 myofibroblasts의 냉동 주식으로 보관하실 수 있습니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 DK05823 (RGW까지), F32 DK083213 (JWW까지), F30 DK081265 (ALO까지)에 의해 그리고 프레 드와 수잔 Biesecker 소아과 간 센터 (RGW까지)에서 교부금에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
