Summary
Sıçan karaciğerinden portal fibroblastlar izole etmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Karaciğerleri perfüze ve sindirilir
Abstract
Karaciğer fıbrozda, aktive edilmiş miyofibroblastlar tarafından hücre dışı matris aşırı depozisyonu ile tanımlanır. Karaciğer yıldızsı hücreleri, portal fibroblastlar ve kemik iliğinden elde edilen fibroblast 1 de dahil olmak üzere karaciğer miyofibroblastların birden öncüleri vardır. Karaciğer yıldızsı hücreler en iyi çalışılmış oldu, ama portal fibroblastlar giderek özellikle safra fibrozis 2, myo havuzuna önemli katkı olarak kabul edilmektedir. Portal fibroblastlar potansiyel safra 3-5 skar erken dönemlerinde önemli bir rol oynayan, biliyer epitel hasarına yanıt olarak çoğalma uğrarlar. Portal fibroblastlar izole bir yöntem bu hücre popülasyonunun in vitro çalışma izin ve portal fibroblastlar safra fibrozis oynadığı rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
Kapı fibroblastlar outgrowth 6, 7 ve Li içeren çeşitli teknikler kullanılarak izole edilmiştirboyutu seçimi 8 izledi enzimatik sindirimi ver perfüzyon. Outgrowth teknikle karşılaştırıldığında sindirim ve boyut seçimi tekniğin avantajı hücreleri kültürüne geçiş gerek kalmadan ele alınabilir olmasıdır. Burada, birincil hücre, saf bir nüfus ile sonuçlanan o sıçan karaciğer portal fibroblastların izolasyonu için Kruglov ve Dranoff 8 tarafından tarif edilen orijinal teknik değiştirilmiş bir sürümü açıklar.
Protocol
Aksi belirtilmediği sürece tüm işlemi, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Enzim Çözümler hazırlanması
- 0.22 um bir filtre kullanılarak, Tablo 1 ve steril filtre göre enzim çözümler hazırlayın. Kullanım zamanı kadar çözelti 1 ve 4 oda sıcaklığında ve solüsyon 3 azından çözeltisi 2 ° C'de tutmak. Izole edilmiş hücreler ile temas durumuna gelen bütün çözeltiler ve steril bir cihaz olmalıdır.
2. Perfüzyon Ekipmanları hazırlanması
- HBSS eksi Ca2 + / Mg 2 asal perfüzyon sistemi +, 37 kadar ılıtıldı edildiği ° C. Not: perfüzat bu karaciğer geldiğinde, HBSS 37 ° C'ye ayarlanmış su banyosunda ısıtılır 37 ° C olduğundan emin olmak için Bu perfüzyon pompa geçtikten sonra, bu 40 ° C'de (Şekil 1) için bir su sirkülasyon kümesine bağlanmış olan bir cam ceketli kondenser geçer.
- Için cerrahi sterilize% 70 etanol ile bir cam kapta ols'ün.
3. Karaciğer Perfüzyon
- Nembutal intraperitoneal (yeterli anestezi elde etmek için gerekli olarak 50-100 mg / kg vücut ağırlığı) bir yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan uyutmak.
- Plastik bir tepsi üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin ve bant ile tepsiye bacaklarda düzeltmek.
- % 70 EtOH ile karın temizleyin.
- Orta hatta karın derisinde küçük bir kesi yapmak. Karın üzerinde büyük bir U-şekilli kesim yaparak uzak fasya da deriyi parçalara ayır. Periton boşluğuna ortaya çıkarmak için aynı şekil takip makas ile karın kas kesin.
- Hafifçe sağ tarafa abdominal organları taşımak için 2 pamuklu çubuk kullanarak portal ven Açığa.
- Portal ven altına, iki steril 2.0 ipekle Pass ve gevşek bağlar.
- Bir 16-18 göstergesi IV kateter ile portal ven kanüle ve gevşek ti sıkarak yerine kateteri sabitlemekÖnceki adımda (Şekil 2) göre ed dikişlerle.
- IV kateter (HBSS eksi Ca2 + / Mg + 2 ve 4 ml ile seyreltilmiş Heparin 5000 USP ünite / ml 1 ml) ile seyreltilmiş Heparin enjekte edilir. Karaciğer mazur olmalıdır.
- Perfüzyon sistemine IV kateter bağlayın. + 10 dakika süreyle 20 ml / dak 'lık bir oranda HBSS eksi Ca2 + / Mg 2 ile perfüze. Kan ve perfüzat drenajı sağlamak için karaciğer IVC aşağı transeksiyonu. Karın boşluğundan toplanan kan aspire.
- A% 0.3 kollajenaz çözeltisi (500 ml HBSS artı Ca2 + / Mg + 2 tip 2 kollajenaz 150 mg) ve 25 dakika boyunca perfüze üzere perfüzyon sıvısı değişir. Daha önce disseke karın flep ile kaplayıp karaciğer nemli tutun. Yaklaşık 37 karın içi sıcaklığını korumak için alana karın flep ve konumunu bir ısı lambası üzerinde Petri kapak koyun ° C
4. Th hazırlanmasıe Safra Ağacı
- Forseps ile karın boşluğundan dışarı kaldırarak karaciğer çıkarın ve soğuk Leibovitz L-15 medya dolu steril doku kültürü tabağına yerleştirin.
- Karaciğer kapsül kalkmasına, doku kültürü kaput Çalışma ve yavaşça forseps dışında karaciğer parankimi kızdırmak. Nihayet izole safra yolları ile ayrılıncaya kadar, parankim uzak tease devam ederken Liebovitz L-15 medya ile dolu birkaç yemekler aracılığıyla karaciğer taşıyın. Kalan safra yolları beyaz ise karaciğer parankimi, renkli tan.
- Penisilin / streptomisin ve 10 ml (10.000 IU / ml penisilin ve 10,000 ug / ml streptomisin) ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüp içine izole safra yerleştirmek; 15 dakika süreyle buz üzerinde bırakın.
5.. Portal Fibroblast Fraksiyonu İzolasyonu
- Steril bir 50 ml falcon tüp içine safra yerleştirin ve steril makas ile kıyma.
- Enzim sol küçük bir miktar eklemetüp içine ution # 1 (5 ml) ve bir bulamaç kıvamındaki ulaşıncaya kadar safra kıyma devam etmektedir.
- Steril bir cam şişeye bulamaç dökün. Kalan çözüm # 1 şahinin tüp yıkayın, sonra cam şişeye dökün. 30 dakika boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edilir.
- Naylon örgü tek bir kat (30 mikron gözenek boyutu) kaplı bir behere aracılığıyla bulamaç filtre.
- Enzim çözeltisi # 2 ile kafes yıkanarak steril bir cam şişe örgü üstünde kalan herhangi bir doku aktarın. Steril bir 15 santimetrelik bir petri çanağı içine çözeltisi yarısının (25 ml) dökülerek başlar. Dikkatle örgü ters sonra, orta alanı kirletici olmayan örgü kenarları tutarak kaptan meş kaldırmak ve örgü üzerinde kalan herhangi bir doku kaldırmak için Petri tabağına çözelti içine daldırılması. Mesh atın. Steril bir cam şişeye Petri kabındaki solüsyonu aktarın. Rema ile Petri durulayın25 ml solüsyon # 2 ve aynı cam şişeye aktarın ining. 30 dakika boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edilir.
- Bu arada, beherindeki süzüntü alıp 50 ml falcon tüp içine dökün. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1600 rpm'de (460 x g) santrifüjlenir.
- Ortamı aspire ve solüsyon 3 # 25 ml pelletini.
- Adım 5.5 çözümü alın ve 30 mikron dokulu ikinci bir steril bir beher içine filtre.
- Mesh atın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1600 rpm'de santrifüje süzüntü. Aspire ve adım 5,7 olarak yapıldı çözeltisi # 3 ile 25 ml pelletini.
- Adımları 5.7 ve 5.9 den 2 fraksiyonlar birleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1600 rpm'de tekrar santrifüjlenir.
- Ortamı aspire ve portal fibroblast kültür ortamı, 10 ml (DMEM/F12% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.3 gentamisin, ve% 0.2 fungizone ile desteklenmiş) içinde pelletini.
- Canlılık ve doku kültürü yemekleri plaka için hücreleri hesaplama. İstenen uygulamaya bağlı olarak, 10 cm'lik bir doku kültürü plakası başına 0,5-5 x 10 hücreleri 6 uygundur. Bir yetişkin Sprague-Dawley sıçan, biz genellikle 2-10.000.000 canlı hücreler edinin.
- Yapışmaz enkaz kaldırmak için ertesi gün kültür ortamı değiştirin. Bundan sonra, her 2 gün kültür ortamı değiştirin.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Yetişkin sıçan karaciğer izole İlköğretim portalı fibroblastlar izolasyon sonra 1, 3 ve 7 gün (Şekil 3) gösterilir. Hücreler fibroblastların morfolojisi tipik olarak uzamış dikkat edin. Hücreler saflık onaylamak için anti-elastin antikor (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, Kuzey Carolina) ile boyanmış olabilir. Portal fibroblast kültüründe miyofibroblastik farklılaşma uğrarlar. Bu α-düz kas aktin (; A2547, Sigma, St Louis, MO α-SMA) için İmmünoboyama tarafından ortaya konabilir.
Tablo 1. Enzim çözümleri.
Şekil 1.. Perfüzyon kurdu. A. Isınma sütun için su sirkülatör. B. Sütun perfüzyon medya içeren. C. Musluk pompa çıkış kontrol. D. Pompa girişi. E. Değişken hızlı peristaltik pompa. Bio-Clean deterjan ile F. Vakum şişesi. G. Isı lambası. Isınma perfüzyon medya için H. Su banyosu.
Figuyeniden 2. in situ perfüzyon içinde. A. IV kateter sütür ile sabitlenir ve musluk aracılığıyla perfüzyon hortumu bağlı, portal ven içine yerleştirilir. B. Cam pipet kesilen IVC akıp perfüzyon sıvısına kaldırmak için termos ve duvar emme bağlı. I. Bağırsaklar. L. Karaciğer.
Şekil 3. Faz kontrast ve immünfloresan kültür sıçan portalı fibroblastların leke. Izolasyonu sonra 1, 3 ve 7 gün süreyle kültüre Portal fibroblastlar elastin, α-SMA ve DAPI için sabit ve boyandı.
Discussion
Portal fibroblastlar safra fibrozis önemli bir rol oynamaktadır. Burada, sıçan karaciğer portal fibroblastlar tecrit in vitro bu hücre popülasyonunu incelemek için basit bir yol sağlamak için Kruglov ve Dranoff 8 tarafından yayımlanan orijinal protokolünün bir değişiklik açıklar.
Bu yaklaşım, proteaz sindirim ve boyut tabanlı filtreleme kullanır. Yöntemin önemli avantajı bir hücre oldukça saf nüfusu gen ekspresyonu ya da birkaç gün sonra izole işlevsel bir hücre davranış çalışma sağlayan pasaj kültür gerek kalmadan elde edilebilir olmasıdır. Bu teknik aynı zamanda sağlıklı ve hastalıklı hem karaciğerleri hücreleri izole etmek için bir potansiyel sunmaktadır.
Bu protokolün en önemli adımlardan biri, karaciğer parankiminin enzimatik sindirimi olduğunu. Başarılı bir sindirim sağlamak için, ilk perfu sırasında kan tamamen karaciğer boşaltılır onaylamak için önemlidirHatta karaciğer orada haşlama emin yaparak umulmaktadır. Bunu kolaylaştırmak için, perfüze hafifçe karaciğer masaj pamuklu çubuk kullanmak mümkündür. Canlı hücreler düşük verim karaciğer parankimi sonuçlarının Aşırı sindirim, altı sindirimi zor safra gelen karaciğer parankimi ayırmak için yapacak ise. Pronaz hazırlıkları farklı partiler, kullanılan miktarın optimizasyonu arasındaki enzimatik aktivite değişkenlik olduğundan canlı hücreler, verimleri düşük olduğunda gerekli olabilir.
Bu protokol, portal ven kanüle için daha küçük bir göstergesi IV kateter kullanarak fare karaciğer ya da genç sıçan karaciğer portal fibroblastlar izole hayvan ağırlığı ile orantılı olarak perfüzyon çözümler hacmini azaltarak ve yaklaşık 10 karaciğer perfüzyon oranının azaltılması için modifiye edilebilir ml / dak.
Kültür Portal fibroblastlar gibi α-SMA ex kanıtladığı, 10-14 gün içinde miyofibroblastik farklılaşma tabipression 9. Çeşitli belirteçler fibulin-2 de dahil olmak üzere karaciğer hücreleri stellat, IL-6, elastin, gelen portal fibroblastlar ayırt etmek için kullanılmış olan nükleosit trifosfat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 ve böyle sinaptofizin 2, 6, 10, 11 gibi nöronal protein . Bu portal fibroblastlar birkaç gün sonra, kültürün 9 geçirdikten sonra NTPDase2 kaybolur ederken elastin, hatta miyofibroblastik farklılaşma sonra, portal fibroblastlann bir belirteç olduğunu bulduk. Bu nedenle, genellikle elastin için immünofloresan boyama ile portal fibroblastların izolasyonu onaylayın.
Bu tekniğin kısıtlılığı hemen portalı fibroblast izolasyon sonra, Kupffer hücreleri ve safra hücreleri dahil olmak üzere hücre kirleten küçük bir bölümünü orada olmasıdır. Kapı fibroblastlar, saf bir nüfusu (>% 98) 9 veren, ancak, 2-3 gün içinde bu kirletici hücreleri geçmek olacaktır.
Sikültür portalı fibroblast doku kültürü plastik miyofibroblastik farklılaşma geçmesi nce, biz genellikle izolasyon 7 gün içinde bu hücrelerin çalışma. Yöntemleri bölümünde tarif edildiği gibi hücreleri,% 10 fetal sığır serumu içeren portal fibroblast kültür ortamı içinde muhafaza edilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin birkaç gün boyunca% 2 fetal sığır serumu içeren büyüme ortamında koruyacaktır. Biz genellikle izolasyon sonra en az 24 saat kadar düşük serum medya kullanmayın. Portal fibroblastlar miyofibroblastik farklılaşma geçmesi bir kez, onlar birkaç kez pasajlandı ve miyofibroblastların dondurulmuş stok olarak tutulabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R01 DK05823 (RGW için), F32 DK083213 (JWW için), F30 DK081265 (ALO) tarafından ve Fred ve Suzanne Biesecker Pediatrik Karaciğer Merkezi (RGW için) bir hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
