Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

नमूने की तैयारी Published: September 3, 2012 doi: 10.3791/3673
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln

Summary

के metabolomic प्रोफाइल

Protocol

1. प्रोटोकॉल पाठ

इस प्रोटोकॉल एनएमआर पद्धति के एम. के लिए adaption पर प्रकाश डाला गया तपेदिक (तीसरी कक्षा एजेंट). इसलिए, जैवसुरक्षा स्तर 3 (BSL3) प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए जब एम. का आयोजन तपेदिक एक सालाना प्रमाणित प्रयोगशाला में अनुसंधान. प्रयोगशाला जनित एयरोसौल्ज़ एक्सपोजर सबसे महत्वपूर्ण खतरा इन सूक्ष्मजीवों के साथ काम कर रहे कर्मियों द्वारा सामना करना पड़ा है. निम्नलिखित प्रक्रियाओं हमारे संस्थान में आयोजित की जाती हैं और बदलाव संस्थागत जैवसुरक्षा समिति की सिफारिशों के आधार पर मौजूद हो सकता है. आम कर्मियों सुरक्षा उपकरण एक Tyvek सूट, bouffant टोपी, booties, N95 श्वासयंत्र, नेत्र संरक्षण, आस्तीन, और nitrile दस्ताने के एक डबल जोड़ी से मिलकर करेंगे. एम. से जुड़े काम तपेदिक संस्कृतियों और / खुला एम. के साथ या जोड़तोड़ तपेदिक कंटेनरों प्रकार A2 या B2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है. प्लास्टिक से ढके शोषक कागज w पर रखा गया हैसतह orking. सभी सामग्री / आपूर्ति या निपटारा करने के लिए सुविधा से हटा दिया दो Biohazard बैग में रखा जाना चाहिए और वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा decontaminated. काम की सतहों और उपकरण कैबिनेट (FastPrep-24 lysis homogenizer, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, बर्फ के साथ बाल्टी, आदि) के भीतर उपयोग 1% Amphyl (tuberculocidal, जीवाणुनाशक, कवकनाशी, और virucidal एजेंट) के साथ हर काम सत्र के बाद कीटाणुरहित किया जाना चाहिए एम.. तपेदिक संस्कृतियों परिवहन के लिए डबल रोकथाम के तहत बड़ा फ्रीजर, इन्क्यूबेटरों, centrifuges, और रेफ्रिजरेटर जैसे जैविक सुरक्षा कैबिनेट के बाहर स्थित उपकरणों के लिए रखा जाना चाहिए. केन्द्रापसारण संलग्न सुरक्षा कप और O-अंगूठी पेंच शीर्ष ट्यूब के साथ आयोजित किया जाता है. आगे के विश्लेषण के लिए BSL3 प्रयोगशाला के बाहर, एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर या सूक्ष्मजीवों गर्मी में मारे गए 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के माध्यम से सेल मुक्त निष्कर्षों फ़िल्टर्ड रहे हैं 2 नमूने कॉलोनी के गठन इकाइयों के अभाव रोकथाम से हटाने के लिए पहले से सत्यापित करने के लिए चढ़ाया.

  1. Middlebrook 7H9 पूरा 80 polysorbate (80 Tween रोकने) वाले मीडिया के 110 मिलीग्राम (MADC TW) शोरबा या 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए एक उपयुक्त माध्यम है. स्थानांतरण तीन प्रतियों संस्कृतियों नियमित हालत के प्रति बड़े हो रहे हैं जब 13 का उपयोग करते हुए सी मेटाबोलाइट्स, और दस समान संस्कृतियों 1D 1 एच एनएमआर रूपरेखा के लिए बड़े हो रहे हैं. दो शर्तों (जैसे, के साथ और बिना दवा के अलावा), दोहराने प्रति संस्कृति की डबल मात्रा और विकसित किया जा सकता है और दो ​​समान संस्कृतियों में विभाजित है. सभी अभिकर्मक और समाधान व्यंजनों प्रोटोकॉल के अंत में प्रदान की जाती हैं.
  2. एम. की 0.150 मिलीग्राम के साथ शोरबा टीका लगाना तपेदिक 50% ग्लिसरॉल स्टॉक (बर्फ पर पिघलना करने के लिए करने की अनुमति देते हैं). 1 से नीचे नोट मिलते हैं.
  3. संस्कृति 37 में विकसित ° C लगभग 6 दिनों (600 0.6-.8 आयुध डिपो) के लिए 100 rpm पर मिलाते हुए. 2 नीचे ध्यान दें.
  4. यदि कोई एंटीबायोटिक दवाओं, वैकल्पिक परिवर्धन या अन्य उपचार की जरूरत है, संस्कृतियों को काटा जा सकता है के लिए तैयार कर रहे हैं. यदि उपचार का उपयोग किया जाता है जारी,सीधे 5 चरण. संदूषण परीक्षण प्ररूपी विश्लेषण, पीसीआर परीक्षण: प्रत्येक कुप्पी से एक 0.5 मिलीलीटर नमूना निकालें, एक microcentrifuge ट्यूब और 4 में जगह ° सी संस्कृति अनुमापन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए स्थानांतरण. 3 नीचे नोट मिलते हैं. इस बिंदु पर, 6 कदम आगे बढ़ना.
  5. बोतल हिलनेवाला से निकालें और वांछित उपचार (जैसे, दवा या metabolite जोड़ने) का प्रदर्शन. प्लेस हिलनेवाला और सेते में वापस एक अतिरिक्त अवधि (जैसे, 6-18 घंटा) के लिए बोतल. इस बार के अंत में एक और 1.0 मिलीग्राम अशेष भाजक लेने के लिए और आयुध डिपो निर्धारित करने के लिए 600. प्रत्येक कुप्पी से एक 0.5 मिलीलीटर नमूना निकालें, एक microcentrifuge ट्यूब और 4 में जगह ° सी संस्कृति अनुमापन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए करने के लिए स्थानांतरण.
  6. 5 मिनट के लिए जगह बर्फ पर संस्कृतियों. इस कदम के बाद, पूरे शेष प्रोटोकॉल भर बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़. Centrifugation द्वारा XG 2000 और 4 में हार्वेस्ट संस्कृतियों ° C 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक benchtop अपकेंद्रित्र का उपयोग 15 मिनट के लिए. प्रत्येक संस्कृति 25 मिलीलीटर (1 के एक कुल के साथ चार ट्यूबों की आवश्यकता होगी00 मिलीलीटर के लिए 1 2 डी के लिए पर्याप्त संकेत करने के लिए शोर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है एच 13 सी एनएमआर प्रयोगों,) जहां संस्कृति के प्रति केवल 50 मिलीग्राम 1D 1 एच एनएमआर प्रयोगों के लिए आवश्यक है.
  7. प्रत्येक कोशिका गोली centrifugation ऊपर वर्णित मानकों द्वारा ठंडा DDH 2 (लगभग 15 मिलीलीटर पहली बार और 2 बार 10 मिलीलीटर) हे के साथ दो बार धोएं. 2 धोने के लिए, एक ही ट्यूब में कताई से पहले 10 मिलीलीटर aliquots गठबंधन. 1.0 मिलीलीटर DDH 2 ओ (सेल गोली मात्रा के लिए समायोजित करने की जरूरत है) की एक अंतिम मात्रा में सेल गोली Resuspend. यदि एक एकल कोशिका निलंबन clumping से मुक्त इस कदम पर वांछित है, कोशिकाओं संक्षिप्त होने और sonicated कर सकते हैं / या तीन बार एक 27 गेज सुई के माध्यम से पारित कर दिया. वैकल्पिक रूप से, सेल गोली -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है और जब तक आगे प्रसंस्करण संग्रहीत. उत्तरार्द्ध मामले में, जमे हुए छर्रों resuspension करने से पहले बर्फ पर thawed हैं. 1.0 मिलीलीटर DDH 2 हे की एक अंतिम मात्रा जैसा कि ऊपर कहा गया है में सेल छर्रों Resuspend.
  8. Transfeएक 2.0 मिलीलीटर पेंच टोपी lysing मैट्रिक्स बी (0.1 मिमी सिलिका क्षेत्रों) युक्त ट्यूब r 1.0 मिलीलीटर सेल निलंबन. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर FastPrep-24 lysis homogenizer रखें. नमूना धारक में नमूने रखो, हासिल प्रतिधारण ट्यूब के शीर्ष पर थाली बात की. Homogenizer में 6 मीटर / सेकंड की गति सेटिंग में 60 सेकंड के लिए नमूने की प्रक्रिया.
  9. एक microcentrifuge में XG +१५,००० और 4 पर नमूने स्पिन ° C 10 मिनट के लिए गोली सेल मलबे और कोशिकाओं बरकरार.
  10. एक सिरिंज फिल्टर (0.2 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से एक बाँझ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और पास नमूना निकालें. प्लेट नमूना के 0.1 (MADC अगर पर या नमूने के एक प्रतिनिधि के रूप में, उदाहरण के लिए, 10% अंश मिलीलीटर) को सत्यापित करने के लिए है कि वहाँ कोई व्यवहार्य कोशिकाओं रहे हैं. जांचकर्ता भी एक से अधिक निस्पंदन कदम का संचालन कर सकते हैं और / या रहते मृत धुंधला हो जाना प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए रोकने के लिए या किसी भी संभावित जैव सुरक्षा चिंताओं की पहचान के अर्क में व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि. स्टोर करने के लिए के लिए एक इथेनॉल सूखी बर्फ स्नान में नमूने रुक-80 डिग्री सेल्सियस जब तक वे lyophilized और एक एनएमआर सुविधा में संसाधित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं.
  11. 2 महीने के बाद, प्लेटें जांच कॉलोनी बनाने इकाइयों के अभाव को सत्यापित करने के लिए. यदि कोई CFU पाए जाते हैं, नमूने BSL3 प्रयोगशाला के बाहर हो लिया जा सकता है. आगे के विश्लेषण से एक मानक एनएमआर सुविधा है, जो आम तौर पर बहु ​​उपयोगकर्ताओं में कार्य करता है और कोई विशेष नियंत्रण आवश्यकताओं के तहत चल रही है में किया जाता है.
  12. सूखापन नमूने Lyophilize, तो एनएमआर बफर और एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण के 0.7 मिलीलीटर में resuspend. 13,000 x जी में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. 0.6 मिलीग्राम और 5 मिमी एनएमआर ट्यूब को हस्तांतरण निकालें. वैकल्पिक रूप से, lyophilized नमूने गैर biohazardous नियमित रूप से नमूने के रूप में एक बाहरी की सुविधा के लिए भेज दिया जा सकता है.
  13. एनएमआर डेटा तुरंत एकत्र किया जा रहा है. सभी सावधानियों के बावजूद, सक्रिय एंजाइमों अभी भी मौजूद हो सकता है और नमूना समय की लंबी अवधि के लिए आम तौर पर स्थिर नहीं है. एनएमआर स्पेक्ट्रम में परिवर्तन नजर जब नमूने बाहर कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर मीटर के लिए छोड़ दिया जाता है1 सप्ताह से अयस्क. इसके अलावा, एनएमआर डेटा संग्रह इलाज और दवा इलाज संस्कृतियों, जहां नमूने बेतरतीब ढंग से प्रत्येक वर्ग से चयन कर रहे हैं के बीच alternated है. यह अनावश्यक पूर्वाग्रह रोकता है क्योंकि एक विशेष श्रेणी में एक लंबी देरी था इससे पहले एनएमआर स्पेक्ट्रा एकत्र किए गए थे. डेटा में एक पूर्वाग्रह अगर अनुपचारित सभी नमूनों के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रा 1 एकत्र किए गए थे, और फिर दवा इलाज के नमूने द्वारा पीछा किया हो जाएगा. यदि नमूने तुरंत एनएमआर द्वारा विश्लेषण किया जा करने में असमर्थ हैं, नमूने -80 डिग्री सेल्सियस में 1 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में संग्रहित किया जाना चाहिए
  14. BACS-120 नमूना परिवर्तक, अंशांकन उपकरण, जो ताला, शिम, धुन, और 90 ° पल्स लंबाई का अनुकूलन के रूप में इस तरह के कुछ दिनचर्या कदम शामिल है में नमूने डालने के बाद परिणामों की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है. एक नमूना 90 ° पल्स लंबाई जांच और शेष के नमूने के लिए साधन धुन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ताला, shimming, और हर नमूना के लिए एनएमआर डेटा संग्रह स्वचालित usinछ ICONNMR और gradshim.
  15. एक 1D 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम पानी का उपयोग कर दमन उत्तेजना sculpting के साथ Bruker zgesgp पल्स अनुक्रम का उपयोग कर एकत्र की है. 32k डेटा 5482.5Hz के एक झाड़ू चौड़ाई के साथ अंक, 128 स्कैन, और 16 डमी स्कैन की कुल किया जाता है. एक 2 डी एच 1 सी 13-HSQC स्पेक्ट्रम Bruker hsqcetgp पल्स अनुक्रम का उपयोग कर एकत्र की है. 5000.0 हर्ट्ज की एक झाड़ू चौड़ाई के साथ 2048 में डेटा बिंदुओं की कुल प्रत्यक्ष 1 एच आयाम के साथ एकत्र किया जाता है, और अप्रत्यक्ष 13 सी आयाम के साथ 18864.9 हर्ट्ज की एक झाड़ू चौड़ाई के साथ 64 अंक डेटा. शोर करने के लिए अच्छा संकेत प्राप्त स्पेक्ट्रम 128 स्कैन और 16 डमी स्कैन के साथ एकत्र किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के प्रवाह आरेख दर्शाया जाता है.

एनएमआर बफर

50 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट शौकीन के स्टॉक समाधानएर 50 सुक्ष्ममापी TMSP के साथ:

  • 2.17 जी 2 कश्मीर HPO 4 (पोटेशियम फॉस्फेट dibasic)
  • 1.70 छ 2 KH पीओ 4 (पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार का)
  • 7.86 मिलीग्राम सोडियम-3-Trimethylsilylpropionate (,2,3,3 - डी 4 (डी, 98%) TMSP-2)
  • "100%" डी 2 हे की 500 मिलीलीटर में भंग
  • अंतिम समाधान के लिए एक 7.2 पीएच (uncorrected) में होना चाहिए

MADC TW या MOADC TW (1 एल)

  • 4.7 जी Middlebrook 7H9 शोरबा आधार
  • 900 मिलीलीटर DDH 2 हे
  • 2 मिलीलीटर ग्लिसरॉल
  • 25 मिनट के लिए और घटकों आटोक्लेव मिश्रण. कूल को छूने और निम्न समाधानों को जोड़ने तरल:
  • 100 मिलीलीटर एडीसी जब MADC या 100 मिलीलीटर OADC की तैयारी जब MOADC की तैयारी
  • 2.5 मिलीलीटर 20% 80 (वैकल्पिक रूप से, गैर metabolizable 20% Tyloxapol की 1 मिलीग्राम) Tween
  • 10 मिलीलीटर 1% cycloheximide

एडीसी (1 एल)

  • 20 ग्राम (+) ग्लूकोज डी
  • 50 छ BSA भिन्नवी
  • 8.5 छ NaCl
  • 800 मिलीलीटर DDH 2 हे
  • एक साथ भंग, मात्रा 1 एल समायोजित और 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ बाँझ. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

वैकल्पिक रूप से, OADC (1L) तैयार करने के लिए, प्लस 1% oleic एसिड (नीचे नुस्खा एक 250 मिलीलीटर बैच बनाता है) के 50 मिलीलीटर ऊपर सूचीबद्ध सभी घटकों को जोड़ने. एक साथ भंग, मात्रा 1 एल समायोजित और 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ बाँझ. बोतल एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान में 4 डिग्री सेल्सियस पर लपेटा जा जरूरत

  • 2.5 ग्राम oleic एसिड
  • 250 मिलीलीटर NaOH 0.2M
  • Thaw हीटिंग द्वारा oleic प्रशीतन पर solidifies 55 ° एसिड 10 मिनट और 60 मिनट के लिए सरगर्मी के साथ NaOH समाधान और गर्मी जोड़ने के लिए सी. बाँझ कांच की बोतलें कि एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाता है में स्टोर. 4 parafilm और दुकान के साथ सील की बोतलें ° सी.

अगर पसंद है, तो आप catalase संवर्धन के साथ वाणिज्यिक BD BBL Middlebrook एडीसी या OADC खरीद सकते हैं.

1% Cycloheximide (100ml)

  • 1 ग्राम cycloheximide
  • 100 मिलीलीटर DDH 2 हे

भंग और 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ बाँझ. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सावधानी: cycloheximide विषाक्त इतना चरम देखभाल के साथ संभाल.

20 (v / v)% बीच 80 (100ml)

  • 20 मिलीलीटर बीच 80
  • 80 मिलीलीटर DDH 2 हे

वैकल्पिक रूप से, 80 बीच के 20 ग्राम (लगभग 18.9 मिलीग्राम, 1.06 मिलीग्राम / छ घनत्व) तौलना, 20% समाधान w / v तैयार. 55 के लिए हीट समाधान ° C 30 मिनट को भंग करने और पूरी तरह से मिश्रण के लिए. एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ तरल जीवाणुरहित. स्टोर कमरे के तापमान पर अंतिम समाधान.

20% (v / v) Tyloxapol (100ml)

  • 20 मिलीलीटर Tyloxapol
  • 80 मिलीलीटर DDH 2 हे

वैकल्पिक रूप से, Tyloxapol के 20 ग्राम (18.2 लगभग मिलीलीटर, घनत्व 1.1 ग्राम / एमएल) तौलना, 20% समाधान w / v तैयार. आपदाओं को 30 मिनट के लिए गर्मी से 55 डिग्री सेल्सियस तक समाधानssolve, और पूरी तरह से मिश्रण. एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ तरल जीवाणुरहित. स्टोर कमरे के तापमान पर अंतिम समाधान.

1 नोट: एम. के ग्लिसरॉल स्टॉक तपेदिक निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं.

एम. के मोजा यक्ष्मा

  • एम. आगे बढ़ें 50 मिलीलीटर MADC में संतृप्ति के लिए तपेदिक (600 आयुध डिपो = 1.5 2.0) में 37 ° मिलाते शर्तों (100 rpm) के तहत सी. तनाव के आधार पर 7-14 दिन, इस ले जाएगा.
  • 2000 XG पर नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए गोली संस्कृति स्पिन. तैरनेवाला निकालें.
  • बाँझ 50% ग्लिसरॉल के 6 मिलीलीटर में Resuspend.
  • अशेष भाजक 4 Corning क्रायोजेनिक शीशियों और लेबल उचित में 1.5 मिलीग्राम.
  • तुरंत -80 पर फ्लैश इथेनॉल / सूखी बर्फ स्नान और दुकान में फ्रीज शीशियों डिग्री सेल्सियस

नोट 2: inoculating तनाव H37Rv (-80 डिग्री सेल्सियस से 15 साल तक की उम्र के शेयर) MADC मीडिया के 70 मिलीलीटर में एक आयुध डिपो पैदावार 600 </ 0.6 के बारे में विकास की एक इनोवा शेखर 40 में मिलाते शर्तों (100 rpm) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 दिनों के बाद उप>.

3 नोट: संस्कृति संदूषण का परीक्षण करने के लिए, जांचकर्ताओं मानक समृद्ध माध्यम पर संस्कृति अशेष भाजक टीका लगाना और रातोंरात ऊष्मायन के बाद विकास की अनुपस्थिति की पुष्टि कर सकता है. नियमित, संस्कृतियों MADC अगर कॉलोनी आकारिकी का निरीक्षण करने के लिए और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच पर चढ़ाया जाता है. अगर वांछित, संस्कृतियों पीसीआर का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है 6110 प्राइमरों के रूप में वर्णित 3.

2. प्रतिनिधि परिणाम

एक नमूना है कि अच्छी तरह से तैयार है एक एनएमआर चित्रा 2 में दिखाया गया एक समान स्पेक्ट्रम निकलेगा. यह स्पेक्ट्रम एम. के एक प्रतिनिधित्व है तपेदिक जंगली प्रकार चयापचय पूल. पहचान चयापचयों D-alanine मार्ग के साथ प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से जुड़े रहे हैं. इसके अलावा, शिखर तीव्रता के परिमाण metabolite सांद्रता के लिए आनुपातिक है वर्तमानसेल निकालने में. इसलिए इलाज संस्कृतियों, नशीली दवाओं के उपचार, और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच शिखर तीव्रता में परिवर्तन चयापचयों और चयापचय मार्ग में perturbations का संकेत कर सकते हैं. एम. तपेदिक 1D 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा Bruker एवेंस 500 मेगाहर्ट्ज एक ट्रिपल गूंज, ढाल Z-अक्ष किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र के साथ लैस स्पेक्ट्रोमीटर पर एकत्र किए गए. स्पेक्ट्रम ca शामिल हैं. 400 चोटियों, जिसमें से यह संभव हो गया था की पहचान करने और 40-50 मेटाबोलाइट्स, अमीनो एसिड, न्यूक्लियोटाइड व्यापारियों, और glycolytic और साइट्रिक एसिड मध्यवर्ती सहित यों. Bruker चिह्न सॉफ्टवेयर के साथ एक BACS-120 नमूना परिवर्तक एनएमआर डेटा संग्रह को स्वचालित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Opls 1D 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा उत्तेजना 4 sculpting का उपयोग करने के लिए कुशलतापूर्वक हटाने विलायक और एक फ्लैट आधारभूत बनाए रखने के लिए, आधारभूत संग्रह के लिए किसी की जरूरत है कि बाद में प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) या ​​orthogonal कम से कम आंशिक वर्गों discriminant विश्लेषण में कलाकृतियों उत्पन्न हो सकता है को नष्ट करने (एकत्र किए गए थे - ) दा. एक 1डी एच 1 एनएमआर स्पेक्ट्रम में 5482.5 हर्ट्ज और 32K डेटा बिंदुओं की एक स्पेक्ट्रम चौड़ाई के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किया जाता है. 16 डमी स्कैन और 128 स्कैन की कुल स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया. एसीडी लैब्स 1D एनएमआर प्रोसेसर सॉफ्टवेयर अर्द्ध स्वचालित रूप से सभी 1D 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा की प्रक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्पेक्ट्रा थे फूरियर तब्दील, चरणबद्ध और TMSP शिखर (0.0 पीपीएम) संदर्भित. NMRpipe सॉफ्टवेयर पैकेज के लिए व्यक्तिगत रूप से 2 डी एच 1 - 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा प्रक्रिया में इस्तेमाल किया गया था और विश्लेषण के साथ NMRDraw. Bruker खूंटी डेटा फ़ाइल पहले एक फ़ाइल NMRpipe से पहचानने योग्य प्रारूप में परिवर्तित कर दिया गया और फिर स्पेक्ट्रम फूरियर तब्दील हो गया था, चरण सही, और शून्य भरा. 1D 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम और 2 डी एच 1-13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम में मनाया एनएमआर चोटियों विशिष्ट चयापचयों का उपयोग कर एच 1 और 0.05 और 0.50 पीपीएम, क्रमशः के 13 सी रासायनिक बदलाव tolerances है, और मैडिसन Metabolomics कंसोर्टियम डेटाबेस (MMCD को सौंपा जाता है ) 6 और मानव metabolome धन्यवाद पृष्ठ 7 विशेष रूप से, 1D और 2d एनएमआर स्पेक्ट्रा मैन्युअल चोटी उठाया, जहां एनएमआर रासायनिक पारियों में से एक शिखर सूची तो मानव metabolome डाटाबेस के लिए अपलोड की गई है. मानव metabolome डेटाबेस द्वारा पहचान चयापचयों एनएमआर एनएमआर अनुनादों मिलान और एक चयापचय नेटवर्क के लिए संबंधित की संख्या को अधिकतम दोनों पर आधारित स्पेक्ट्रम के लिए आवंटित कर रहे हैं. प्रत्येक परिसर या metabolite आम तौर पर कई CH जोड़े और तदनुसार कई एनएमआर अनुनादों है. इस प्रकार, इन एनएमआर अनुनादों है कि प्रायोगिक एनएमआर स्पेक्ट्रम में मनाया जाता है, और अधिक होने की संभावना metabolite मौजूद है. इसी तरह, कई एक ही मार्ग के साथ सहयोगी चयापचयों की पहचान सही कार्य की संभावना बढ़ जाती है. चयापचयों और चयापचय मार्ग की उपस्थिति जीन और (KEGG) जीनोम 8 के क्योटो विश्वकोश और MetaCyc डेटाबेस के साथ सत्यापित कर रहे हैं 9 माइकोबैक्टीरियम smegm.Atis एम. के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली है तपेदिक और अन्य mycobacterial रोगज़नक़ों. जैसा कि कहीं वर्णित एम. के नमूने smegmatis भी sonication द्वारा बाधित किया जा सकता है 10.

चित्रा 2
चित्रा 2 1D माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग सेल निकालने के 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम. एनएमआर प्रतिनिधि चयापचयों के साथ जुड़े चोटियों में चिह्नित कर रहे हैं. लघुरूप निम्नलिखित हैं: एएमपी, एडेनोसाइन मोनो फॉस्फेट, α किलो, α-ketoglutarate, Glu, ग्लूटामेट, और आला, alanine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अध्ययन का एक महत्वपूर्ण संख्या एम. transcriptomic प्रोटिओमिक और प्रोफाइल का विश्लेषण किया है इन विट्रो में और vivo परिस्थितियों में की एक किस्म के तहत तपेदिक 11-16 अंततः, जीन अभिव्यक्ति और एंजाइम गतिविधि में परिवर्तन छोटे आणविक वजन अणुओं की सांद्रता में बदलाव के लिए नेतृत्व. इन यौगिकों का पूरा विवरण metabolome का गठन किया. इस प्रकार, दवाओं और चयापचय मार्ग पर अलग विकास की स्थिति के प्रभाव metabolomic विश्लेषण द्वारा पीछा किया जा सकता है 17,18 कुछ अध्ययनों से इस पद्धति का लाभ ले लिया एम. में चयापचय मार्ग का अध्ययन. (नीचे देखें) तपेदिक और अन्य माइक्रोबैक्टीरिया, या एम. से संक्रमित चूहों में चयापचय परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए तपेदिक. 19

इस पद्धति की एक संभावित ख़तरा है कि नमूने में कुछ सूक्ष्मजीवों पूरी तरह से नहीं किया जा lysed हो सकता है. यदि आवश्यक हो, lysis कदम दोहराया जा सकता है यादो बार. Lysis दक्षता एक मानक प्रोटीन परख (जैसे, BioRad डीसी प्रोटीन परख) प्रदर्शन द्वारा नजर रखी जा सकती है. कम मात्रा में मौजूद चयापचयों का पता लगाने के लिए की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, कई समान नमूने (8 कदम पर एकत्र) जमा किया जा सकता है lyophilized, और एक कम मात्रा में resuspended.

माइक्रोबैक्टीरिया में metabolomic अध्ययन के लिए वैकल्पिक नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में वर्णित किया गया है. उदाहरणों में शामिल हैं, sonication द्वारा सेल व्यवधान, 10,20 मनका की धड़कन, 20 और Zirconia 21 मोतियों के साथ homogenization. इसी तरह, निष्कर्षण प्रक्रियाओं में बदलाव acidified acetonitrile और / या अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स का इस्तेमाल किया है 20,22-24 metabolite पहचान भी गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी - एमएस) सहित विभिन्न विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं, 24 तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा हासिल किया गया है. द्रव्यमान (LC-एमएस) स्पेक्ट्रोमेट्री, 21,23 और रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल chro(आर.पी. HPLC) matography 25 चयापचयों की एक सीमित संख्या और भी पहचान की गई प्रत्यक्ष enzymatic determinations द्वारा मात्रा. 26 हालांकि कुल माइक्रोबैक्टीरिया की साइटोसोलिक निष्कर्षों में उम्मीद चयापचयों की संख्या अनजान बनी हुई है, 22 यह नोट किया है कि 1692 चयापचयों बेसिलस में पहचान की गई केशिका electrophoresis और एमएस द्वारा अर्क subtilis 27.

महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक पहचान और मात्रा का ठहराव प्रक्रियाओं से संबंधित मुद्दों Metz एट अल द्वारा समीक्षा की गई है एनएमआर प्रौद्योगिकी के 28 लाभ नमूना तैयार करने में आसानी और प्रक्रिया के गैर विनाशकारी प्रकृति शामिल हैं. हालांकि, यौगिक पहचान के लिए उपलब्ध स्पेक्ट्रा, हालांकि कभी विस्तार के डेटाबेस अभी भी पूर्ण metabolite पहचान के लिए अपर्याप्त हैं. जीसी - एमएस और LC-एमएस के तरीके और अधिक व्यापक नमूना तैयार करने की प्रक्रिया की आवश्यकता होती है और अधिक से अधिक परिवर्तनशीलता है हो सकता है, यह मुश्किल resul की तुलना करने के लिए कर रही हैविभिन्न प्रयोगशालाओं से टीएस. इसके अलावा, जीसी - एमएस metabolite derivatization सामग्री में एक परिणामी हानि कि कम सटीक मात्रा का ठहराव के लिए सुराग के साथ की आवश्यकता है. Separations सुधार और LC-एमएस में ionization दमन को खत्म करने के तरीके के लिए इनमें से कुछ समस्याओं पर काबू पाने के लिए वादा करता हूँ. बहरहाल, हमारी राय में, इस कमी अभी भी निकट भविष्य में एक महत्वपूर्ण मुद्दा रहेगा. इसके अलावा, एनएमआर के तरीके 2D HSQC, 2 डी जम्मू हल और STOCSY प्रयोगों के रूप में पहले से ही वृद्धि हुई है और metabolite पहचान में दक्षता सटीकता में जिसके परिणामस्वरूप रहे हैं 29. फिर भी, एनएमआर और LC-एमएस प्रक्रियाओं पूरक प्रक्रियाएं हैं और एक संयुक्त विश्लेषण में एकीकृत होने की संभावना है एक सिस्टम metabolome 28.

नमूना तैयार करने की प्रक्रिया यहाँ वर्णित, बफर सिस्टम और कदम के उचित संशोधनों के साथ lysis FastPrep-24 के बाद, प्रोटिओमिक विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, के रूप में कहीं वर्णित 30 इस प्रकार, तपेदिक researchers जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती प्रक्रियाओं है कि संयुक्त प्रणाली जीव विज्ञान दृष्टिकोण धरना का उपयोग करने की स्थिति की एक किस्म के तहत हो उपभेदों से नमूनों का विश्लेषण 31 इन प्रौद्योगिकियों. एम. के केंद्रीय चयापचय मार्गों टुकड़े करना अपरिहार्य साबित करना चाहिए तपेदिक, 32 समझ जिनमें से विलंबता के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, और बेहतर टीके और antimycobacterial एजेंट को विकसित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह तत्काल जरूरत है, नियंत्रण और एमडीआर और XDR तपेदिक के उपचार के संदर्भ में विशेष रूप से 33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए उपयोगी टिप्पणी के लिए डा. Barletta और डॉ. पॉवर्स की प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद करते हुए प्रोटोकॉल विकासशील करना चाहते हैं. हम पांडुलिपि के सहायक और विचार विमर्श proofreading के लिए वेंडी ऑस्टिन धन्यवाद. प्रत्येक नेब्रास्का - लिंकन Redox जीवविज्ञान केंद्र (मूल अनुदान # NCRR 2P20RR 017675, डी. बेकर, पीआई) के विश्वविद्यालय से ऊपर सूचीबद्ध अन्वेषक इस पांडुलिपि में वर्णित काम बीज पायलट अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. इसके अलावा, हम उसे R21 अनुदान (1R21AI087561 01A1) से अनुसंधान आपूर्ति और श्री Halouska आंशिक वेतन के इस प्रकाशन में शामिल एनएमआर तकनीक मानकीकृत समर्थन के लिए धन उपलब्ध कराने के लिए डॉ. Ofelia Chacon धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Tags

संक्रमण अंक 67, एनएमआर Metabolomics homogenizer lysis सेल के अर्क नमूना तैयार
नमूने की तैयारी<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; परमाणु चुंबकीय अनुनाद metabolomic अध्ययन के लिए अर्क
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zinniel, D. K., Fenton, R. J.,… More

Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter