Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحضير العينة من Published: September 3, 2012 doi: 10.3791/3673
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln

Summary

الملف الشخصى metabolomic من

Abstract

المتفطرة السلية هو السبب الرئيسي للوفيات في البشر على نطاق عالمي. ظهور متعددة على حد سواء (MDR)، وعلى نطاق واسع-(XDR) سلالات مقاومة للعقاقير تهدد بعرقلة الجهود الحالية لمكافحة الأمراض. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير أدوية واللقاحات التي هي أكثر فعالية من تلك المتاحة حاليا. جينوم M. وقد عرف السل لأكثر من 10 سنوات، ولكن هناك ثغرات هامة في معرفتنا وظيفة الجين والإستخدامات الأساسية. وقد استخدمت العديد من الدراسات منذ الجين التعبير التحليل على الصعيدين transcriptomic والبروتين لتحديد آثار المخدرات، تأكسد، وظروف النمو على الأنماط العالمية في التعبير الجيني. في نهاية المطاف، ينعكس الرد النهائي من هذه التغييرات في تكوين التمثيل الغذائي للبكتيريا بما في ذلك المواد الكيميائية ألف قليل الوزن الجزيئي. مقارنة ملامح التمثيل الغذائي من النوع البري وسلالات متحولة، إما غير المعالجة أو آرeated مع دواء معين، يمكن أن تسمح تحديد الهدف بشكل فعال وربما يؤدي إلى تطوير مثبطات الرواية المضادة للنشاط السل. وبالمثل، يمكن أيضا آثار اثنين أو أكثر من الظروف على أن metabolome المقررة. الرنين النووي المغناطيسي (NMR) هي تقنية قوية التي يتم استخدامها لتحديد وقياس وسيطة الأيض. في هذا البروتوكول والإجراءات لإعداد M. ويرد وصف مقتطفات خلية للتحليل السل metabolomic NMR. تزرع مزارع الخلايا تحت الظروف المناسبة والمطلوبة للسلامة الأحيائية مستوى الاحتواء 3، 1 المقطوع، وتعرض للتحلل الميكانيكية مع الحفاظ على درجات الحرارة الباردة لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ الأيضات. يتم استرداد لست] الخلية، التي تمت تصفيتها تعقيمها، وتخزينها في درجات حرارة منخفضة للغاية. ومطلي مأخوذة من هذه المقتطفات الخلية على أجار Middlebrook 7H9 لتشكيل مستعمرة وحدة للتحقق من عدم وجود خلايا قابلة للحياة. على شهرين من الحضانة عند 37 درجة مئوية، إذا لم السادسويلاحظ المستعمرات قادرة، تتم إزالة عينات من منشأة الاحتواء للالتجهيز النهائي. ومجفف بالتجميد مقتطفات، معلق في المخزن المؤقت بالديوتيريوم وحقن في الصك NMR، التقاط البيانات الطيفية التي يتعرض بعد ذلك إلى التحليل الإحصائي. ويمكن تطبيق الإجراءات الموضحة لكلا أحادية البعد (1D) NMR H 1 وثنائية الأبعاد (2D) 1 H-13 C NMR التحليلات. هذه المنهجية توفر أكثر موثوقية الصغيرة تحديد الوزن الجزيئي المستقلب والتحليلات الكمية وأكثر موثوقية من التراكيب الحساسة استخراج الخلايا من الطرق الأيضية الكروماتوغرافي. ويمكن أيضا أشكال مختلفة من الإجراءات الموصوفة في أعقاب خطوة تحلل الخلية تكييفها لتحليل البروتين موازية.

Protocol

1. بروتوكول النص

هذا البروتوكول يسلط الضوء على التكيف منهجية NMR لM. السل (الدرجة الثالثة الوكيل). ولذلك، السلامة الأحيائية المستوى 3 (BSL3) الممارسات ينبغي اتباعها عند إجراء M. بحوث السل في مختبر معتمد سنويا. التعرض للمختبر ولدت الهباء الجوي هو الخطر الأكثر أهمية التي يواجهها الأفراد العمل مع هذه الكائنات الحية الدقيقة. وتجرى الإجراءات التالية في مؤسستنا وقد توجد اختلافات تستند على توصيات اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية. الموظفين المشتركة ومعدات الوقاية تتكون من دعوى تايفك، وكأب منتفخ، والجوارب، N95 التنفس، وحماية العين، والأكمام، وزوج من القفازات المزدوج النتريل. العمل التي تنطوي على M. الثقافات السل و / أو التلاعب مع M. مفتوحة يتم تنفيذ السل الحاويات في A2 نوع B2 أو مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. يتم وضع البلاستيك المغطاة ورقة ماصة على Working السطح. يجب وضع جميع المواد / اللوازم المراد التخلص منها أو إزالتها من منشأة في كيسين واقية من تطهير التعقيم. يجب تطهير الأسطح والمعدات المستخدمة العمل داخل مجلس الوزراء (FastPrep-24 الخالط تحلل، طيفي، دلو مع الثلج، وما إلى ذلك) بعد كل جلسة عمل مع Amphyl 1٪ (مبيد للعصيات السلية، وكيل مبيد للجراثيم، فطريات، ومبيد للفيروس). M. يجب أن توضع تحت احتواء الثقافات السل مزدوجة لنقل المعدات إلى أكبر تقع خارج مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مثل الثلاجات وحاضنات، أجهزة الطرد المركزي، والثلاجات. ويجري الطرد المركزي مع أكواب سلامة الأنابيب المغلقة والمسمار يا الدائري العلوي. لمزيد من التحليل خارج المختبر BSL3، يتم تصفية خلية خالية مقتطفات من خلال مرشح ميكرون 0.2 أو الحرارة الكائنات الحية الدقيقة في قتل C ° 95 لمدة 15 دقيقة .. 2 عينات ومطلي للتحقق من عدم وجود مستعمرة تشكيل وحدات إزالة من قبل الاحتواء.

  1. نقل 110 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 7H9 Middlebrook كاملة بوليسوربات 80 (توين 80 لمنع تراكمها) مرق (MADC-TW) أو وسيلة مناسبة لقارورة مخروطي 250 مل. وتزرع بشكل روتيني في حالة الثقافات ثلاث نسخ عند استخدام 13 C-الأيضات، وتزرع الثقافات متطابقة ل10 1D 1 التنميط NMR H. يمكن أن تنمو لشرطين (على سبيل المثال، مع وبدون إضافة المخدرات)، سعة الثقافة المزدوجة في تكرار وتنقسم إلى ثقافتين متطابقة. يتم توفير جميع وصفات وكاشف حل في نهاية البروتوكول.
  2. تطعيم مرق مع 0،150 مل من M. الأسهم السل الجلسرين 50٪ (السماح لذوبان الجليد على الجليد). انظر الملاحظة 1 أدناه.
  3. السماح للثقافة تنمو في 37 ° C تهز عند 100 دورة في الدقيقة لحوالي 6 أيام (OD 600 0،6-0،8). انظر الملاحظة 2 أدناه.
  4. إذا ليست هناك حاجة المضادات الحيوية، والإضافات بديلة أو العلاجات الأخرى، والثقافات جاهزة للحصاد. إذا تم استخدام العلاجات، ومواصلةمباشرة إلى الخطوة 5. إزالة عينة من 0.5 مل كل قارورة، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge ومكان عند 4 درجة مئوية لمدة المعايرة الثقافة ومراقبة الجودة: الاختبارات التلوث، التحليل المظهري، واختبارات PCR. انظر الملاحظة 3 أدناه. عند هذه النقطة، انتقل إلى الخطوة 6.
  5. إزالة من قوارير شاكر وتنفيذ العلاج المطلوب (على سبيل المثال، إضافة المخدرات أو المستقلب). المكان مرة أخرى في قوارير شاكر واحتضان لفترة إضافية (على سبيل المثال، 6-18 ساعة). في نهاية هذا الوقت، وأخذ آخر قسامة مل 1.0 و تحديد OD 600. إزالة عينة من 0.5 مل كل قارورة، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge ومكان عند 4 درجة مئوية لمدة المعايرة الثقافة ومراقبة الجودة.
  6. المكان الثقافات على الجليد لمدة 5 دقائق. بعد هذه الخطوة، وترك الخلايا على الجليد طوال ما تبقى من بروتوكول كامل. حصاد الثقافات بواسطة الطرد المركزي عند 2000 XG و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 50 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام الفوق. ولكل ثقافة يتطلب أربعة أنابيب مع 25 مل كل (ما مجموعه 1مطلوب 00 مل كافية للحصول على إشارة إلى الضجيج ل2D 1 H-13 C NMR التجارب، التي تتطلب فقط 50 مل لكل ثقافة ل1D 1 NMR التجارب H).
  7. يغسل كل خلية بيليه مرتين مع الثلج الباردة O 2 DDH (حوالي 15 مل اول مرة و10 مل مرة الثانية) من قبل المعلمات الطرد المركزي المذكورة أعلاه. ليغسل الثانية، الجمع بين ال 10 مليلتر مأخوذة في أنبوب نفسه قبل الغزل. إعادة تعليق بيليه خلية في الحجم النهائي من 1،0 مل O 2 DDH (تحتاج إلى ضبط لحجم الخلية بيليه). إذا هو المطلوب تعليق خلية واحدة خالية من التثاقل في هذه الخطوة، يمكن خلايا sonicated لفترة وجيزة و / أو مرت من خلال إبرة قياس 27-ثلاث مرات. وبدلا من ذلك، يمكن تجميد الخلايا بيليه في -80 ° C وتخزينها حتى مزيد من المعالجة. في الحالة الأخيرة، يتم إذابة حبيبات المجمدة على الجليد قبل إعادة تعليق. إعادة تعليق الكريات خلية في الحجم النهائي من 1،0 مل O 2 DDH كما سبق.
  8. حوالةص الخلية 1،0 مل التعليق على أنبوب مل 2.0 كاب المسمار تحتوي على مصفوفة Lysing B (0.1 مم المجالات السيليكا). وضع الخالط FastPrep-24 تحلل داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. وضع العينات في حامل العينة، وتأمين الاحتفاظ تحدث لوحة على رأس الأنبوب. معالجة عينات لمدة 60 ثانية في الخالط في إعداد سرعة من 6 متر / ثانية.
  9. تدور العينات في ميكروسنتريفوج على 15،000 XG و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الحطام الخلية بيليه وخلايا سليمة.
  10. إزالة طاف وعينة تمر عبر مرشح حقنة (0.2 ميكرومتر) في أنبوب العقيمة. لوحة 0.1 مل من عينة (أو جزء من العينة ممثلة، وعلى سبيل المثال 10٪) على أجار MADC للتحقق من عدم وجود خلايا قابلة للحياة. قد المحققين أيضا بإجراء أكثر من خطوة واحدة الترشيح و / أو التحقق من وجود خلايا قابلة للحياة في مقتطفات باستخدام إجراءات تلطيخ الحية الميتة وذلك لمنع أو تحديد أي مخاوف محتملة للسلامة الأحيائية. تجميد العينات في حمام جليدي الإيثانول الجافة لتخزينفي -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للمجفف بالتجميد ومعالجتها في منشأة NMR.
  11. بعد 2 أشهر، تحقق لوحات للتحقق من عدم وجود وحدات تشكيل مستعمرة. إذا تم العثور على لم يتم CFU، قد يتم أخذ عينات من المختبر BSL3. ويتم إجراء مزيد من التحليل في منشأة NMR القياسية، والذي يقدم عادة متعددة المستخدمين وتعمل تحت أية متطلبات محددة الاحتواء.
  12. يجفد العينات إلى جفاف، ثم إعادة تعليق خلال 0.7 مل من العازلة NMR ونقل إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 13000 X ز. إزالة 0.6 مل ونقل إلى أنبوب NMR 5 مم. وبدلا من ذلك، يمكن أن ترسل عينات مجفف بالتجميد لمنشأة الخارجية وغير biohazardous عينات العادية.
  13. ويتم جمع البيانات NMR على الفور. على الرغم من كل الاحتياطات، قد الانزيمات النشطة لا تزال موجودة والعينة هو عادة غير مستقرة لفترات طويلة من الزمن. التغييرات في طيف الرنين المغناطيسي النووي هي ملحوظ عندما تترك العينات في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية لمدة ساعةخام من 1 في الاسبوع. أيضا، يتم جمع البيانات NMR تناوبت بين الثقافات غير المعالجة والدواء المعالجة، حيث يتم اختيارها عشوائيا من عينات كل فئة. هذا التحيز لا لزوم لها لأن يمنع فئة معينة كان أطول تأخير قبل جمعت أطياف الرنين النووي المغناطيسي. ومن شأن التحيز في البيانات يحدث إذا تم جمع أطياف الرنين النووي المغناطيسي لجميع العينات غير المعالجة الأولى، ثم تليها عينات المخدرات المعالجة. إذا كان غير قادر على عينات يتم تحليلها على الفور من قبل NMR، ينبغي تخزين العينات في 1 مل أنابيب إيبندورف في C. ° -80
  14. بعد إدخال عينات المعايرة في المغير BACS-120 عينة الصك، الذي ينطوي على بعد خطوات قليلة روتينية مثل قفل، والرقائق، دف، وتعظيم الاستفادة من طول 90 ° النبض، وذلك لتحقيق أقصى قدر من جودة النتائج. يتم استخدام عينة واحدة لمعايرة ال 90 ° طول النبض وضبط أداة لعينات المتبقية. قفل، الملئ، وNMR جمع البيانات عن كل عينة هو النقيب الآليز ICONNMR وgradshim.
  15. يتم تحصيل 1D 1 H NMR الطيف باستخدام تسلسل بروكر نبض zgesgp مع قمع المياه باستخدام النحت الإثارة. وتستخدم ما مجموعه نقاط البيانات 32K مع عرض اكتساح 5482.5Hz والمسح الضوئي 128، و 16 بالاشعة وهمية. يتم تحصيل 2D 1 H-13 C HSQC الطيف باستخدام تسلسل بروكر نبض hsqcetgp. يتم جمع ما مجموعه 2048 نقطة البيانات مع عرض اكتساح 5000،0 هرتز على طول البعد المباشر H 1، و 64 نقاط البيانات مع عرض اكتساح 18864،9 هرتز على طول البعد غير المباشرة C 13. يتم جمع الطيف مع 128 دمية المسح الضوئي والمسح الضوئي 16 إلى الحصول على إشارة جيدة للضوضاء.

الشكل 1
الشكل 1. ويصور رسم تخطيطي تدفق الإجراءات التجريبية.

NMR العازلة

محلول المخزون من 50 ملي فوسفات البوتاسيوم برتقاليإيه مع اجتماع الدول الأطراف الثالث ميكرومتر 50:

  • 2،17 ز K 2 HPO 4 (ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم)
  • 1،70 ز KH 2 PO 4 (أحادى الفوسفات البوتاسيوم)
  • 7،86 ملغ صوديوم-3-Trimethylsilylpropionate (اجتماع الدول الأطراف الثالث-2-D ،2،3،3 4 (D، 98٪))
  • تذوب في 500 مل من "٪ 100" D 2 O
  • يجب أن يكون الحل النهائي في درجة الحموضة 7.2 (غير المصححة)

MADC-TW-TW أو MOADC (1 L)

  • 4،7 ز Middlebrook 7H9 مرق قاعدة
  • 900 مل DDH 2 O
  • 2 مل الجلسرين
  • تخلط المكونات لمدة 25 الأوتوكلاف ودقيقة. السائل بارد لمسة وإضافة الحلول التالية:
  • 100 مل ADC عند إعداد MADC أو 100 مل OADC عند إعداد MOADC
  • 2.5 مل 20٪ توين 80 (بدلا من ذلك، 1 مل من غير التمثيلية تيلوكسابول 20٪)
  • 10 مل سيكلوهيكسيميد 1٪

ADC (1 L)

  • 20 غراما D (+)-الجلوكوز
  • 50 الكسر ز BSAV
  • 8،5 ز كلوريد الصوديوم
  • 800 مل DDH 2 O
  • حل معا، وضبط مستوى الصوت ل1 L وتعقيم مع 0.2 ميكرون التصفية. تخزين في C. ° 4

بدلا من ذلك، لإعداد OADC (1L)، إضافة كافة المكونات المذكورة أعلاه بالإضافة إلى 50 مل من حمض الأوليك 1٪ (الوصفة أدناه يجعل دفعة مل 250). حل معا، وضبط مستوى الصوت ل1 L وتعقيم مع 0.2 ميكرون التصفية. زجاجة يحتاج إلى أن تكون ملفوفة في رقائق الألومنيوم وتخزينها في C. ° 4

  • 2،5 حمض الأوليك ز
  • 250 مل هيدروكسيد الصوديوم 0.2M
  • ذوبان الجليد حمض الأوليك (يتصلب على التبريد) عن طريق التسخين عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 10 دقيقة، ويضاف إلى محلول هيدروكسيد الصوديوم والحرارة مع التحريك لمدة 60 دقيقة. متجر في زجاجات زجاجية معقمة التي هي ملفوفة في رقائق الألومنيوم. زجاجات الختم مع parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية.

إذا تفضل، يمكنك شراء التجارية BD BBL Middlebrook ADC أو OADC في تخصيب الكاتلاز.

1٪ سيكلوهيكسيميد (100ML)

  • 1 غرام سيكلوهيكسيميد
  • 100 مل DDH 2 O

حل وتعقيم مع فلتر ميكرون 0.2. تخزين في C. ° 4 تنبيه: سيكلوهيكسيميد هي سامة جدا التعامل مع الحذر الشديد.

20٪ (V / V) توين 80 (100ML)

  • 20 مل توين 80
  • 80 مل DDH 2 O

بدلا من ذلك، تزن 20 غراما من توين 80 (حوالي 18،9 مل؛ الكثافة 1،06 جم / مل)، لإعداد 20٪ ث / ت الحل. حل الحرارة إلى 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى حل، وتخلط تماما. تعقيم السائل 0،2 ميكرومتر مع التصفية. تخزين الحل النهائي في درجة حرارة الغرفة.

20٪ (V / V) تيلوكسابول (100ML)

  • 20 مل تيلوكسابول
  • 80 مل DDH 2 O

بدلا من ذلك، تزن 20 غراما من تيلوكسابول (حوالي 18،2 مل؛ الكثافة 1،1 جم / مل)، لإعداد 20٪ ث / ت الحل. حل الحرارة إلى C ° 55 لمدة 30 دقيقة لديssolve، ويخلط تماما. تعقيم السائل 0،2 ميكرومتر مع التصفية. تخزين الحل النهائي في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة 1: الأسهم من الجلسرين M. يتم إعداد السل باستخدام بروتوكول التالية.

تخزين M. مرض السل

  • تنمو M. السل في MADC 50 مل من التشبع (OD 600 = 1.5 إلى 2.0) عند 37 درجة مئوية تحت ظروف تهز (100 دورة في الدقيقة). اعتمادا على سلالة، وهذا يستغرق 7-14 يوما.
  • تدور في عينات 2000 XG في C ° 4 لمدة 15 دقيقة في الثقافة بيليه. إزالة طاف.
  • resuspend في 6 مل من الجلسرين 50٪ العقيمة.
  • قسامة 1.5 مل إلى 4 قوارير المبردة كورنينج والتسمية بشكل مناسب.
  • قارورة على الفور تجميد فلاش في الإيثانول / حمام الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.

ملاحظة 2: التلقيح H37Rv سلالة (-80 ° C المخزون تصل إلى 1.5 سنة) في 70 مل من وسائل الإعلام MADC فى حدوث OD 600 </> فرعية من حوالي 0.6 بعد 5 أيام من النمو في C ° 37 تحت ظروف تهز (100 دورة في الدقيقة) في 40 إنوفا شاكر.

ملاحظة 3: لاختبار التلوث والثقافة، والمحققين قد تطعيم لقسامة على الثقافة الغنية المتوسطة القياسية وتحقق النمو بعد غياب الحضانة بين عشية وضحاها. بشكل روتيني، ومطلي الثقافات على أجار MADC لمراقبة الصرف ودراسة من قبل مستعمرة التخلص النقيض المجهر. إذا رغبت، يمكن التحقق باستخدام PCR الثقافات IS 6110 الاشعال كما هو موضح .. 3

2. ممثل النتائج

وهناك العينة التي يتم إعدادها بشكل جيد تسفر عن طيف الرنين المغناطيسي النووي مماثلة لتلك التي صورت في الشكل 2. هذا الطيف هو تمثيل للM. السل الأيض نوع البرية حوض السباحة. ويرتبط مباشرة أو غير مباشرة الأيضات تحديدها مع المسار D-ألانين. أيضا، حجم كثافة الذروة يتناسب مع تركيز المستقلب تقديمفي استخراج الخلايا. ولذلك يمكن أن التغيرات في شدة الذروة بين الثقافات دون علاج، العلاج من تعاطي المخدرات، وسلالات متحولة إلى اضطرابات في التمثيل الغذائي والمسارات الأيضية. وM. تم جمع السل 1 H NMR 1D الأطياف على مطياف سميت بال المقدمة بروكر 500 ميغاهيرتز مجهزة الثلاثي الرنين، مسبار بالبرد التدرج Z-المحور. يحتوي الطيف كاليفورنيا. 400 القمم، والتي كان من الممكن لتحديد وقياس 40-50 الأيضات، بما في ذلك الأحماض الأمينية، والسلائف النوكليوتيدات، وسيطة حمض الستريك حال السكر و. تم استخدام مبدل BACS-120 عينة مع برنامج أيقونة بروكر لأتمتة عملية جمع البيانات NMR. تم جمع 1D 1 H NMR أطياف باستخدام النحت الإثارة 4 لإزالة المذيب بكفاءة والحفاظ على خط الأساس المسطحة، والقضاء على أي حاجة لجمع خط الأساس التي ربما تتسبب في الأعمال الفنية اللاحقة في تحليل العنصر الرئيسي (PCA) أو متعامد جزئية التمايز المربعات تحليل (OPLS- DA). A 1يتم جمع D 1 H NMR الطيف في C ° 25 مع عرض طيف و32K هرتز 5482،5 نقاط البيانات. واستخدمت ما مجموعه 16 المسح بالاشعة وهمية 128 إلى الحصول على الطيف. تم استخدام مختبرات 1D ACD NMR البرمجيات المعالج لشبه تلقائيا معالجة كافة أطياف 1D 1 NMR H. وكانت أطياف فورييه تحويل، على مراحل، والمشار إليه إلى الذروة اجتماع الدول الأطراف الثالث (0.0 جزء في المليون). تم استخدام مجموعة من البرامج لمعالجة NMRpipe بشكل فردي 2D 1 H NMR-13 C الأطياف وتحليلها مع NMRDraw. تصحيح المرحلة تم تحويل الملف أولا بروكر البيانات FID إلى تنسيق ملف التعرف عليها ومن ثم تم NMRpipe فورييه تحويل الطيف،، وملأ صفر. يتم تعيين قمم NMR الملاحظ في طيف الرنين المغناطيسي النووي 1D 1 H 1 H و 2D-13 C NMR الطيف لالأيضات معينة باستخدام 1 H و 13 التحول الكيميائي التحمل C قدره 0.05 جزء في المليون و0.50، على التوالي، والايض ماديسون اتحاد قواعد البيانات (MMCD )، 6 و قاعدة البيانات Metabolome الإنسان .. 7 على وجه التحديد، أطياف الرنين النووي المغناطيسي هي 1D و 2D يدويا الذروة بعناية، حيث يتم تحميل ثم قائمة ذروة التحولات الكيميائية NMR إلى قاعدة بيانات وMetabolome الإنسان. يتم تعيين الأيضات التي حددها قاعدة بيانات Metabolome الإنسان إلى طيف الرنين المغناطيسي النووي على حد سواء على أساس تحقيق أقصى قدر من عدد من مطابقة الرنين NMR والانتماء لشبكة الأيض. كل مجمع أو المستقلب وعادة أزواج CH NMR الرنين متعددة ومتعددة تبعا لذلك. وهكذا، فإن أكثر من هذه الأصداء NMR التي لوحظت في طيف الرنين المغناطيسي النووي التجريبية، والأرجح هو المستقلب الحالي. وبالمثل، وتحديد الأيضات متعددة المنتسبين مع المسار نفسه يزيد من احتمال تعيينات الصحيح. يتم التحقق من وجود مستقلبات والمسارات الأيضية مع موسوعة كيوتو من الجينات والعوامل الوراثية (KEGG) 8 وقواعد البيانات MetaCyc .. 9 المتفطرة smegmATIS هو نظام نموذجا مفيدا لM. السل ومسببات الأمراض الفطرية الأخرى. كما هو موضح في مكان آخر، وعينات من M. ويمكن أيضا أن تتعطل من قبل اللخنية صوتنة 10

الشكل 2
الشكل 2. 1D 1 H NMR الطيف من المتفطرة السلية استخراج الخلايا. وصفت قمم NMR المرتبطة الأيضات ممثل. الاختصارات هي التالية: AMP، والفوسفات أحادي الأدينوزين α-KG، α-كيتوغلوتارات؛ غلو، الغلوتامات، وعلاء، ألانين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد حلل عدد كبير من الدراسات لمحات من البروتين وtranscriptomic M. السل في إطار مجموعة من في المختبر والمجراة في ظروف. 11-16 في نهاية المطاف، والتغيرات في التعبير الجيني ونشاط انزيم يؤدي إلى تغيرات في تركيزات الجزيئات الصغيرة الوزن الجزيئي. وصف كامل لهذه المركبات تشكل metabolome. وبالتالي، يمكن تتبع آثار المخدرات وظروف النمو متفاوتة على المسارات الأيضية عن طريق التحليل metabolomic. 17،18 قليلة هي الدراسات استفادوا من هذه المنهجية لدراسة المسارات الأيضية في M. السل (انظر أدناه) وغيرها من المتفطرات، أو لتحليل التغيرات الأيضية في الفئران المصابة M. السل 19

A شرك المحتملة لهذه المنهجية هي أن بعض الكائنات الحية الدقيقة قد لا تكون العينة في هي lysed تماما. إذا لزم الأمر، ويمكن تكرار الخطوة واحد أو تحللمرتين أخريين. يمكن رصد كفاءة تحلل عن طريق إجراء فحص البروتين القياسية (مثل البروتين BioRad الفحص DC). لزيادة حساسية الكشف عن مستقلبات حاضرا في تركيزات منخفضة، يمكن تجميع عينات متطابقة عدة (تم جمعها في الخطوة 8)، مجفف بالتجميد، ومعلق في انخفاض حجم.

وقد وصفت إجراءات بديلة إعداد العينات للدراسات metabolomic في المتفطرات. ومن الأمثلة على ذلك، من تمزيق الخلايا صوتنة، 10،20 الضرب حبة و 20 و 21 تجانس مع الخرز الزركونيا. وبالمثل، قد استخدمت إجراءات استخراج الاختلافات في الأسيتونيتريل المحمضة و / أو المذيبات العضوية الأخرى. 20،22-24 تحديد الأيضة كما حققته الإجراءات التحليلية المختلفة، بما في ذلك الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، 24 اللوني السائل قياس الطيف الكتلي (LC-MS)، 21،23 وعكس الطور السائل عالية الأداء CHROmatography (RP-HPLC). كما تم تحديد 25 A عدد محدود من الأيضات وكميا عن طريق قرارات الأنزيمية مباشرة 26 على الرغم من أن عدد من مستقلبات إجمالي المتوقع في مقتطفات من عصاري خلوي متفطرات لا يزال غير معروف، 22 يلاحظ أن تم تحديد 1692 الأيضات في العصوية مقتطفات من الرقيقة الكهربائي الشعري وMS 27

تم استعراض القضايا الهامة المتعلقة بتحديد الهوية والإجراءات التحليلية الكمي من ميتز وآخرون 28 مزايا التكنولوجيا NMR تشمل سهولة إعداد العينات والطبيعة غير المدمرة لهذا الإجراء. ومع ذلك، فإن قواعد البيانات المتاحة من الأطياف لتحديد المركب، على الرغم من التوسع أي وقت مضى، لا تزال غير كافية لتحديد المستقلب الكامل. قد طرق GC-MS وLC-MS تتطلب أكثر تفصيلا لإجراءات إعداد العينات وقدر أكبر من التباين، مما يجعل من الصعب مقارنة بالنتيجهTS من مختبرات مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، GC-MS يتطلب اشتقاق المستقلب مع خسارة لاحقة في المواد التي تؤدي إلى أقل دقة القياس الكمي. طرق لتحسين فصل والقضاء على قمع التأين LC-MS في وعد للتغلب على بعض هذه المشاكل. ومع ذلك، في رأينا، وهذا العيب لا تزال مسألة هامة في المستقبل القريب. وعلاوة على ذلك، NMR منهجيات مثل HSQC 2D، 2D J-حلها والتجارب الناتجة STOCSY وبالفعل في زيادة الكفاءة والدقة في تحديد المستقلب 29 ومع ذلك، NMR MS-LC والإجراءات هي إجراءات مكملة، ومن المرجح أن تكون متكاملة في التحليل المشترك من metabolome أنظمة 28

وصف إجراءات إعداد العينات هنا، مع إدخال التعديلات المناسبة من الأنظمة الوقائية والخطوات بعد تحلل FastPrep-24، يمكن تكييفها لتحليل البروتين، كما هو موضح في مكان آخر 30 وهكذا، والسل، reseaقد rchers تحليل عينات من النوع البري وسلالات متحولة نمت في إطار مجموعة من الظروف باستخدام الإجراءات التي تشمل مجتمعة النهج بيولوجيا الأنظمة 31 هذه التقنيات يجب أن يثبت لا غنى عنها لتشريح الطرق المركزية من الأيض M. السل، 32 فهم التي قد تكون ضرورية لتوضيح آليات الكمون، وتطوير اللقاحات وكلاء أفضل مضاد المتفطرات. هذه الحاجة ملحة، ولا سيما في سياق مكافحة وعلاج السل المقاوم للأدوية المتعددة وللXDR. 33،34

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبرات بارليتا الدكتور والدكتور القوى للتعليقات مفيدة عند وضع البروتوكول. نشكر ويندي لإجراء مناقشات مفيدة أوستن وتصحيح التجارب المطبعية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل المبين في هذا المخطوط من المنح الرائدة البذور لكل محقق المذكورة أعلاه من جامعة نبراسكا لنكولن مركز علم الأحياء الأكسدة (الأم منحة # 017675 NCRR 2P20RR، D. بيكر، PI). وبالإضافة إلى ذلك، نشكر الدكتور أوفيليا شاكون لتوفير الأموال من منحة R21 لها (1R21AI087561-01A1) لوازم البحوث ودعم السيد Halouska في جزء من رواتب توحيد تقنيات NMR المدرجة في هذه النشرة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Tags

العدوى، العدد 67،
تحضير العينة من<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zinniel, D. K., Fenton, R. J.,… More

Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter