Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

Summary

Ein

Abstract

Die isolierte microvessel Vorbereitung ist eine Ex-vivo-Präparat, das zur Untersuchung der unterschiedlichen Beiträge der Faktoren, die Kontrolle Gefäßdurchmesser ermöglicht, und somit Perfusionswiderstandes ^1-5. Dies ist ein klassisches experimentelles Präparat, das in hohem Maße war, zunächst von Uchida et al. ¹⁵ vor einigen Jahrzehnten. Diese erste Beschreibung, die die Grundlage für die Techniken, die umfassend modifiziert und verbessert wurde, in erster Linie im Labor von Dr. Brian Duling an der University of Virginia ^6-8, und präsentieren wir Ihnen eine aktuelle Ansatz auf den folgenden Seiten. Diese Vorbereitung wird speziell auf die gracilis Arteriole in einer Ratte als microvessel der Wahl beziehen, aber die grundlegende Vorbereitung lässt sich problemlos auf Schiffe von nahezu jedem anderen Gewebe oder Organ über Artgrenzen ^13.09 isoliert angewendet werden. Mechanische (dh dreidimensionale) Veränderungen in der isolierten Mikrogefäße kann leicht ausgewertet werdenin Reaktion auf eine breite Palette von physiologischen (zB Hypoxie, intravaskuläre Druck oder Scherung) oder pharmakologische Herausforderungen und einen Einblick in mechanistische Elemente mit integrierten Reaktionen in einer intakten bereitzustellen, obwohl ex vivo Gewebe. Die Bedeutung dieser Methode ist, dass es für einfache Manipulation der Einflüsse können auf der integrierten Regelung der microvessel Durchmesser, aber dabei auch für die Steuerung von vielen der Beiträge aus anderen Quellen, einschließlich der intravaskulären Druck (myogenen), autonomen Innervation, hämodynamische ( zB Scherspannung), Endothel-abhängigen oder unabhängigen Stimuli, hormonelle und Parenchymzellen Einflüsse, um eine teilweise Liste zu liefern. Unter geeigneten experimentellen Bedingungen und mit entsprechenden Zielen, kann dies als Vorteil gegenüber in vivo oder in situ Gewebe / Organ Präparate, die nicht leicht für die einfache Steuerung von größeren systemischen Variablen ermöglichen dienen.

Die major Einschränkung dieser Vorbereitung ist im Wesentlichen die Folge seiner Stärken. Per Definition ist das Verhalten dieser Schiffe wird unter Bedingungen, wo viele der bedeutendsten Beiträge zur Regulierung des vaskulären Widerstands entfernt worden sind, einschließlich der neuronalen, humoralen, metabolischen, etc. Als solche untersucht, so ist der Prüfer darauf achten, sich über-vermeiden Interpretation und Extrapolation der Daten, die gesammelt unter Verwendung dieser Zubereitung werden. Ein weiterer wichtiger Bereich der Bedenken hinsichtlich dieser Zubereitung ist, dass sie sehr einfach zu zellulären Bestandteilen wie das Endothel oder vaskulären glatten Muskelzellen beschädigen kann, so dass variable Quelle der Fehler eingeführt werden. Es wird dringend empfohlen, dass die einzelnen Ermittler entsprechende Messungen, um die Qualität der Zubereitung gewährleisten zu nutzen, sowohl auf der Start des Experiments und in regelmäßigen Abständen im Laufe eines Protokolls.

Protocol

1. Vor dem Experiment

1. Vor dem Experiment Tag werden Glaskapillarrohre den passenden Abmessungen für die Station in Mikropipetten (entweder eine horizontale oder vertikale Abzieher kann verwendet werden) gezogen wird. Der Durchmesser der Spitze kann leicht eingestellt werden je nach Gefäß isoliert, obwohl wir verwenden in der Regel einen Durchmesser zwischen 50-150 um. Diese werden dann an die entsprechende Konfiguration für den microvessel Station folgenden Erwärmen über einer Flamme Butan gebogen. Mikropipettenspitzen sind physisch mit dem ungefähren Durchmesser gebrochen (mit feinen Pinzetten) für die microvessel in Frage und kann geschliffen oder poliert, um die entsprechenden Konformationen, wie dies für die spezifische Anwendung. Für eine umfassende und hervorragende Kritik an diesen Verfahren wird der Leser auf Davis et al gerichtet. ^16. Zwei Mikropipetten werden dann in der Opposition in die Pipette Halterungen für die microvessel Kammer platziert. Diese müssen ausgerichtet werden, dass die Spitzenin der gleichen vertikalen und horizontalen Ebene innerhalb der Behälterkammer.
   Die microvessel Kammer in diesem Manuskript (Abbildungen 1 und 2) verwendet wird, ist eine, die Sitte durch Herrn David Eick in der Abteilung für Physiologie errichtet am Medical College of Wisconsin (ist http://www.phys.mcw.edu/ und www . eicktech.com ). Es sind jedoch mehrere andere Konfigurationen von Mikrogefäßzellen Kammer leicht im Handel erhältlich, mit denen von lebenden Systemen Instrumentation (entwickelt http://www.livingsys.com/ ) und IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ), ein Standard. Mit diesen anderen Systemen, kann es zwingend geboten, eine inverse Mikroskop anstatt einer herkömmlichen aufrecht eins nutzen, obwohl dies abhängig von der spezifischen Anforderungen an die Ausrüstung und Experiment. Der Einsatz von inversen Mikroskopen wäre für experimentelle Protokoll vorzuziehenole erfordern fluoreszierende oder konfokale Bildgebung.
2. Bereiten Sie eine physiologische Salzlösung (PSS; unten beschrieben) und sicherstellen, pH-Wert auf geeigneten Ebenen ist für die spezifischen experimentellen Bedingungen (7,38 bis 7,42 ist typisch und fällt unter physiologischen Bereich) eingestellt. Die PSS-Lösung kann vorher vorbereitet und gekühlt werden, sondern muss bei der entsprechenden Temperatur für pH vor der Verwendung überprüft werden. PSS enthalten kann Albumin, wenn der Experimentator und Protokolle erfordert, obwohl dies nicht allgemein erforderlich.
3. Die digitalen Video-Bremssättel verwendet werden, um Gefäßdurchmesser messen sollte mit Hilfe eines geeichten Zählkammer oder Mikroskop Objektmikrometer werden. Für eine genaue Kalibrierung ist es wichtig, dass das Mikrometer in der gleichen Ebene wie der Mittelzufluss /-abfluss Mikropipetten im Gefäß Kammer platziert werden.
4. Tie Schlaufen zur Befestigung des microvessel zu den Pipetten sollten vorbereitet und leicht zugänglich sein für die spätere Verwendung. Diese können ohne weiteres 8-0 oder kleiner ophthalmischen s hergestellt werdenukunft. Die einzige Schleife binden kann vorbereitet und in einer abgedeckten Petrischale auf einem kleinen Streifen Klebeband um ein umgekehrtes Mikroskop-Objektträger, bis sie benötigt (dies wird ihnen nicht verloren geht). (Abbildung 3).

2. Tag des Experiments

1. Alle Geräte unterstützen sollte eingeschaltet sein und auf einwandfreie Funktion geprüft. Dazu gehört auch die anti-vibration/floating Tisch und die zirkulierenden Wasserbad (eingestellt auf die entsprechende Temperatur im Behälter Badewanne bieten - gewöhnlich 37 ° C), alle Drucksensoren und das Schiff Kammer Ablaufpumpe (Abbildung 1A und 1B). Schalten der Äquilibrierung Gase in der Behälterkammer und im Perfusat und Superfusat Reservoirs.
2. Füllen alle Behälter, Rohre und Kammern mit dem PSS-Lösung. Das Perfusat Leitung zum Zufluss Pipette muss vollständig ausgefüllt werden, um das Vorhandensein von Luftblasen in dieser Linie, die verdrängen und könnte dadurch beschädigt werden va vermeidenscular Endothel (1C). Wenn nötig, mit einer Spritze vorsichtig in das PSS den ganzen Weg durch die Pipette, um sicherzustellen, dass es komplett voll ist und ohne Blockade, die Perfusat Strömung behindern könnte. Der Zufluss Druck sollte in vernünftigen Grenzen gehalten werden, um eine Beschädigung der Drucksensoren.

3. Microvessel Harvesting

1. Nach betäubende des Tieres, von dem die Mikrogefäßzellen zu nehmen ist, sollte das Gefäß in Frage nach den Verfahren, die am besten in das Gefäßsystem zu untersuchen sind, isoliert werden. In einigen Fällen kann dies erfordern Entfernung des Organs selbst (zB zerebrale oder koronare Mikrogefäße), während in anderen Schiffe können direkt aus dem narkotisierten Tier entfernt werden (zB Muskel). Ein Beispiel für die Orientierung des Gefäßes innerhalb der Musculus gracilis ist in 4 dargestellt. Abschätzung der Länge des Behälters in vivo vor der Entfernung mit fürSteinpilze oder kleine Bremssätteln. Vor der Entfernung des Schiffes von dem Tier / Organ, kann es sehr hilfreich sein, ein letzter Check, um sicherzustellen, dass das Schiff Kammer bereit ist und ordnungsgemäß funktioniert (einschließlich aller tie-Schleifen in place) ist durchzuführen.
2. Entfernen Sie das Gefäß aus dem Tier / Organ durch Ergreifen der Außenseite des Schiffes an einem Ende mit feinen Pinzetten und Schneiden entlang der Länge des Schiffes, bis es frei ist, wobei extreme Sorge, dass kein Zerren oder Ziehen am Schiff zu vermeiden. Einmal befreit, legen Sie sie sofort in einem 1,7 ml Zentrifugenröhrchen mit PSS gefüllt, aber nicht loslassen des Schiffes. Dies ist, um die Orientierung zu erinnern, sind so, dass Perfusat Richtung in dem Bad identisch sein Blutströmungsrichtung beim Tier.

4. Kanülieren des Vessel

1. Setzen Sie den Behälter in der gefüllten Badewanne und kanülieren das proximale Ende auf den Zustrom Pipette. Dies kann am besten mit einem bescheidenen Perfusionsrate durch die Kanüle (~ 50 mmHg Druck) und erreicht werdenein Paar von feinen Pinzette verwendet, um jede Seite des proximalen Gefäßlumen Wand (dh ein Paar von Zangen in jeder Hand) zu halten. In unserem Labor verwenden wir feinen Pinzette aus Fine Science Tools ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), obwohl keine entsprechend ausgebildeten Zange effektiv arbeiten wird. Schieben Sie das Schiff auf der Kanüle Tipps und fördern das Schiff an der Spitze bis zu dem Punkt, wo zwei Schleifen binden das Schiff sichern können.
2. Heben Sie den Zulaufdruck zu ~ 75 mmHg auf weiter aufblähen und das Schiff zu erleichtern Kanülierung am distalen Pipettenspitze. Strömung durch den Behälter sollte als eine Verzerrung in der Superfusat Reservoir am distalen Abfluss von dem Behälter (unter dem Mikroskop) gesehen werden. Kanülieren das distale Ende des Schiffes auf dem Abfluss Pipette und sichern Sie es mit zwei Schleifen binden (diese endgültigen Schlaufen müssen an Ort und Stelle vor der Kanülierung sein; Abbildung 5).
3. Passen Sie die Kanüle bis in den XYZ-Koordinaten als needed, bis eine minimale Verzerrung in dem Gefäß, und das Gefäß so nähert sich die In-vivo-Länge. Heben Sie den Zufluss Druck, bis es annähernd ist der Prozentsatz der mittlere arterielle Druck normalerweise von diesem Schiff Segment (unser Labor nutzt 80% des mittleren arteriellen Drucks für den großen Widerstand Arteriolen des M. gracilis ⁸⁾ erlebt.
4. Geben Sie eine kleine sprudelnde Stein liefert das entsprechende Gasgemisch in Bad und Platz Plastikfolie oder einer Glasscheibe über der Kammer um Spritzer zu vermeiden das Mikroskop-Objektiv. Wir verwenden eine sprudelnde Stein, der gemeinhin unter allen PET / Aquarium speichert ist und ist ca. 1 cm im Durchmesser, obwohl eine kleinere Größe als auch effektiv funktionieren wird. Das Vorhandensein der Blasenbildung Stein gewährleistet entsprechenden Gas vorhanden sind, um das Schiff zu allen Zeiten und über das Schiff Lebensfähigkeit erstrecken. Der Stein ist in allen Messperioden (oder Luftstrom durch den Stein vorübergehend unterbrochen) entfernt, um Verzerrung des zu verhindernBild. Lassen Sie die Klemme an der Pipette Abfluss und lassen Durchströmung des Behälters für 30 Minuten. Periodisch, die Strömung am Ausfluss Schlauch befestigt werden, um festzustellen, ob das Schiff entwickelt Ruhetonus. Alle Schiffe müssen für Druck Lecks an dieser Stelle überprüft werden. Undichtigkeiten wird offensichtlich sein, durch die Einführung eines bekannten Druck in den Behälter (wir verwenden üblicherweise 100-120 mmHg) und das Klemmen der Abfluss, gefolgt von Zulauf Linien. Wenn die intraluminale Druck stabil ist, gibt es keine erkennbaren Lecks. Allerdings, wenn Druck zu fallen beginnt, ist ein bedeutender Leck vorhanden und muss geschlossen werden. Leckagen entweder an der Zu-oder Abfluss Pipetten können in der Regel durch eine zusätzliche Schleife um das Schiff auf der Pipette gebunden behoben werden. Alternativ, wenn ein Schiff verfügt über einen kleinen Seitenarm, der damit das Leck ist, wird dieser Kompromiss die Fähigkeit des Schiffes, um den Druck wirksam eindämmen kann und eine zusätzliche Quelle für Fehler einzuführen. Wenn dieses Leck erkannt wird, kann es normalerweise ausgeschalteten w gebunden werdenit einem einzigen Schleife von 10-0 opthalmic Naht. Alternativ ist ein einzelner Strang 6-0 Nahtmaterial aufgezogen, um das Band Schlaufe zu bilden gut wirksam. Wenn das Leck nicht identifiziert werden kann oder nicht effektiv gebunden werden, (zB gibt es keine Stamm zu den Seitenast und einfach ein Loch in der Gefäßwand), kann dies zu einer vorzeitigen Beendigung des Experiments führen und die Verwendung eines alternativen Behälters werden notwendig ist (dies ist im Allgemeinen die gleichen Gefäß in das andere Bein - oder kontralateralen Seite falls erforderlich - des Tieres).
   
   Der Behälter sollte die Möglichkeit unter keinen Strömungsbedingungen für mindestens 30 min lang sich ausgleichen werden. Alle Versuche werden unter keinen Strömungsverhältnisse durchgeführt. Sobald das Schiff zufriedenstellend Ton entwickelt hat, und reagiert auf den Einschlusskriterien für das Experiment in Frage, ist das Schiff bereit für die nachfolgende Untersuchung.
   
   Diese Einschlusskriterien kann je nach den spezifischen experimentellen Protokoll und Ermittler. In unserem Labor haben wir routinemäßig utilize die folgenden:
   1. Aktive Ton von> 30% (berechnet als &Dgr; / D _max x 100, wobei &Dgr; ist die Zunahme der Arteriolen Innenwand Durchmesser von den unter dem Äquilibrierung Druck als Reaktion auf Exposition gegenüber Ca ^{2 +-freiem} PSS und D _max die maximale Durchmesser an der Äquilibrierung Druck in der Ca ^{2 +-freiem} PSS) gemessen.
   2. Myogenic Aktivierung (Wartung, oder vorzugsweise eine Verringerung, Arteriendurchmesser mit erhöhter intraluminalen Druck) als ein Index eines lebensfähigen vaskulären glatten Muskulatur.
   3. Ein lebensfähiger Endothel, als durch eine rege Dilatator Reaktion auf Acetylcholin (10 ^-6 M in der Badewanne) belegt.
   4. Weitere Einschlusskriterien können hinzugefügt, um den spezifischen experimentellen Protokoll nach Bedarf, einschließlich constrictor Antworten auf adrenerge Agonisten wie Phenylephrin (10 ^-7 M), Dilatator Reaktionen auf zusätzliche Anreize wie Adenosin (10 ^-5 angepasst werden 2 in der Äquilibrierung Gas).
5. Der folgende Abschnitt ist ein Beispiel für ein "Mock-Experiment". Alle benötigten Lösungen werden als angemessen vorbereitet, mit Augenmerk auf den Verdünnungsfaktor der PSS in der Behälterkammer ausmachen. Als ein Beispiel für einige der Geräte, ist das Volumen der Behälterkammer 20 ml. Als solches 20 ul einer 10 ^-2 M Stammlösung zu einer effektiven Konzentration von 10 ^-5 M in der Behälterkammer Bad. Nach Entfernung Schiff, Kanülierung, Äquilibrierung und Validierung, wie oben beschrieben, ist das Experiment bereit, zu beginnen. Besonderheiten wie die Behandlung der Randomisierung und Effektivität sind spezifische und Experiment würde übermäßigen Raum für diese Anstrengung konsumieren. Als solche sind diese nicht im Detail enthalten.
   
   Eine erste Kontrolle Reaktionen bestimmt werden. Ein Beispiel für die physiologische Stimulus wie myogene Aktivierung (Druck-induzierte Konstriktion), intralumenalen prEssure wird zufällig über den gewünschten Bereich verändert, und das Gefäß wird eine angemessene Frist eingeräumt, um zu reagieren (in diesem Fall, würden wir eine 5-7 Minuten Zeit lassen). Ein Beispiel für pharmakologische Stimulus wie Herausforderung mit Acetylcholin, wird das Medikament der Rückseite aus Stammlösungen in einer zufälligen Reihenfolge zugefügt. In diesem Fall würden wir normalerweise benutzen einen Bereich von 10 ^-9 bis 10 ^-5 M in der Badewanne, mit Auswaschung als eine Wiederherstellung des Gleichgewichts Durchmesser definiert. Als Acetylcholin ist ein schnell wirkendes Mittel kann maximal Dilatator Reaktionen leicht in nur wenigen Sekunden erreicht werden. Andere Wirkstoffe (z. B. Peptide) können sehr viel länger dauern, um eine maximale Reaktion und so viel zu berücksichtigen, sowie den Zeitraum für eine effektive Auswaschung ergriffen wurden. Entlocken Sobald die Kontrolle Reaktionen gesammelt worden sind, können spezifische Interventionen auf dem System auferlegt werden, einschließlich der Inkubation des Schiffes mit Rezeptor-Agonisten / Antagonisten, handelnde Agenten an bestimmten Ionenkanälen, Betreiben vonveränderten intraluminalen Druck, Unterschiede in Equilibrierungspuffer Gase oder pharmakologischen Mitteln an spezifische enzymatische Systeme ausgerichtet, um nur einige der häufigsten Eingriffe zu nennen.
   
   Nach einer angemessenen Zeit für die Intervention effektiv zu sein (das ist in geeigneter Weise geprüft werden), kann eine zweite Runde der Datenerhebung begonnen werden. Abhängig von der jeweiligen experimentellen Protokoll, können nachfolgende Interventionen auf dem Schiff auferlegt werden oder das erste entfernt werden (entweder durch Auswaschen - wenn machbar - oder einfaches Abtrennen der physiologische Herausforderung) sein. Sobald das Schiff auf seiner Equilibrierung Zustand (das sollte überprüft werden) zurückgekehrt ist, können nachfolgende Interventionen angewandt, wie mit zusätzlichen Daten gesammelt benötigt werden. Dieses allgemeine Verfahren würden bis zur Beendigung des Experiments fortgesetzt werden oder bis die Qualität des Schiffes Vorbereitung Unterschreiten vorher festgelegten Schwellenwerten Kriterien (z. B. als Reaktion auf ein Agonist oder die Fähigkeit, genügend aktive Ton zu entwickeln). An diesem Punkt wird der Versuch entweder geschlossen oder die Prüfer kann wünschen, dass Daten, die unabhängig von der Reaktivität des isolierten Gefäß (wie Mechanik der Gefäßwand, die unter Verwendung des gleichen Verfahrens von myogenen Aktivierung werden kann, ist einfach zu sammeln mit einem Gefäß fehlen alle aktiven Ton ^14).
6. Die regelmäßige Reinigung aller Geräte ist von wesentlicher Bedeutung für die Entfernung von Salz-Zunahme und der Verhinderung des Wachstums von unerwünschten biologischen Einheiten. Am Ende eines jeden Experiments Tag, auf ein Minimum, werden alle Zeilen und Kammern vollständig von PSS mit reichlich destilliertem oder deionisiertem Wasser gespült und vollständig trocknen lassen. Nach alle 2-3 Tage der Verwendung wird eine Wäsche mit Ethylalkohol und durchgeführt wird und die Ausrüstung kann sich vollständig zu trocknen. Am Ende jeder Woche konsequente, werden alle Zeilen und Kammern mit 0,1 M Salzsäure gefüllt, darf 'inkubieren "für 30 Minuten und dann vollständig mit Wasser wie oben gewaschen. Schließlich wird in derEnde 2-3 Wochen auszuwechseln, alle Abschnitte des Schlauchs werden mit neuen ersetzt, und die Kammer und Reservoirs werden mit 1,0 M HCl gereinigt, gefolgt von einem ausgiebigem Spülen mit destilliertem / deionisiertem Wasser. Sollte eine Verfärbung der Schlauch oder visuelle Einrichtung eines Wachstums in den Rohrleitungen oder ein beliebiges Element der Kammer / Stauseen, werden diese entweder ersetzt oder gegebenenfalls gründlich gereinigt. Bei regelmäßiger Reinigung und allgemeine Wartung, kann das Gerät dauern sehr lange. Zum Zeitpunkt des Schreibens, sind unser Schiff in ihre Kammern all den ^8. oder ^9. Jahr der routinemäßigen Einsatz und wir haben keinen nennenswerten Schwierigkeiten mit ihnen erlebt.

5. Repräsentative Ergebnisse

1A. Diese Zahl stellt den grundlegenden microvessel Stationierung. A = Fernsehen für die Anzeige Schiffes; B = digitale Messschieber, C = Spritze zum Schieben Superfusat through Zulauf Pipette notwendig, D = hydrostatische Säule zum Ändern Perfusat Zulaufdruck, E = Mikroskop; F = Mikrogefäßzellen Kammer; G = Superfusat Reservoir, H = Druckwächter (mehrfache können nach Bedarf hinzugefügt werden), I = Mikrogefäßzellen Kammer Entleerungspumpe für Superfusat, J = Äquilibrierung Gasgemisch Tank; K = Abfall enthalten (für Superfusat); L = Umlauf-Wasserheizer, M = anti-vibration/floating Tisch.

Abbildung 1B. Diese Zahl stellt einen genaueren Blick auf die microvessel Kammer-Setup. In dieser Figur, E = Mikroskop; F = Mikrogefäßzellen Kammer; H = Druckwächter (während wir nur eine der Einfachheit halber zeigen, können mehrere auf verschiedene Seiten nach Bedarf hinzugefügt werden), I = Mikrogefäßzellen Kammer Ablaufpumpe, N = Schlauch, den beigefügten Anfang des Perfusat Zufluss Pipette (eine Fortsetzung von 'D' in Abbildung 1A), O = Schlauch mit dem Perfusat Abfluss Pipette befestigt.

1C. Diese Zahl stellt den nächsten Blick auf die microvessel Kammer. In dieser Figur N = das Perfusat Leitung (dh Schlauch direkt zu dem Perfusat Zulauf Pipette befestigt), O = Schlauch direkt zu dem Perfusat Ablauf Pipette befestigt, P = die horizontale und vertikale Position Steuerelemente für das Einströmen Pipette, Q = die Superfusat Drain für das Wasserbad (verbunden mit "I" in den 1A und 1B), R = der Zufluss für das Wasserbad aus dem Reservoir (verbunden mit "G" in 1A).

2. Diese Figur zeigt eine schematische Darstellung des Flusses von Fluiden und Gasen in dem System. In dieser Figur ist A = PSS Superfusat Linie Zufluss; B = PSS Perfusat Linie um Zufluss Pipette; C = PSS Superfusat von Fachkräften aus Bad Abfallgebinde aufnehmen, D = PSS Perfusat-abfluss aus der Pipette Abfluss; E = erwärmte Wasser Eingang in die Kammer Jacke; F = erwärmte Wasser Ausgabe von Kammer-Jacke.

. Abbildung 3 Diese Zahl stellt individuelle Krawatte Schleife von ophthalmologischen Naht (angezeigt durch ein Binokular mit 10x Okularen 4.5x und einer einstellbaren Zoom-Vergrößerung; Panel A) hergestellt, die in unserer Vorbereitung verwendet werden und die Lagerung von mehreren Schleifen binden 8-0 und 10-0 Naht am umgekehrt Klebeband um einen Objektträger, die in einem überdachten Petrischale aufbewahrt wird (nicht zu verlieren; Panel B).

Abbildung 4. Diese Zahl liefert ein Bild (betrachtet über einen Standard-Binokular) des M. gracilis Widerstand Arteriole vor der chirurgischen Entfernung und Isolation, um eine ordnungsgemäße räumliche Orientierung zu ermöglichen.

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Abbildung 5. Diese Zahl liefert ein repräsentatives Bild eines kanülierten microvessel. Abbildung A zeigt die gesamte Länge des Gefäßes, sowohl mit Zulauf (A) und Ablauf (B) Pipetten sowie Schlaufen binden (C) gezeigt. Tafel B zeigt ein Bild mit einer hohen Vergrößerung, die deutlich die Bestimmung des arteriellen Innendurchmesser mit den digitalen Messschieber (in diesem Fall der Durchmesser von 112 um).

6. Diese Figur zeigt repräsentative Bilder eines durchbohrt Mikrogefäßzellen folgenden Äquilibrierung. Das obere Bild ist von einem Schiff unter Kontrolle, nicht stimulierten Bedingungen an der Äquilibrierung Druck, ist das mittlere Bild des gleichen Schiffes nach Dilatation mit Acetylcholin (10 ^-6 M in der Badewanne) herausfordern, und das untere Bild ist von diesem Schiff nach constriction, um mit Phenylephrin (10 ^-7 M im Bad) herauszufordern.

. 7 Diese Figur werden die Reaktionen eines isolierten Mikrogefäßzellen in Reaktion auf ein Match mit: Hypoxie (Feld A, eine Verringerung Perfusat und Superfusat PO ₂ in unserem System von ~ 135 mm Hg bis ~ 40 mmHg), steigenden Konzentrationen von Acetylcholin (Panel B), Änderungen in der intravaskulären Druck unter Kontrollbedingungen und nach der Inkubation des Schiffes mit einem Calcium-freier PSS (Panel C).

Discussion

Das Protokoll beschreibt die Isolierung dargestellt, Entfernen und Doppel-Kanülierung eines Skelettmuskels Mikrogefäßzellen, obwohl diese allgemeine Technik kann einfach in die meisten Gewebe aufgebracht werden. Für das laufende Manuskript hat der Begriff "Arteriole" von den Autoren verwendet worden, um einen Widerstand im Bereich zwischen 70-120 Schiff um Durchmesser unter Ruhebedingungen aktiven Ton, der auch ein wesentlicher Faktor für die Regulierung der Durchblutung Widerstand gegen ein Organ oder beschreiben Gewebe.

Mit einigen Modifikationen kann dieses System, um mehrere Anwendungen für die spezielle Ermittler eingesetzt werden und ermöglicht sehr einfach die für den Einbau von zusätzlichen Techniken, um mehr in die Tiefe Experimente (z. B. Verwendung von Transmembran-Elektroden zur Bestimmung des Membranpotentials ¹⁷⁾ liefern. Ein entscheidender Schritt in der Basis-Zubereitung ist immer versichert, dass die Zu-und Abfluss Pipetten, mit denen das Schiff kanülieren sind gut aufeinander abgestimmt sind, klar bleiben, und lassenDurchfluss und Druck, um auf eine einfache Weise aufrechterhalten werden. Wenn die Pipetten verstopft mit kleinen Trümmer werden, kann es notwendig sein zu brechen sehr kleine Stücke der Spitzen zu fließen wiederherzustellen. Wenn der Prüfer ist Vorsicht, Pipetten mehrere Male wiederverwendet werden, bis sie einen Punkt, wo sie entweder nicht verstopft werden kann oder die Durchmesser so groß, dass Kanülierung des Schiffes extrem schwer zu erreichen. Doch mit Beherrschung dieser chirurgischen und experimentelle Vorbereitung, viel Liebe zum Detail, und die entsprechenden Anpassungen auf die spezifischen Bedingungen und Anforderungen anzupassen, können Ermittler leicht zu bewerten Wege Bestimmung Gefäßreagibilität als Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und pharmakologischen Herausforderungen. Diese Vorbereitung kann so auch der Ermittler zu grundlegenden Analysen über etwaige Änderungen der Gefäßwand Mechanik unter den Bedingungen von keinem aktiven Ton ¹⁴ durchzuführen. Dies ist tatsächlich eine sehr leistungsstarke und anpassungsfähige Technik und es ist eines, dasskann ohne weiteres für Applikationen über das Spektrum der detaillierten mechanistischen Studie zu High-Throughput-Screenings von mehr grundlegende Reaktionen verwendet werden.