Det Ex vivo Isolert Skeletal Microvessel Forberedelse for etterforskning av vaskulær reaktivitet

Summary

En

Abstract

Den isolerte microvessel preparatet er en ex vivo forberedelse som gjør det mulig for undersøkelse av de ulike bidrag fra faktorer som kontrollerer fartøy diameter, og dermed perfusjon motstand ^1-5. Dette er en klassisk eksperimentell forberedelse som var, i stor grad, først beskrevet av Uchida m.fl. ¹⁵ flere tiår siden. Denne første beskrivelsen gitt grunnlag for teknikkene som ble omfattende endret og forbedret, først og fremst i laboratoriet av Dr. Brian Duling ved University of Virginia ^6-8, og vi presenterer en aktuell tilnærming i de følgende sidene. Dette preparatet vil spesielt henvise til gracilis arteriole i en rotte som microvessel av valget, men den grunnleggende forberedelse kan lett brukes på skip isolert fra nesten alle andre vev eller organ på tvers av arter ^9-13. Mekanisk (dvs. dimensjonal) endringer i den isolerte microvessels lett kan vurderessom svar på et bredt spekter av fysiologiske (f.eks hypoksi, intravaskulær press, eller skjær) eller farmakologisk utfordringer, og kan gi innsikt i mekanistiske elementer består integrert respons i en intakt, selv ex vivo, vev. Betydningen av denne metoden er at det gir mulighet for lettvinte manipulasjon av påvirkninger på den integrerte regulering av microvessel diameter, mens også noe som åpner for kontroll over mange av bidrag fra andre kilder, inkludert intravaskulært trykk (myogenic), autonome innervasjon, hemodynamiske ( f.eks skjærspenning), endotelceller avhengige eller uavhengige stimuli, hormonelle og parenkymatøs påvirkninger, for å gi en ufullstendig liste. Under egnede eksperimentelle forhold og med passende mål, kan dette tjene som en fordel fremfor in vivo eller in situ vev / organ preparater, som ikke lett lar for lettvinte kontroll av bredere systemiske variabler.

MAJor begrensning av dette preparatet er egentlig konsekvensen av sine styrker. Per definisjon er oppførselen til disse fartøyene blir studert under forhold hvor mange av de mest betydelige bidragsyterne til regulering av vaskulær motstand har blitt fjernet, inkludert neural, humoral, metabolsk, osv. Som sådan er det etterforskeren advares mot å over- tolkning og ekstrapolering av dataene som samles utnytte dette preparatet. Den andre betydelige område av bekymring med hensyn til dette preparatet er at det kan være veldig lett å skade cellulære komponenter som endotelial fôr eller vaskulær glatt muskulatur, kan slik at variable feilkilde bli innført. Det anbefales sterkt at den enkelte etterforsker utnytte egnede målinger for å sikre kvaliteten på forberedelse, både ved oppstart av forsøket og regelmessig i løpet av en protokoll.

Protocol

1. Før Experiment

1. Før eksperimentet dagen, glass kapillærrør for de aktuelle dimensjoner for stasjonen trukket inn mikropipetter (enten en horisontal eller vertikal avtrekker kan brukes). Spissen diameter kan lett justeres avhengig av fartøy som blir isolert, selv om vi vanligvis bruker en diameter på mellom 50-150 mikrometer. Disse blir deretter bøyd til riktig konfigurasjon for microvessel stasjonen følgende oppvarming over en butan flamme. Mikropipette tips er fysisk brutt til den omtrentlige diameter (med fine tang) for microvessel i spørsmålet og kan bakken eller polert til de aktuelle konformasjonen, som er nødvendige for den spesifikke applikasjonen. For en omfattende og enestående omtale om disse prosedyrene, blir leseren rettet mot Davis et al. ^16. To mikropipetter blir så plassert i opposisjon til pipetten holdere for microvessel kammeret. Disse må orientert slik at tipseneer i samme vertikale og horisontale planet innenfor fartøyet kammeret.
   Den microvessel kammer brukes i dette manuskriptet (figur 1 og 2) er en som er tilpasset bygget av Mr. David Eick i Avdeling for fysiologi ved Medical College of Wisconsin ( http://www.phys.mcw.edu/ og www . eicktech.com ). Men flere andre konfigurasjoner av microvessel kammeret er lett kommersielt tilgjengelig, med de utviklet av levende systemer Instrumentation ( http://www.livingsys.com/ ) og IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) er svært vanlig. Ved hjelp av disse andre systemer, kan det være viktig å utnytte en invertert mikroskop istedenfor en vanlig oppreist en, men dette er avhengig av den spesifikke forsøket og utstyr. Bruken av innovervendte mikroskop ville være å foretrekke for eksperimentell protocOLS krever lysstoffrør eller confocal bildebehandling.
2. Forbered en fysiologisk salt-løsning (PSS, beskrevet nedenfor), og sørge for pH er satt til passende nivå for de spesifikke eksperimentelle forhold (7,38 til 7,42 er typisk og faller innenfor fysiologisk rekkevidde). Den PSS Løsningen kan være forberedt på forhånd og nedkjølt, men må sjekkes ved riktig temperatur for pH før bruk. PSS kan inneholde albumin hvis eksperimentator eller spesifikke protokoller krever det, men dette er ikke universelt obligatorisk.
3. De digitale video calipers brukes til å måle fartøyet diameter bør kalibreres ved hjelp av en hemocytometer eller mikroskop scenen mikrometer. For nøyaktig kalibrering, er det viktig at mikrometer bli plassert i samme plan som tilsig / utstrømning mikropipetter i fartøyet kammeret.
4. Tie sløyfer for å feste microvessel til pipetter bør være forberedt og være lett tilgjengelig for senere bruk. Disse kan lett bli utarbeidet 8-0 eller mindre oftalmologiske suture. Singelen tie sløyfe kan tilberedes på forhånd og oppbevares i en tildekket petriskål på en liten stripe av tilbakeførte tape rundt et objektglass inntil nødvendig (dette vil holde dem fra å bli tapt). (Figur 3).

2. Day of the Experiment

1. All støtte utstyr skal være slått på og sjekket for riktig funksjon. Dette inkluderer anti-vibration/floating bordet og sirkulerende oppvarmet vannbad (satt for å gi riktig temperatur i karet bad - ofte 37 ° C), alle trykket transdusere og fartøyet kammeret tømmepumpen (Figur 1A og 1B). Slå på ekvilibrering gasser i fartøyet kammer og i perfusate og superfusate reservoarer.
2. Fyll alle reservoarene, rør, og kammer med PSS løsningen. Den perfusate linjen som førte til tilsiget pipetten må være fullstendig utfylt for å unngå tilstedeværelse av luftbobler i denne linjen som kan løsne og skade vascular endotelet (figur 1C). Du kan eventuelt bruke en sprøyte til å forsiktig dytte PSS hele veien gjennom pipette for å sikre at det er helt full og uten noen blokkering som kan hindre perfusate flyt. Tilsiget trykket bør holdes innenfor rimelighetens grenser for å unngå å skade trykket svingere.

3. Microvessel Høsting

1. Etter bedøvelse av dyret som den microvessel er å bli tatt, bør det aktuelle fartøyet isoleres i henhold til de prosedyrer som er mest hensiktsmessig å blodkar å bli undersøkt. I noen tilfeller kan dette kreve fjerning av orgelet selv (f.eks cerebrale eller koronar microvessels), mens i andre, kan fartøy tas ut direkte fra bedøvet dyret (f.eks muskel). Et eksempel på retningen av fartøyet innenfor gracilis muskelen er presentert i figur 4. Beregn lengden av fartøyet in vivo før fjerning med forsteinsopp eller små skyvelære. Før fjerning av fartøyet fra dyret / organ, kan det være svært nyttig å utføre en siste sjekk for å være sikker på at fartøyet kammeret er klar og fungerer (inkludert alle tie sløyfer på plass).
2. Fjern fartøyet fra dyret / orgel ved å ta tak utsiden av fartøyet i den ene enden med fine tang og klippe langs lengden av skipet før det er gratis og tar ekstrem forsiktighet for å unngå å rykke eller dra på fartøyet. Når frigjort, umiddelbart legge den i en 1,7 mL sentrifugerør fylt med PSS, men ikke la gå av fartøyet. Dette er å huske retningen, vil slik at perfusate retningen i badekaret være identisk med blodstrømmen retning i dyret.

4. Cannulating fartøyet

1. Plasser fartøy i den fylte badekaret og cannulate den proksimale enden på tilsiget pipetten. Dette kan best oppnås med et beskjedent perfusjon rente gjennom kanylen (~ 50 mmHg trykk) oget par av fine tang brukes til å holde hver side av proksimale fartøyet lumen vegg (dvs. en pinsett i hver hånd). I vårt laboratorium, bruker vi fin pinsett fra fine Science Tools ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), selv om noen riktig konstruerte tang vil fungere effektivt. Sett båten på kanylen tips og avansere fartøyet på tuppen til et punkt hvor to tie sløyfer kan sikre fartøy.
2. Hev tilsiget trykket til ~ 75 mmHg til ytterligere blåse fartøyet og lette kanylering på distale pipettespissen. Flow gjennom fartøyet bør sees som en forvrengning i superfusate reservoaret ved distal utstrømningen av fartøyet (under mikroskop). Cannulate den distale enden av fartøyet på utstrømningen pipetten og fest den med to tie sløyfer (disse siste loopene må være på plass før kanylering, figur 5).
3. Juster kanylen frem i XYZ koordinater som nyankommended inntil det er minimal forvrengning i fartøyet, og fartøyet tilnærmet in vivo lengden. Hev tilsiget trykket til den er tilnærmet prosentandel av gjennomsnittlig arterietrykk normalt oppleves av at fartøyet segment (vårt laboratorium benytter 80% av gjennomsnittlig arterietrykk for de store motstanden arteriolene av gracilis muskel ^8).
4. Plasser en liten boble stein levere den aktuelle gassblandingen på bad og plass plastfolie eller et glass deksel over kammeret for å unngå sprut mikroskopet linsen. Vi bruker en boblende stein som er allment tilgjengelig på hele PET / akvarium butikker og er ca 1 cm i diameter, selv om en mindre størrelse vil fungere effektivt også. Tilstedeværelsen av boblende stein sikrer hensiktsmessig gass tilgjengeligheten til fartøyet til enhver tid, og vil utvide fartøy levedyktighet. Denne steinen er fjernet i løpet av alle målinger perioder (eller luftstrøm gjennom steinen midlertidig avbrutt) for å hindre fordreining avimage. Slipp klemmen på utstrømningen pipette og la strømme gjennom fartøyet i 30 minutter. Med jevne mellomrom bør flyten bli klemt fast ved utløpet slangen for å fastslå om fartøyet utvikler hvile tone. Alle fartøy må sjekkes for trykk lekkasjer på dette punktet. Lekkasjer vil bli tydelig ved å introdusere et kjent trykk i beholderen (vi vanligvis bruker 100-120 mmHg) og klemmer fast utstrømningen, etterfulgt av tilsiget, linjer. Hvis intraluminal trykket er stabilt, er det ingen merkbare lekkasjer. Men hvis trykket begynner å falle, er en betydelig lekkasje til stede og må lukkes. Lekkasjer ved enten tilsiget eller utstrømmende pipetter kan normalt rettes opp ved å legge en ekstra sløyfe knyttet rundt fartøyet på pipetten. Alternativt, hvis et fartøy har en liten sidegren som er slik at lekkasjen, vil dette svekke evnen av fartøyet å inneholde press effektivt og kan innføre en ekstra kilde for feil. Hvis denne lekkasjen er identifisert, kan det normalt være bundet av wed en enkelt sløyfe med 10-0 opthalmic sutur. Alternativt er en enkelt strand ertet 6-0 sutur for å gjøre slipset løkke også svært effektive. Dersom lekkasjen ikke kan identifiseres eller ikke kan effektivt bundet av (f.eks, er det ingen trunk til sidegren og slett et hull i åreveggen), kan dette resultere i en for tidlig avslutning av forsøket og bruk av en alternativ fartøy blir nødvendig (dette er vanligvis den identiske fartøy i det andre beinet - eller motsatt side om nødvendig - av dyret).
   
   Fartøyet skal få lov til å stabilisere seg under ingen strømningsforhold i minst 30 minutter. Alle forsøk er utført under noen strømningsforhold. Når fartøyet har utviklet tilfredsstillende tone og er lydhør overfor inklusjonskriteriene for forsøket i spørsmålet, er fartøyet klar for senere studie.
   
   Disse inklusjonskriterier kan variere avhengig av spesifikke forsøksprotokoll og etterforsker. I vårt laboratorium, vi rutinemessig utilize følgende:
   1. Aktiv tone av> 30% (beregnet som ΔD / D _max 100 x, hvor ΔD er økningen i arteriolar indre vegg diameter fra verdiene under ekvilibrering press som svar på eksponering for Ca ^{2 +-free} PSS og D _max er den maksimale diameter målt ved likevekt trykket i Ca ^{2 +-frie} PSS).
   2. Myogenic aktivering (vedlikehold av, eller helst en reduksjon i, arteriolar diameter med økt intraluminal trykk) som en indeks av en levedyktig vaskulær glatt muskulatur lag.
   3. En levedyktig endotelial fôr, som dokumentert av en rask dilator respons på acetylkolin (10 ^-6 M i badekaret).
   4. Ytterligere inklusjonskriterier kan legges for å passe den spesifikke forsøksprotokoll som trengs, inkludert constrictor svar adrenerge agonister som fenylefrin (10 ^-7 M), dilator svar på ytterligere stimuli som adenosin (10 ^-5 2 i likevekt gass).
5. Følgende avsnitt er et eksempel på en "mock eksperiment". Alle nødvendige løsninger er utarbeidet som hensiktsmessig, med oppmerksomhet på kontoen fortynningsfaktoren av PSS i fartøyet kammeret. Som et eksempel, for noe av utstyret vårt, er volumet av skipet kammeret 20 ml. Som sådan, 20 mL av en 10 ^-2 M stamløsning resulterer i en effektiv konsentrasjon av 10 ^-5 M i fartøyet kammeret bad. Etter fartøy fjerning, kanylering, likevekt og validering som beskrevet ovenfor, er forsøket klar til å starte. Spesielt for eksempel behandling randomisering og effektivitet er eksperiment spesifikke og ville forbruke overdreven plass til dette arbeidet. Som sådan, er disse ikke inkludert i detalj.
   
   Innledende kontroll svar bestemmes. For et eksempel fysiologiske stimulans som myogenic aktivering (trykk-indusert innsnevring), intralumenal prEssure er tilfeldig endres over ønsket område, og fartøyet kan en passende frist til å svare (i dette tilfellet, ville vi tillate en 5-7 minutters periode). For et eksempel farmakologiske stimulans som utfordring med acetylkolin, er stoffet lagt til baksiden fra lager løsninger i en tilfeldig rekkefølge. I dette tilfellet ville vi normalt bruker et område fra 10 ^-9 til 10 ^-5 M i badekaret, med utvasking blir definert som en gjenopprettelse av likevekt diameter. Som acetylkolin er en hurtigvirkende agent, kan maksimal dilator responser lett oppnås på bare noen få sekunder. Andre midler (for eksempel peptider) kan ta mye lengre tid å lokke fram en maksimal respons og dette mye tas hensyn til, samt tidsperioden tatt for effektiv utvasking. Når kontroll svar har blitt samlet inn, kan spesifikke intervensjoner pålegges systemet, inkludert inkubasjon av fartøyet med reseptoragonister / antagonister, agenter opptrer på bestemte ionekanaler, initiativendret intraluminal press, forskjeller i likevekt gasser eller farmakologiske agenter rettet mot bestemte enzymatiske systemer, for å nevne noen av de vanligste inngrepene.
   
   Etter en passende tid for intervensjon for å være effektive (som bør testes hensiktsmessig), kan en etterfølgende runde med datainnsamling igangsettes. Avhengig av den konkrete forsøksprotokoll, kan påfølgende intervensjoner bli pålagt fartøyet eller første kan fjernes (enten ved utvasking - når mulig - eller enkel fjerning av fysiologisk utfordringen). Når fartøyet har returnert til sin likevekt tilstand (som bør verifiseres), kan etterfølgende intervensjoner brukes etter behov med flere data samles inn. Denne generelle prosedyren ville bli videreført inntil avslutning av forsøket eller til kvaliteten av fartøyet forberedelse faller under tidligere fastsatte grenseverdier kriterier (f.eks svar på en agonist eller evnen til å utvikle tilstrekkelig aktiv tone). På dette punktet, er forsøket enten avsluttet eller undersøkeren kan ønske å samle inn data som er uavhengig av reaktiviteten av den isolerte fartøy (som mekanikken i åreveggen, som kan bli utført med identisk fremgangsmåte av myogenic aktivering, bare med et fartøy som mangler alle aktive tone ^14).
6. Regelmessig rengjøring av alt av utstyr er avgjørende for fjerning av salt buildup og forebygging av veksten av eventuelle uønskede biologiske enheter. På slutten av hver eksperiment dag, på et minimum, blir alle linjer og kammer helt skylles av PSS med rikelige mengder destillert eller de-ionisert vann og lov til å tørke helt. Etter hver 2-3 dagers bruk, er en vask med etylalkohol utført som godt og utstyret er lov å tørke helt. På slutten av hver uke konsekvent bruk, blir alle linjer og kammer fylt med 0,1 M saltsyre, lov til å "ruge" i 30 minutter og deretter vasket fullt med vann som over. Til slutt, vedslutten av 2-3 ukers sammenhengende bruk, er alle deler av rør erstattes med nye og kammeret og reservoarene blir rengjort med 1,0 M HCl etterfulgt av en omfattende skylling med destillert / de-ionisert vann. Hvis noen misfarging av slange eller visuell etablering av en vekst i slangen eller noe element i kammeret / reservoarene, er disse enten skiftes ut eller rengjøres etter behov. Med jevnlig rengjøring og generelt vedlikehold, kan utstyret vare veldig lenge. I skrivende stund, våre fartøyer kamre er alt i sin ^8. eller ^9. år av rutinemessig bruk og vi har opplevd noen betydelige problemer med dem.

5. Representative Resultater

Figur 1A. Dette tallet presenterer grunnleggende microvessel Stasjonsoppsett. A = TV for visning av fartøy, B = digitale calipers; C = sprøyte for å skyve superfusate through tilsig pipette som nødvendig; D = hydrostatisk kolonnen for endring perfusate tilsig press; E = mikroskop, F = microvessel kammer; G = superfusate reservoaret; H = trykkmonitor (multiple kan legges ved behov), jeg = microvessel kammer avløpspumpe for superfusate; J = ekvilibrering gassblanding tank, K = avfall som finnes (for superfusate); L = sirkulerende varmtvannsbereder, M = anti-vibration/floating tabellen.

Figur 1B. Dette tallet presenterer en nærmere oversikt over microvessel kammeret oppsettet. I dette tallet, E = mikroskop, F = microvessel kammer; H = trykkmonitor (mens vi bare viser én for enkelhet, kan flere bli lagt til ulike nettsteder som nødvendig), jeg = microvessel kammer tømmepumpen; N = slange festet til Helt i begynnelsen av perfusate tilsig pipetten (en fortsettelse fra 'D' i figur 1A); O = slange festet til perfusate utstrømningen pipetten.

Figur 1C. Dette tallet presenterer nærmeste visningen av microvessel kammeret. I dette tallet, N = den perfusate linjen (dvs. slange festet direkte til perfusate tilsiget pipetten); O = slangen festet direkte til perfusate utstrømningen pipetten, P = de horisontale og vertikale plassering kontroller for innstrømningen pipetten, Q = superfusate tømme for vannbad (koblet til 'jeg' i figur 1A og 1B), R = innstrømningen til vannbad kommer fra reservoaret (koblet til "G" i figur 1A).

Figur 2. Dette tallet presenterer en skjematisk fremstilling av flyt av væsker og gasser i systemet. I dette tallet, A = PSS superfusate linje tilsig, B = PSS perfusate linje til tilsig pipette, C = PSS superfusate avløp fra bad til avfallsbeholder, D = PSS perfusate utstrømningen fra utstrømningen pipette; E = oppvarmet vann innspill til kammeret jakke; F = oppvarmet vann ut fra kammer jakke.

. Figur 3. Denne figuren viser individuell slipset looper laget av oftalmologiske sutur (sett gjennom en dissekere mikroskop med 10x okularer og en 4,5 ganger justerbar zoom forstørrelsen, panel A) som brukes i forberedelse vår og lagring av flere slips løkker 8-0 og 10-0 sutur på reversert tape rundt et objektglass som er lagret i en overbygd petriskål (for å unngå å miste dem, Panel B).

Figur 4. Dette tallet gir et bilde (sett gjennom en standard dissekere mikroskop) av gracilis muskel motstand arteriole før kirurgisk isolasjon og fjerning for å tillate riktig romlig orientering.

ve_content ">
Figur 5. Dette tallet gir et representativt bilde av en cannulated microvessel. Panel A viser hele lengden av skipet, med både tilsig (A) og utstrømning (B) pipetter samt slips buer (C) vist. Panel B viser et bilde på en stor forstørrelse, som tydelig viser fastsettelsen av arteriolar indre diameter med de digitale kalipperne (i dette tilfellet diameteren er 112 mikrometer).

Figur 6. Dette tallet presenterer representative bilder av en cannulated microvessel følgende likevekt. Toppen bildet er av et fartøy under kontroll, unstimulated forholdene ved likevekt trykket, er midt bildet av samme fartøy som følger dilatasjon å utfordre med acetylkolin (10 ^-6 M i badekaret), og den nederste bildet er av at fartøy som følger constriction å utfordre med fenylefrin (10 ^-7 M i badekaret).

. Figur 7 Dette tallet oppsummerer svarene på en isolert microvessel i respons til å utfordre med: hypoksi (Panel A, en reduksjon i perfusate og superfusate PO ₂ i vårt system fra ~ 135 mmHg til ~ 40 mmHg), økende konsentrasjoner av acetylkolin (panel B), endringer i intravaskulær trykket under kontroll forhold og etter inkubasjon av fartøyet med en kalsium-free PSS (Panel C).

Discussion

Protokollen presenterte beskriver isolasjon, fjerning og dobbel kanylering av en skjelettmuskulatur microvessel, selv om denne generelle teknikken kan lett brukes på de fleste vev. For den nåværende manuskriptet, har begrepet «arteriole» blitt brukt av forfatterne å beskrive en motstand fartøy varierer mellom 70-120 mikrometer i diameter mindre enn hvile aktiv tone, som også er en stor bidragsyter til regulering av perfusjons motstand mot et organ eller vev.

Med noen modifikasjoner, kan dette systemet monteres flere programmer for spesifikke etterforsker og lett åpner for inkorporering av ytterligere teknikker for å gi mer i dybden eksperimentering (f.eks bruk av transmembrane elektroder for bestemmelse av membranpotensiale ^17). Et kritisk punkt i grunnleggende forberedelser er alltid forsikre at innstrømningen og utstrømningen pipetter som brukes til å cannulate fartøyet er godt matchet, forbli klart, og laflyt og trykket skal opprettholdes på en lettvinte måte. Når pipetter blir tilstoppet med liten biter av rusk, kan det være nødvendig å bryte av svært små biter av tipsene for å gjenopprette flyt. Hvis etterforskeren er forsiktig, kan pipetter brukes om igjen flere ganger før de når et punkt der de enten ikke kan unclogged eller diameter tilstrekkelig store at kanylering av fartøyet blir ekstremt vanskelig. Men med mestring av dette kirurgisk og eksperimentell forberedelse, nøye på detaljer, og de aktuelle modifikasjoner for å passe bestemte vilkår og krav, kan etterforskerne lett vurdere trasé som bestemmer vaskulær reaktivitet i respons til en myriade av fysiologiske og farmakologiske utfordringer. Dette preparatet vil også tillate undersøkeren å utføre grunnleggende analyser på endringer til vaskulære vegg mekanikk under forhold med ingen aktiv tone ^14. Dette er faktisk en veldig kraftig og tilpasningsdyktig teknikk, og det er en somkan lett brukes for søknader spenner utvalget av detaljerte mekanistiske studier til high-throughput visninger av mer grunnleggende tiltak.