Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التحقيق في الالتهابات المعوية الناجمة عن مفاجآت صيف دبي موديل IBD

doi: 10.3791/3678 Published: February 1, 2012

Summary

وقد سمحت نماذج تجريبية لمرض التهاب الامعاء لنا لدراسة معقدة الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية المرتبطة المرضية. باستخدام سجل النسيجية ، وتحديد حجم السيتوكينات الموالية للالتهابات ونشاط الميلوبيروكسيديز ، يمكن للمرء أن يبدأ في تقييم هذه الاستجابات ينظر في مرض التهاب الامعاء.

Abstract

مرض التهاب الأمعاء ويشمل مجموعة من الأمراض المعوية ، وأكثرها شيوعا من التهاب القولون التقرحي التي هي (جامعة كاليفورنيا) ومرض كرون (CD). كل من جامعة كاليفورنيا ونزع السلاح ، عندما تكون موجودة في القولون ، وتولد لمحة أعراض مماثلة التي يمكن أن تشمل الإسهال ونزيف المستقيم ، وآلام في البطن ، وفقدان الوزن. 1 على الرغم من أن التسبب في التهاب الامعاء ما زال مجهولا ، وصفت بأنها المرض متعدد العوامل التي تنطوي على حد سواء المكونات الوراثية والبيئية. 2

هناك العديد من النماذج الحيوانية ومتغيرة من التهاب القولون التي تشبه العديد من الميزات من مرض التهاب الأمعاء. نماذج حيوانية لمجموعة القولون من تلك التي تنشأ بشكل عفوي في سلالات عرضة لأنواع معينة لتلك الادارة التي تتطلب تركيزات معينة من التهاب القولون الذي يحفز المواد الكيميائية ، مثل كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS). الكيميائية الناجمة عن نماذج من التهاب القناة الهضمية هي النماذج الأكثر شيوعا وأفضل وصف لمرض التهاب الأمعاء. Administration لمفاجآت صيف دبي في مياه الشرب تنتج التهاب القولون الحاد أو المزمن بالاعتماد على بروتوكول الإدارة. الحيوانات التي اعطيت 3 مفاجآت صيف دبي وفقدان الوزن ويحمل علامات البراز فضفاضة أو الاسهال ، وأحيانا مع أدلة على نزيف المستقيم. 4،5 وهنا ، نحن تصف الطرق التي ويمكن وصف التهاب القولون التنمية والاستجابة الالتهابية الناجمة الادارة التالية من مفاجآت صيف دبي. وتشمل هذه الطرق التحليل النسيجي للالهيماتوكسيلين / يوزين المقاطع القولون الملون ، وقياس السيتوكينات الموالية للالتهابات ، وتحديد الميلوبيروكسيديز (MPO) النشاط ، والتي يمكن استخدامها كمؤشر بديل من الالتهابات. 6

ويمكن تقييم مدى استجابة التهابية في حالة المرض عن طريق وجود أعراض سريرية أو تغيير في الأنسجة المخاطية في الأنسجة. ويتم تقييم الأضرار النسيجية القولون باستخدام نظام التهديف التي تعتبر خسارة سرداب العمارة ، التهابات تسلل خلية ، ر العضلاتhickening ، القدح نضوب الخلية ، وسرداب خراج 7 من الناحية الكمية ، يمكن تحديد مستويات السيتوكينات الموالية للالتهابات مع خصائص الالتهابية الحادة ، مثل انترلوكين (IL) ، 1β ، IL - 6 وعامل نخر الورم (TNF) - α ، وذلك باستخدام الطرق التقليدية ELISA. بالإضافة ، يمكن قياس النشاط MPO باستخدام مقايسة اللونية واستخدامها وذلك في مؤشر الالتهاب. 8

في التهاب القولون التجريبية ، ويرتبط في كثير من الأحيان شدة المرض مع زيادة في النشاط MPO ومستويات أعلى من السيتوكينات الموالية للالتهابات. ويمكن تقييم شدة التهاب القولون والتهاب المرتبطة الضرر عن طريق فحص البراز الاتساق والنزيف ، بالإضافة إلى تقييم حالة الأنسجة من الأمعاء باستخدام الهيماتوكسيلين / يوزين ملطخة المقاطع انسجة القولون. ويمكن استخدام أجزاء أنسجة القولون لتحديد النشاط والانتاج MPO خلوى. أخذت معا ، ويمكن استخدام هذه التدابير لتقييم الاستجابة الالتهابية في الأمعاءنماذج حيوانية لالتهاب القولون التجريبية.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. نموذج الفئران لمفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون الحاد

  1. ديكستران إضافة كبريتات الصوديوم (DSS) لمياه الشرب لتعقيمها التركيز النهائي المطلوب (1-5 ٪) (وزن / المجلد) (أي لجعل الحل مفاجآت صيف دبي بنسبة 5 ٪ ، إضافة 25 ملغ من مسحوق مفاجآت صيف دبي إلى 500 مل من الماء تعقيمها) . يمكن ترك حل السهم عند درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. في غطاء السلامة الأحيائية ، من أجل حل الأسهم مفاجآت صيف دبي في 50 مل من أنابيب فالكون (احد في حاجة في القفص). الحفاظ على المخزون حل لأنابيب الملء عند الحاجة.
  3. يحل محل مياه الشرب في كل قفص الفأر مع الحل مفاجآت صيف دبي (في أنابيب فالكون 50 مل) (ستكون مدة تعتمد على نظام مفاجآت صيف دبي التي يتم استخدامها ، فعلى سبيل المثال ، باستخدام 6-8 الاسبوع C57BL الذكور القديمة / 6 الفئران ، ونحن تدير 5 ٪ حل مفاجآت صيف دبي ليصبح المجموع خمسة أيام). وينبغي أن الفئران لم تتمكن من الوصول إلى أي مصدر للمياه أخرى. تعطى الفئران التحكم تعقيمها مياه الشرب دون مفاجآت صيف دبي.
  4. وزن الفئران يوميا ، وسجل المبلغ لمفاجآت صيف دبي تستهلك في اليوم الواحد. أعلى كللزجاجة 50 مل بعد تسجيل مستويات مفاجآت صيف دبي. هذا هو لقياس حجم تقريبي لمفاجآت صيف دبي تستهلك في قفص في الماوس طوال فترة التجربة. في دراستنا ، ونحن نستخدم حل مفاجآت صيف دبي بنسبة 5 ٪ لمدة 5 أيام مع C57BL ذكور / 6 الفئران. وينظر الى نقص ملحوظ في الوزن ، تغيير قوام البراز والدم البراز علامات في وقت مبكر يوم 3 باستخدام هذا النظام مفاجآت صيف دبي خاصة. أثناء إدارة مفاجآت صيف دبي ، والفئران يحمل وضوحا وفقدان الوزن (حوالي 5-10 ٪ من وزنهم الأولى يوم 5) مع فقدان الوزن أكثر من 20 ٪ من وزنه الأولي مع الجفاف والإسهال أن تكون مؤشرا هاما الفسيولوجية التي هي في حيوان أو بالقرب من نقطة النهاية. إذا أعطيت الحيوان الوصول إلى المياه الطبيعية بعد 5 أيام من مفاجآت صيف دبي بنسبة 5 ٪ ، وسوف تسترد في غضون 7 أيام. يجب الموافقة على جميع التجارب من قبل المؤسسة لجنة أخلاقيات الحيوان ويكون وفقا للبروتوكول استخدام الحيوان المعتمدة (AUP).
  5. خلال فترة التجربة ، وهو مؤشر نشاط المرض (DAI)ويمكن تقييم درجة لتقييم التقدم السريري للالتهاب القولون. داي هو النتيجة المجمعة لفقدان الوزن مقارنة الوزن الأولي ، والاتساق ، البراز ، ونزيف. ويتم تعريف العشرات على النحو التالي : فقدان الوزن : 0 (أي خسارة) (1) ، (1-5 ٪) ، 2 (5-10 ٪) و 3 (10-20 ٪) ، و 4 (> 20 ٪) ؛ اتساق البراز : 0 (عادي) ، 2 (البراز فضفاض) ، و 4 (الاسهال) ، والنزف : 0 (أي الدم) ، 1 (Hemoccult إيجابية) ، 2 (بيليه Hemoccult نزيف إيجابية والبصرية) ، و 4 (نزيف الإجمالي ، والدم في جميع أنحاء فتحة الشرج). يمكن سجل DAI اليومية خلال فترة علاج مفاجآت صيف دبي.
  6. عند نقطة وقت الاختيار ، وتزن التضحية الفئران. يمكن أن يتم التخلص الفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد استنشاق isoflurane أسلوب آخر أو منشأة الحيوانية التي وافقت عليها المؤسسة.

2. جمع عينات من أنسجة القولون

  1. كشف الجانب البطني للحيوان والرطب في منطقة البطن بمحلول الإيثانول 70 ٪. عند هذه النقطة ، تشير إلى الجدول (1) وجعل علمانيويورك علامات النزف المستقيمي (الحالي الدم في فتحة الشرج) أو هبوط المستقيم في كل حيوان.
  2. استخدام معيار لمقص تشريح شق البطن عن طريق شق بطني خط الوسط.
  3. تحديد موقع القولون والقولون القطع أقرب إلى الهامش القولون ممكن لاطلاق سراح القولون القاصي.
  4. بعناية وببطء سحب القولون بأكمله ، فصلها من مساريق المحيطة بها.
  5. المسح الشامل للقولون على هامش colonocecal لتحرير نهاية القريبة من القولون. ويمكن إزالة البراز من قبل الشطف القولون مع برنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام إبرة بالتزقيم تعلق على حقنة مل 3 أو 5 أو عن طريق الضغط بعناية من ذلك باستخدام زوج من ملاقط عازمة / ملقط. باستخدام القولون بأكمله ، وتقييم للأضرار (انظر القسم 3.1)
  6. ويمكن أن يتم أخذ عينات الأنسجة للتحليل النسيجي وفحوصات أخرى عن طريق خفض 0.5 سم إلى 1.0 سم شظايا القولون طويلة مما يجعل علما أي منطقة من العينة (أي القريبة والمتوسطة أو البعيدة).
  7. عينات الأنسجةلاستخدامها في المقايسات يمكن وضعها على حدة في 1.5 مل من أنابيب إيبندورف والمجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه حتى استخدامها في -70 درجة مئوية.

3. تقييم شدة التهاب القولون

  1. ويتم تقييم العيانية أو مرض عضال درجة الخطورة التي كتبها مراقب محايد باستخدام نظام التهديف المنشورة سابقا (الجدول 1). يمكن تقييم 9 الاتساق البراز باستخدام زوج من الملقط والضغط لأسفل على البراز لتحديد الاتساق. لتحديد درجة للدم في البراز ، لاحظ لون البراز (أي البراز الأسود مقابل ضوء البراز البني) والتحقق أيضا باستخدام اختبار Hemoccult. باستخدام نظام التسجيل ، وتحديد درجة لكل واحد من تلك الشروط. النتيجة النهائية لكل حيوان العيانية هي مجموع نقاط كل على حدة.
  2. لتقييم الأضرار النسيجية من شدة التهاب القولون ، وقطع جزء صغير (0.5 سم) من القولون ، وتحدث في شريط كاسيت الأنسجة ويغرق في محلول الفورمالين 10 ٪ مخزنة. إعداد 5البارافين ميكرون جزءا لا يتجزأ من المقاطع العرضية والمقاطع وصمة عار مع الهيماتوكسيلين / eoxin (H & E) باستخدام الإجراءات المناسبة. يمكن اتخاذها من شظايا القولون القولون منتصف القريبة ، أو القسم الأعلى من القولون.
  3. وسجل H & E ملطخة المقاطع انسجة القولون بواسطة المراقب أعمى باستخدام نظام تنطبق على التدابير التالية : سرداب العمارة (عادي ، 0 -- تشويه سرداب حادة مع فقدان الخبايا بأكمله ، 3) ، ودرجة تسلل خلية التهابية (عادي ، 0 -- التهابات التسلل الكثيفة ، 3) ، وسماكة عضلة (قاعدة سرداب يجلس على المخاطية العضلية ، 0 -- احتفلت الحاضر سماكة العضلات ، 3) ، واستنفاد الخلايا الكأسية (، 0 الغائب -- الحاضر ، 1) وسرداب الخراج (تغيب ، 0 -- الحاضر ، 1). 7 درجة الضرر النسيجي هو مجموع نقاط كل على حدة. تجدر الإشارة إلى أنه خلافا لجامعة كاليفورنيا في الإنسان ، وخراجات سرداب ليست من سمات هذا النموذج ، ونادرا ما تظهر ؛ تقرحات المجهرية هي أيضا نادرة. إذا كانت أبواب متعددة القولونوينبغي أن تستخدم الملون ، عشرات النسيجي بين أبواب مماثلة لتحديد النتيجة النهائية لكل مجال من المجالات (أي درجة النسيجية في القولون القريبة مقابل درجة النسيجية في القولون القاصية).

4. إعداد حلول للمخزون الكواشف المقايسات

  1. يعد حل 50 ملم من فوسفات البوتاسيوم العازلة بإضافة B الحل (K 2 هبو 4 ، 8.7 غرام من البوتاسيوم الفوسفات ثنائي القاعدة في 1 لتر من DH 2 O) إلى حل (KH 2 PO 4 ، 6.8 غرام من البوتاسيوم أحادي القاعدة في الفوسفات 1L من DH 2 O) حتى يتم التوصل إلى درجة الحموضة من 6.0. ويمكن تخزين المتبقي في البراد الحلول (2-8 درجة مئوية) حتى استخدامها في المستقبل.
  2. إعداد hexadecyltrimethylammonium بروميد (HTAB) العازلة بإضافة 5 غ HTAB في 1 لتر من الفوسفات عازلة البوتاسيوم (50 ملم ، ودرجة الحموضة = 6.0). الحرارة برفق لإذابة وتخزينها في 2-8 درجة مئوية حتى الاستخدام. عند الاقتضاء ، إعادة الحرارة إلى حل.
  3. إعداد العازلة للتحلل الأنسجة لتجانس تحليل البروتينواضاف ان 10 مل من حمض الهيدروكلوريك تريس - 1M (الرقم الهيدروجيني = 8.0) ، 6 مل من كلوريد الصوديوم و 2 5M مل من X 100 إلى 182 مل تريتون من الماء المقطر تعقيمها. تريتون X - 100 هو لزج جدا في درجة حرارة الغرفة ، وبالتالي ، ينبغي أن تكون درجة حرارة بلطف قبل الاستخدام. ويمكن تخزين العازلة التي أعدت في تحلل -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5. إعداد عينة لفحوصات

  1. إعداد العينات للتحليل MPO.
    1. إزالة عينات من -70 درجة مئوية ومكان على الجليد. تسجيل وزن كل عينة البراز بعد إزالة أي دهون مرئية أو باستخدام forcep عازمة / منتاش ومكان في أنبوب إيبندورف 2mL microcentrifuge الآمن لوك (أو أي أنبوب التي يمكن استخدامها مع الخالط). يجب أن تبقى العينات في الثلج في جميع الأوقات. ومن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي استخدام أجزاء القولون مماثلة من كل تكرار البيولوجية (أي المقاطع القاصي المقاطع فقط أو القريبة فقط).
    2. إضافة إلى كل حبة الخالط أنبوب العينة.
    3. إضافة كمية مناسبة من BUF HTABفر وفقا لوزن الأنسجة. إذا كان وزن الأنسجة أقل من 25 ملغ ، إضافة العازلة عند نسبة 12.5mg/mL ، وإذا كان وزن الأنسجة ما بين 25-50 ، إضافة إلى نسبة من 25mg/mL. إذا كان وزن الأنسجة أكبر من 50 ، إضافة العازلة عند نسبة 50mg/mL.
    4. التجانس مع الخالط الأنسجة لمدة 4 دقائق حتى 30 هرتز. إذا لم يتم تكرار نسيج متجانس تماما.
    5. إزالة الخالط حبة والحل الطرد المركزي لمدة 6 دقائق (13400 XG ، 4 درجة مئوية).
    6. طاف جمع والتخلص من بيليه الناتجة عن ذلك. يمكن تخزينها في Supernatent -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد العينات للتحليل خلوى.
    1. كرر الخطوات 5.1.1. إلى 5.1.2.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من الكوكتيل مثبط البروتياز (PIC) إلى 10 مل من تحلل استعداد العازلة.
    3. إضافة 1 مل من الموافقة المسبقة ، وتحلل حل عازلة لكل عينة بغض النظر عن الوزن.
    4. التجانس لمدة 5 دقائق حتى 30 هرتز. إذا لم يتم تكرار نسيج متجانس تماما.
    5. إزالة الخالط حبة وsoluti الطرد المركزيلمدة 5 دقائق في ز س 3300
    6. طاف جمع والتخلص من بيليه الناتجة عن ذلك. ويمكن تخزين طاف على -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.

6. الكمي للعلامات التهابات

  1. MPO النشاط مقايسة
    1. إعداد س dianisidine هيدروكلوريد (س dianisidine) حل عن طريق الجمع بين 16.7 ملغ من هيدروكلوريد dianisidine س ، و 90 مل من 2 O درهم ، و 10 مل من الفوسفات عازلة البوتاسيوم. وينبغي إعداد هذا الحل الطازجة لكل مقايسة.
    2. إضافة 7 ميكرولتر من جناسة الأنسجة (أعدت في القسم 5.1) في ثلاث نسخ في لوحة 96 - جيدا.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من المخفف O 2 H 2 (4 ميكرولتر من 30 ٪ H 2 O 2 المخفف في 96 ميكرولتر من DH 2 O) إلى خليط dianisidine س.
    4. استخدام ماصة متعدد القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من خليط س dianisidine تحتوي H 2 O 2 إلى كل من الآبار.
    5. قياس امتصاص عند 450 نانومتر باستخدام spectrophotometer. يستغرق ثلاث قراءات في 30 فترات الثانية.
    6. MPO حساب النشاط. ويقاس النشاط MPO في وحدات (U) من MPO / ملغ الأنسجة ، حيث يتم تعريف وحدة واحدة كما MPO المبلغ اللازم للحط من 1 μmoL من H 2 O 2 في الدقيقة الواحدة في درجة حرارة الغرفة. معتبرا ان وحدة واحدة (U) من MPO μmoL = 1 من 2 H 2 O والانقسام أن 1 μmoL من H 2 O 2 يعطي تغير الامتصاصية 1.13 نانومتر س -2 / 10 دقيقة ، يتم تحديد وحدات من الخطة الرئيسية للعمليات في كل عينة والتغير في الامتصاصية [ΔA (ر 2 ر 1)] / Δmin × (1.13 × 10 -2). للحصول على وحدات لكل ملغ من الأنسجة ، واستخدام الأنسجة : نسبة العازلة. على سبيل المثال ، إذا كان النسيج : تم استخدام نسبة العازلة من 50 ملغ / مل ، في 7 ميكرولتر من جناسة ، هناك 0.35 ملغ من الأنسجة. لذا ، للحصول على وحدة في النسيج ملغ ، وتقسيم وحدات MPO بنسبة 0.35. يتم تضمين حساب العينة باستخدام قيم الامتصاصية (نانومتر) أدناه (على افتراض أنه تمت إضافة العينة في ثلاث نسخ) :
عينة مرة ثانية 0 الوقت 30 ثانية الوقت 60 ثانية
A 1 2 3 1 ' 2 ' 3 ' 1 " 2 '' 3 "
0،048 0،048 0،051 0،061 0،061 0،065 0،074 0،073 0،078
  1. متوسط ​​الوقت 0 ثانية = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 نانومتر
  2. متوسط ​​الوقت 30 ثانية = 0.0623 نانومتر
  3. متوسط ​​الوقت 60 ثانية = 0.075 نانومتر
  4. التغير في الامتصاصية (ΔA) من 0 إلى الأنسجة ثانية / 30 ملغ (على افتراض 50 ملغ / مل من الأنسجة : نسبة العازلة) = [(0،0623-0،049) / (1.13 × 10 -2)] / 0.35 = 3.363
  5. تغيير في استيعابتعصب (ΔA) 30-60 ثانية / ملغ الأنسجة = 3.211
  6. * النشاط MPO (U / ملغ الأنسجة) = متوسط ​​ΔA (00-30) وΔA (30-60) = 3.287
  1. الكمي للالسيتوكينات الموالية للالتهابات عن طريق ELISA
    1. تتحدد خلوى (IL - 1β ، IL - 6 و TNF - α) المستويات باستخدام انزيم المتاحة تجاريا المرتبطة بالإنزيم مقايسة (ELISA) مجموعة (Quantikine الفئران ؛ R & D أنظمة).
    2. هو تطبيع قيم الامتصاصية من كل ELISA مقايسة باستخدام بروتين برادفورد منها على كل عينة ، ويعبر عنها في وحدات من الغرام / ملغ من البروتين.

7. ممثل النتائج

وإدارة نظام DSS المناسبة لحث التهاب القولون الحاد في الفئران. خلال فترة مفاجآت صيف دبي للعلاج ، يمكن استخدام DAI لتقدير وتقييم التقدم السريري للمرض. وسوف الحيوانات تعامل مع مفاجآت صيف دبي تظهر نقص ملحوظ في الوزن مقارنة مع أوزانها الأولية ، براز رخو والبرازالنزيف (الشكل 1). على التضحية وفحص القولون ، وسجل ظاهريا من شدة التهاب القولون على أساس تقصير طول القولون ، والقولون النزيف ، والنزيف برازي ، وتخفيف كثافة البراز ، وعلامات النزف المستقيمي مقارنة لضوابط التعامل مع المياه فقط (الشكل 2 والجدول 1). والمقاطع العرضية لعينات انسجة القولون ملطخة H & E ودرجات أعلى النسيجي لمفاجآت صيف دبي للمعاملة مقابل نقطتين للمياه المعالجة التحكم (الشكل 3). لمزيد من تميز بقدر من التهاب في مفاجآت صيف دبي لمعاملة الفئران ، يمكن تقييم نشاط MPO المتجانس من عينات الأنسجة القولون. مفاجآت صيف دبي والمعالجة وزيادة النشاط نقطتين MPO بالمقارنة مع الضوابط (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، ويرتبط هذا مع زيادة مستويات السيتوكينات الموالية للالتهابات (IL - 1β ، IL - 6 ، TNF - α) (الشكل 5).

الشكل 1.
الشكل 1. ذكر ، أعطيت C57BL / 6 الفئران مفاجآت صيف دبي 5 ٪ في مياه الشرب لمدة 5 أيام. وجرى تقييم عشرات DAI اليومية لكل حيوان وكان متوسط ​​المعدل اليومي لكل مجموعة (يعني ± SEM ، ن = 4 الفئران / المجموعة).

الشكل 2.
أعطيت الشكل 2. C57BL / 6 الفئران مفاجآت صيف دبي 5 ٪ في مياه الشرب لمدة 5 أيام. تلقت الفئران التحكم في المياه من دون مفاجآت صيف دبي. وجرى تقييم الأضرار عمياء العيانية عشرات شدة درجة / مرض التهاب القولون في 5 أيام مفاجآت صيف دبي التي يسببها آخر. كولون المعزولة من الفئران التي تلقت عشرات مفاجآت صيف دبي والضرر أعلى العيانية (نزيف المستقيم ، وهبوط المستقيم ، والإسهال ، والنزف القولون) يشير إلى زيادة شدة المرض (يعني ± SEM ، ن = 4 الفئران / المجموعة).

الشكل 3
الشكل 3. أعطيت C57BL / 6 الفئران 5 ٪ حل مفاجآت صيف دبي في مياه الشرب من أجل حمل التهاب القولون. التحكم الفئران تلقى المياه دون مفاجآت صيف دبي. (A) وسجل عمياء عشرات النسيجية باستخدام H & E المقاطع انسجة القولون الملون التي يتم جمعها على الإدارة اليوم بعد 5 مفاجآت صيف دبي. (ب) DSS - تعامل عينات تظهر المزيد من الضرر النسيجي (تسلل أكثر الخلوية ، واستنزاف المزيد من الخلايا الكأسية ، والمزيد من التشويه / الأضرار التي لحقت العمارة سرداب) مقارنة ب (C) التحكم (يعني ± SEM ، ن = 4 الفئران / المجموعة). في (ب) و (C) ، النجمة (*) يشير إلى منطقة نضوب الخلية القدح والتشويه من سرداب العمارة ؛ علامة الرقم (#) يشير إلى تسلل الخلوية.

الشكل 4.
وقد تم جمع الشكل 4. تمت التضحية جميع الفئران على الإدارة يوم آخر 5 من مفاجآت صيف دبي وعينات انسجة القولون لتقييم نشاط MPO. وترتبط شدة مفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون مع مستويات أعلى من النشاط مقارنة MPO التحكم (يعني ± SEM ، ن = 4 الفئران / المجموعة).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
ويرتبط أيضا الرقم 5. بالإضافة إلى مستويات أعلى MPO ، وشدة لمفاجآت صيف دبي التي يسببها التهاب القولون مع زيادة مستوى الموالية للالتهابات مثل السيتوكينات IL - 1β ، IL - 6 ، TNF - α (يعني ± SEM ، ن = 4 الفئران / المجموعة).

الجدول 1. العينية نقاط الخطورة / الأمراض

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مفاجآت صيف دبي التهاب القولون هو نموذج يستخدم على نطاق واسع بفعل كيميائيا من التهاب في الامعاء. في هذا النموذج ، يتم إعطاء الفئران مياه الشرب تستكمل مع مفاجآت صيف دبي ، والتي يعتقد أن تكون سامة للأمعاء وتعطيل الخلايا الظهارية على سلامة الحاجز المخاطية. 10 إدارة مفاجآت صيف دبي يدفع an التهاب القولون الحاد الذي يتميز البراز فضفاضة ، والنزيف برازي ، وتسلل مع المحببة. الإدارة خلال مفاجآت صيف دبي 10 ، يترافق عادة مع التهاب القولون وفقدان الوزن الكبير ووجود الدم في البراز ، والتي يمكن تقييمها من خلال فحص الدم الخفي البراز. 5.10،11 بعد جمع عينات من أنسجة القولون ، التهاب القولون يمكن شدة يتميز الفحص بالعين المجردة من القولون والتحليل النسيجي للH & E ملطخة القولون عبر المقاطع باستخدام أنظمة التهديف في السابق. 9

عند اتباع هذا البروتوكول ، من المهم أن نلاحظ أن شدة الناجم عن التهاب القولونمفاجآت صيف دبي هي الأنواع وسلالة معينة (12). وبالإضافة إلى ذلك ، فإن الاختلافات في الدقيقة المعوية بين المرافق حيوانية مختلفة وغرف السكن قد يغير النتيجة لإدارة مفاجآت صيف دبي. 13،14 وهكذا ، قد يكون مطلوبا الدراسات الأولية باستخدام مفاجآت صيف دبي لتحسين الجرعة ومدة مفاجآت صيف دبي العلاج. قد فشل في تحسين هذه المتغيرات يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفاة أو قليل من دون التهاب القولون. أمثل مرة واحدة ، يمكن استخدام هذا النموذج كنموذج للتكرار للغاية من التهاب القولون مع انخفاض معدل الوفيات. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم استخدام مفاجآت صيف دبي من وزن جزيئي محدد (انظر الجدول الكواشف). قد أشكال أخرى من مفاجآت صيف دبي كاشف الملح لا ينتج التهاب القولون أو قد يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفاة.

تحريض التهاب القولون باستخدام هذا النموذج في نتائج شديدة الضرر العيانية والنسيجية ، الذي يرتبط مع زيادة النشاط MPO فضلا عن مستويات أعلى من إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات. Agranulocytes ، مثل الخلايا اللمفية anد حيدات ، مصادر هامة من السيتوكينات الموالية للالتهابات ، في حين أن الخطة الرئيسية للعمليات هو انزيم الواردة في المحببة مثل العدلات (وإلى حد أقل وحيدات الضامة). ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لقياس النشاط MPO في عينات انسجة القولون تعامل مع ثنائي نتروبنزين حمض السلفونيك (DNBS) -- التي يسببها التهاب القولون 15 DNBS التي يسببها التهاب القولون هو تي خلية بوساطة تتميز كذلك التهاب في القولون بطريق الجدار الذي تديره تقطير intrarectal من المواد الخاضعة للDNBS في الإيثانول يستخدم الايثانول 16 لكسر الحاجز المخاطية ، مما يسمح للDNBS لhaptenize للبروتينات ذاتي أو مجهريات البقعة تحفيز استجابة مناعية المضيفة للمستضدات الذات ناشبة المعدلة (16). ميزة واحدة من خلال هذا النموذج نموذج مفاجآت صيف دبي التي يسببها هو أن يعرف وكيل انتزاع. الآلية التي مفاجآت صيف دبي يبدأ التهاب القولون ، ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديدها. ومن المثير للاهتمام ، وقد أظهرت الدراسات أن إدارة مفاجآت صيف دبي يؤدي القولونيةتيس في الخلايا الطبيعية القاتلة التي تعاني من نقص ، و T - B وخلايا الفئران ناقصة ، مما يوحي بأن هذه الخلايا (المرتبط مع الجهاز المناعي على التكيف) قد لا يكون حاسما في تحريض التهاب القولون ، وبالتالي ، فإن هذا النموذج قد تكون مناسبة لدراسة دور نظام المناعة الفطرية في توليد التهاب القولون. 4،17

لقياس أكثر دقة للنشاط MPO ، وجدنا أنه بغض النظر عن الذي يستخدم نموذج التهاب القولون ، وينبغي تحديد مستويات MPO في غضون الأسبوع الأول من جمع الأنسجة كنشاط MPO يميل الى الانخفاض بمرور الوقت. ويمكن استخدام النشاط MPO كمؤشر بديل من الالتهابات. ومع ذلك ، القياس الكمي للالسيتوكينات الأنسجة ويحرز النسيجية تشكل جزءا لا يتجزأ لتيسير تقييم كامل للاستجابة التهابية خلال القولون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) وكرون والتهاب القولون مؤسسة كندا (CCFC).

Materials

علامة نزيف المستقيم هبوط المستقيم البراز تناسق دم
0 لا شيء لا شيء طبيعي طبيعي
1 أحمر علامات على هبوط ناعم أحمر
2 الأحمر الداكن هبوط واضح لينة جدا الأحمر الداكن
3 إجمالي النزيف هبوط واسعة النطاق الإسهال أسود
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).
التحقيق في الالتهابات المعوية الناجمة عن مفاجآت صيف دبي موديل IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter