Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD

Published: February 1, 2012 doi: 10.3791/3678
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Farncombe Family Digestive Health Research Institute, Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

Summary

Experimentele modellen van inflammatoire darmziekte hebben ons de complexe aangeboren en adaptieve immuunrespons geassocieerd met pathogenese te onderzoeken. Met behulp van histologische scoring, kwantificering van pro-inflammatoire cytokines en myeloperoxidase activiteit, kan men beginnen met deze reacties gezien bij inflammatoire darmziekten te beoordelen.

Abstract

Inflammatoire darmziekte (IBD) omvat een reeks van intestinale aandoeningen, de meest voorkomende daarvan zijn colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD). Zowel de UC en CD, indien aanwezig in de dikke darm, een soortgelijk symptoom profiel dat diarree, rectaal bloeden, buikpijn en gewichtsverlies kunnen bestaan ​​uit genereren. 1 Hoewel de pathogenese van IBD nog onbekend is, wordt beschreven als een multifactoriële ziekte die zowel betrekking genetische en omgevingsfactoren componenten. 2

Er zijn talrijke en variabele diermodellen van de dikke darm ontsteking die lijken op een aantal kenmerken van IBD. Diermodellen van colitis variëren van ontstaan ​​spontaan in gevoelige stammen van bepaalde soorten aan die bestanddelen die de toediening van specifieke concentraties van colitis-inducerende chemische stoffen, zoals dextran sulfaat natrium (DSS). Chemisch-geïnduceerde modellen van de darm ontsteking zijn de meest gebruikte en beste omschreven modellen van IBD. Administratie van DSS in het drinkwater produceert acute of chronische colitis, afhankelijk van de administratie-protocol. 3 dieren gegeven DSS vertonen gewichtsverlies en tekenen van losse ontlasting of diarree, soms met het bewijs van rectale bloeden. 4,5 Hier beschrijven we de methoden waarmee colitis ontwikkeling en de daaruit voortvloeiende ontstekingsreactie kan worden gekenmerkt na toediening van DSS. Deze methoden omvatten histologische analyse van hematoxyline / eosine gekleurde dikke delen, meting van pro-inflammatoire cytokines, en de bepaling van myeloperoxidase (MPO) activiteiten, die gebruikt kan worden als een surrogaat marker van ontsteking. 6

De omvang van de ontstekingsreactie bij de ziekte van de staat kan worden beoordeeld door de aanwezigheid van klinische symptomen of door verandering in de histologie in mucosale weefsels. Colonic histologische schade wordt beoordeeld door middel van een scoresysteem dat het verlies van de crypte architectuur, inflammatoire cel infiltratie, spier t beschouwthickening, beker-cel depletie, en crypte abces. 7 kwantitatief, kan het niveau van pro-inflammatoire cytokines met acute inflammatoire eigenschappen, zoals interleukine (IL)-1β, IL-6 en tumor necrosis factor (TNF)-α, worden bepaald met behulp van conventionele ELISA methoden. Daarnaast kan MPO-activiteit worden gemeten met behulp van een colorimetrische assay en gebruikt als een index van een ontsteking. 8

In experimentele colitis, is ernst van de ziekte vaak gecorreleerd met een toename van de MPO-activiteit en hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines. Colitis ernst en ontsteking-gerelateerde schade kan worden beoordeeld door na te gaan consistentie van de ontlasting en bloeden, in aanvulling op de beoordeling van de histopathologische toestand van de darm met behulp van hematoxyline / eosine gekleurde colon weefselcoupes. Colonic weefsel fragmenten kunnen worden gebruikt om de MPO activiteit en cytokine productie te bepalen. Tezamen kunnen deze maatregelen worden gebruikt om de intestinale ontstekingsreactie in te evaluerendiermodellen van experimentele colitis.

Protocol

1. Muizenmodel van DSS-geïnduceerde acute colitis

  1. Voeg dextraansulfaat natrium (DSS) om geautoclaveerd drinkwater aan de gewenste uiteindelijke concentratie (1-5%) (wt / vol) (dwz een 5% DSS-oplossing te maken, 25 mg DSS poeder tot 500 ml van geautoclaveerd water toe te voegen) . Stock oplossing kan worden ingeleverd bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week of bij 4 ° C tot gebruik.
  2. In een bioveiligheid kap, giet voorraad DSS-oplossing in 50 ml Falcon buizen (een die nodig is per kooi). Houd de stamoplossing te vullen tubes als dat nodig is.
  3. Vervangen door het drinkwater in elke muis kooi met de DSS-oplossing (in de 50 ml Falcon buizen) (De duur is afhankelijk van de DSS regime dat wordt gebruikt. Bijvoorbeeld met behulp van 6-8 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen, hebben we een te beheren 5% DSS oplossing voor een totaal van vijf dagen). Muizen zouden geen toegang tot een andere waterbron. Controle muizen worden gegeven geautoclaveerd drinkwater zonder DSS.
  4. Dagelijks wegen muizen en registreren van de hoeveelheid DSS verbruikt per dag. Boven elkefles tot 50 ml na het opnemen DSS niveaus. Dit is het meten van de geschatte hoeveelheid van DSS verbruikt per kooi per muis gedurende de looptijd van het experiment. In onze onderzoeken maken we gebruik van een 5% DSS-oplossing gedurende 5 dagen met mannelijke C57BL / 6 muizen. Significant gewichtsverlies, gewijzigde consistentie van de ontlasting en tekenen van fecale bloed worden gezien zo vroeg dag 3 het gebruik van deze bijzondere DSS regime. Tijdens de DSS administratie, muizen vertonen uitgesproken gewichtsverlies (ongeveer 5-10% van hun oorspronkelijke gewicht op dag 5) met een gewichtsverlies van meer dan 20% van de initiële gewicht met uitdroging en diarree naar de significante fysiologische indicator die een dier op of worden de buurt van eindpunt. Als het dier krijgt toegang tot normaal water na de 5 dagen van 5% DSS, zal het herstellen binnen 7 dagen. Alle experimenten moet worden goedgekeurd door dier van de instelling ethische commissie en in overeenstemming zijn met de goedgekeurde Animal Gebruik Protocol (AUP).
  5. Tijdens de duur van het experiment, een ziekte activiteit index (DAI)score kan worden beoordeeld aan de klinische progressie van colitis te evalueren. De DAI is de gecombineerde score van gewichtsverlies ten opzichte van de initiële gewicht, consistentie van de ontlasting, en bloeden. Scores zijn als volgt gedefinieerd: gewichtsverlies: 0 (geen verlies), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) en 4 (> 20%), consistentie van de ontlasting: 0 (normaal), 2 (dunne ontlasting), en 4 (diarree), en bloeden: 0 (geen bloed), 1 (Hemoccult positief), 2 (Hemoccult positieve en visuele pellet bloeden) en 4 (bruto bloeden, bloed rond anus). DAI kunnen dagelijks gescoord gaat worden tijdens de duur van de DSS-behandeling.
  6. Op het tijdstip van keuze, wegen en opoffering muizen. Muizen kunnen worden gedood door cervicale dislocatie na inhalatie van isofluraan of door een andere methode goedgekeurd door dier van de instelling faciliteit.

2. Verzamel colon weefselmonsters

  1. Expose de ventrale zijde van het dier en de buik nat gebied met een 70% ethanol-oplossing. Op dit punt, zie tabel 1 en noteer eenny tekenen van rectale bloeden (bloed aanwezig bij de anale opening) of rectale prolaps in elk dier.
  2. Gebruik standaard ontleden schaar om de buik incise door het maken van een ventrale middellijn incisie.
  3. Zoek de dikke darm en de dikke darm transect zo dicht mogelijk bij de colorectale marge mogelijk bij de distale colon vrij.
  4. Voorzichtig en langzaam trek de hele dikke darm, losgemaakt van de omringende mesenterium.
  5. Transect de dikke darm bij de colonocecal marge naar het proximale uiteinde van de dikke darm vrij. Uitwerpselen kan worden verwijderd door spoelen dikke darm met steriele PBS met behulp van een maagsonde naald bevestigd aan een 3 of 5 ml spuit of door het zorgvuldig te knijpen met behulp van een paar gebogen pincet / tang. Met behulp van de gehele dikke darm, beoordeel schade (zie paragraaf 3.1)
  6. Weefsel bemonstering voor histologische analyse en andere testen kunnen worden gedaan door te snijden 0,5 cm tot 1,0 cm lang colon fragmenten met vermelding van welk gebied het monster uit (dat wil zeggen proximale, midden of distaal).
  7. Weefselmonstersom te worden gebruikt voor de testen kunnen individueel worden geplaatst in 1,5 ml Eppendorf buizen en ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard tot gebruik bij -70 ° C.

3. Beoordeling van de ernst van colitis

  1. Macroscopische of ernst van de ziekte score is terminaal beoordeeld door een onpartijdige waarnemer met behulp van een eerder gepubliceerde scoringssysteem (tabel 1). 9 consistentie van de ontlasting kan worden beoordeeld met behulp van een paar pincetten en drukken op de ontlasting om de consistentie te bepalen. Voor het bepalen van een score voor bloed in de ontlasting, let op de kleur van de ontlasting (dat wil zeggen zwarte ontlasting versus lichtbruine ontlasting) en verder te valideren met behulp van een Hemoccult test. Met behulp van de scoring systeem, bepalen van een score voor elk van de voorwaarden. De uiteindelijke macroscopische score voor elk dier is de som van elke individuele score.
  2. Voor het evalueren van histologische beschadiging van colitis ernst, snijd een klein fragment (0,5 cm) van de dikke darm, in een weefsel cassette en onderdompelen in een gebufferde 10% formaline-oplossing. Voor te bereiden 5um paraffine ingebedde doorsneden en vlekken secties met hematoxyline / eoxin (H & E) met behulp van de juiste procedures. Colon fragmenten kunnen worden genomen van de proximale, mid-colon, of distale deel van de dikke darm.
  3. H & E gekleurde dikke coupes worden gescoord door een geblindeerde observator met behulp van een eerder gepubliceerde systeem voor de volgende maatregelen: crypt architectuur (normaal, 0 - ernstige crypte vervorming met het verlies van hele crypten, 3), de mate van inflammatoire cel infiltratie (normaal, 0 - dicht ontstekingsinfiltraat, 3), spier-verdikking (basis van de crypte zit op de muscularis mucosae, 0 - gemarkeerde spier verdikking aanwezig is, 3), goblet cel depletie (afwezig, 0 - heden, 1) en de crypte abces (afwezig, 0 - heden , 1). 7 De histologische schade score is de som van elke individuele score. Moet worden opgemerkt dat in tegenstelling tot de menselijke UC, crypte abcessen niet zijn kenmerkend voor dit model en worden zelden gezien, microscopisch kleine zweren zijn ook zeldzaam. Als er meerdere secties zijn dikke darmgebeitst, histologische scores tussen soortgelijke rubrieken moeten gegevens worden gebruikt om de eindscore voor elk gebied (dat wil zeggen histologische score in de proximale colon ten opzichte van histologische score in distale colon) te bepalen.

4. Bereid voorraad oplossingen van reagentia voor assays

  1. Bereid een 50 mM oplossing van kalium fosfaatbuffer door het toevoegen van oplossing B (K 2 HPO 4, 8,7 g dibasisch kaliumfosfaat in een L van dH 2 O) naar oplossing A (KH 2 PO 4, 6,8 g kalium monobasisch fosfaat in 1L van dH 2 O) tot een pH van 6,0 is bereikt. Resterende oplossingen kunnen worden opgeslagen in de koelkast (2-8 ° C) tot toekomstig gebruik.
  2. Bereid hexadecyltrimethylammonium bromide (htab) buffer door het toevoegen van 5 g htab in 1 L van Kalium Fosfaat buffer (50 mM, pH = 6,0). Voorzichtig warmte op te lossen en op te slaan bij 2-8 ° C tot gebruik. Indien nodig, warmte opnieuw te ontbinden.
  3. Bereid lysis buffer voor weefsel homogenisering voor eiwit analyse doortoevoeging van 10 ml 1 M tris-zoutzuur (pH = 8,0), 6 mL 5M natriumchloride en 2 ml van Triton X-100-182 ml gedestilleerd water gesteriliseerd. Triton X-100 is zeer viskeus bij kamertemperatuur en dus moeten voor voorzichtig worden opgewarmd tot gebruik. De bereide lysis buffer kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.

5. Monstervoorbereiding voor assays

  1. Monstervoorbereiding voor MPO-analyse.
    1. Verwijder de monsters van -70 ° C en leg ze op ijs. Registreer het gewicht van elk monster na het verwijderen van alle zichtbare uitwerpselen of vet met behulp van een gebogen pincet / pincet en plaats in een 2 ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuis (of een buis die kan worden gebruikt met een homogenisator). Monsters moeten worden bewaard op ijs te allen tijde. Het is belangrijk op te merken dat soortgelijke dubbele punt fragmenten moeten gebruikt worden vanaf elke biologische repliceren (dat wil zeggen distale delen of alleen proximale delen only).
    2. Voeg homogenisator kraal aan elk monster buis.
    3. Voeg de juiste hoeveelheid htab buffer op basis van weefsel gewicht. Als weefsel gewicht is minder dan 25 mg, voeg de buffer in een verhouding van 12.5mg/mL, als weefsel gewicht is tussen de 25-50, toe te voegen in een verhouding van 25mg/ml. Als weefsel gewicht groter is dan 50, voeg buffer in een verhouding van 50mg/mL.
    4. Homogeniseren met een tissue homogenisator voor 4 min bij 30 Hz. Herhaal indien weefsel is niet volledig gehomogeniseerd.
    5. Verwijder de homogenisator kraal en centrifugeer oplossing voor 6 min (13.400 xg, 4 ° C).
    6. Verzamel supernatant af en gooi de resulterende pellet. Supernatent kan worden opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik.
  2. Monstervoorbereiding voor cytokine analyse.
    1. Herhaal de stappen 5.1.1. naar 5.1.2.
    2. Voeg 50 ul van protease inhibitor cocktail (PIC) tot 10 ml bereid lysis buffer.
    3. Voeg 1 ml van de PIC en lysisbuffer oplossing voor elk monster ongeacht het gewicht.
    4. Homogeniseren gedurende 5 min bij 30 Hz. Herhaal indien weefsel is niet volledig gehomogeniseerd.
    5. Verwijder de homogenisator kraal en centrifuge solutigedurende 5 min bij 3300 x g.
    6. Verzamel supernatant af en gooi de resulterende pellet. Supernatant kan worden opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik.

6. Kwantificering van inflammatoire markers

  1. MPO-activiteit test
    1. Bereid o-dianisidine dihydrochloride (o-dianisidine) oplossing door het combineren van 16,7 mg van de o-dianisidine dihydrochloride, 90 ml dH 2 O, en 10 ml van kalium fosfaat buffer. Deze oplossing moet vers worden bereid voor elke test.
    2. Voeg 7 ul van weefsel homogenaat (opgesteld in paragraaf 5.1) in drievoud in een 96-wells plaat.
    3. Voeg 50 ul van verdund H 2 O 2 (4 pi van 30% H 2 O 2 verdund in 96 uL van dH 2 O) om de o-dianisidine mengsel.
    4. Gebruik een multi-channel pipet tot 200 pi van de o-dianisidine mengsel dat H 2 O 2 aan elk van de bronnen toe te voegen.
    5. Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een spectrophotometer. Neem drie metingen om de 30 seconden.
    6. Bereken MPO-activiteit. MPO-activiteit wordt gemeten in units (U) van MPO / mg weefsel, waar een eenheid van de MPO is gedefinieerd als de hoeveelheid die nodig is om een mol van H 2 O 2 per minuut bij kamertemperatuur af te breken. Gezien het feit dat een eenheid (U) van MPO = 1 umol van H 2 O 2 gesplitst en dat 1 mol van H 2 O 2 een verandering van de absorptie van 1,13 x 10 -2 nm / min geeft, is eenheden van MPO in elk monster bepaald als verandering in de absorptie [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Om eenheden per mg van het weefsel, gebruik het weefsel: buffer verhouding. Bijvoorbeeld, als een tissue: buffer verhouding van 50 mg / ml werd gebruikt, in 7 ul homogenaat, is er 0,35 mg van het weefsel. Daarom, om eenheden per mg weefsel te krijgen, deelt u de eenheden van de MPO met 0,35. Een voorbeeld van een berekening met behulp van absorptie-waarden (nm) is hieronder opgenomen (ervan uitgaande dat het monster is toegevoegd in drievoud):
Monster Tijd 0 sec Tijd 30 sec Tijd 60 sec
Een 1 2 3 1 ' 2 ' 3 ' 1 " 2'' 3 "
0.048 0.048 0.051 0.061 0.061 0.065 0.074 0.073 0.078
  1. Gemiddeld op Time 0 sec = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0,049 nm
  2. Gemiddeld op tijd 30 sec = 0.0623 nm
  3. Gemiddeld op Time 60 sec = 0,075 nm
  4. Verandering in de absorptie (AA) van 0 tot 30 sec / mg weefsel (in de veronderstelling 50 mg / ml weefsel: buffer-ratio) = [(+0.0623-+0.049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363
  5. Verandering in te absorberenAnce (AA) van 30 tot 60 sec / mg weefsel = 3.211
  6. * MPO-activiteit (U / mg weefsel) = gemiddelde van ΔA (0-30) en ΔA (30-60) = 3.287
  1. Kwantificering van pro-inflammatoire cytokines door middel van ELISA
    1. Cytokine (IL-1β, IL-6 en TNF-α) niveaus worden bepaald met behulp van commercieel beschikbare enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Quantikine Muizen, R & D Systems).
    2. Absorptie waarden van elk ELISA is genormaliseerd met behulp van een eiwit Bradford assay onderscheiden aan elk monster en wordt uitgedrukt in eenheden van pg / mg eiwit.

7. Representatieve resultaten

Toediening van de juiste DSS regime zal leiden tot acute colitis bij muizen. Tijdens de duur van de DSS-behandeling kan DAI worden gebruikt voor het beoordelen en evalueren van de klinische progressie van de ziekte. Dieren die behandeld worden met DSS zal blijken significant gewichtsverlies ten opzichte van hun oorspronkelijke gewicht, dunne ontlasting en fecalebloeden (figuur 1). Bij het ​​offer en het onderzoek van de dikke darm, is de ernst van colitis macroscopisch scoorde op basis van verkorting van de dikke darm lengte, colon bloeden, fecale bloeden, versoepeling van consistentie van de ontlasting, en tekenen van rectale bloeden in vergelijking met controles die werden behandeld met alleen water (figuur 2 & Table 1). Cross secties van dikke weefselmonsters gekleurd met H & E hebben een hogere histologische scores voor DSS-behandelde dubbele punt ten opzichte van water-behandelde controles (figuur 3). Om verder te karakteriseren de mate van ontsteking in DSS-behandelde muizen, kan MPO-activiteit worden beoordeeld vanuit gehomogeniseerd colon weefselmonsters. DSS behandelde dubbele punten hebben een hogere MPO-activiteit in vergelijking met controles (figuur 4). Bovendien is dit geassocieerd met verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) (figuur 5).

Figuur 1.
Figuur 1. Man, werden C57BL / 6 muizen die 5% DSS in het drinkwater gedurende 5 dagen. DAI scores werden dagelijks onderzocht voor elk dier en werden gemiddeld per dag voor elke groep (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep).

Figuur 2.
Figuur 2. C57BL / 6 muizen kregen 5% DSS in het drinkwater gedurende 5 dagen. Controle muizen kregen water zonder DSS. Macroscopische schade score / ernst van de ziekte scores werden blind beoordeeld op dag 5 na de DSS-geïnduceerde colitis. Dubbele punten geïsoleerd uit muizen die DSS kreeg een hogere macroscopische schade scores (rectale bloeden, rectale verzakking, diarree, dikke bloeden) geeft een grotere ernst van de ziekte (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep).

Figuur 3
Figuur 3. C57BL / 6 muizen kregen 5% DSS-oplossing in het drinkwater om colitis veroorzaken. Controle muizen ontvangen water zonder DSS. (A) histologische scores werden blind gescoord met behulp van H & E gekleurde dikke weefselcoupes verzameld op dag 5 na de DSS administratie. (B) DSS-behandelde monsters toon meer histologische schade (meer cellulaire infiltratie, meer goblet cel depletie, een grotere vervorming / beschadiging van crypt architectuur) in vergelijking met (C) controles (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep). In (B) en (C), sterretje (*) geeft gebied van goblet cel depletie en vervorming van de crypte architectuur; hekje (#) geeft cellulaire infiltratie.

Figuur 4.
Figuur 4. Alle muizen werden opgeofferd op dag 5 na toediening van de DSS en colon weefselmonsters werden verzameld om MPO-activiteit te beoordelen. De ernst van DSS geïnduceerde colitis wordt geassocieerd met hogere niveaus van MPO activiteit in vergelijking met controles (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Figuur 5. Naast de hogere MPO niveaus, de ernst van de DSS-geïnduceerde colitis wordt ook geassocieerd met een verhoogd niveau van pro-ontsteking cytokinen zoals IL-1β, IL-6, TNF-α (gemiddelde ± SEM, n = 4 muizen / groep).

Tabel 1. Macroscopische / Disease Severity Score

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DSS colitis is een veel gebruikte chemisch geïnduceerde model van intestinale ontsteking. In dit model, muizen krijgen het drinkwater aangevuld met DSS, dat wordt gedacht dat zij giftig voor epitheelcellen darm en de integriteit van de mucosale barrière te verstoren. 10 Toediening van DSS induceert een acute colitis die wordt gekenmerkt door losse ontlasting, fecale bloeden, en infiltratie met granulocyten. 10 Tijdens DSS toediening wordt colitis meestal geassocieerd met significant gewichtsverlies en de aanwezigheid van bloed in de ontlasting, die kan worden beoordeeld door een fecale occult bloed test. 5.10,11 Na het verzamelen van colon weefselmonsters, colitis ernst kan worden gekenmerkt door macroscopisch onderzoek van de dikke darm en histologische analyse van H & E gekleurd colon doorsneden met behulp van eerder vastgestelde scoring-systemen. 9

Wanneer na dit protocol, is het belangrijk op te merken dat de ernst van colitis veroorzaakt doorDSS is soort en stam specifiek. 12 Bovendien verschillen in de microflora in de darm tussen de verschillende dier-faciliteiten en huisvesting kamers kunnen wijzigen van het resultaat van DSS administratie. 13,14 dus de eerste studies met behulp van DSS kan nodig zijn om de dosering en duur van de te optimaliseren DSS behandeling. Zich niet aan deze variabelen te optimaliseren kan resulteren in een hoge incidentie van overlijden of weinig tot geen colitis. Eenmaal geoptimaliseerd, kan dit model gebruikt worden als een zeer reproduceerbare model van colitis met een lage sterfte. Daarnaast is het belangrijk om DSS van het aangegeven moleculair gewicht te gebruiken (zie tabel van de reagentia). Andere vormen van DSS zout reagens kan niet produceren colitis of kan leiden tot een hoge incidentie van de dood.

Inductie van colitis gebruik van dit model leidt tot ernstige macroscopische en histologische schade, die wordt geassocieerd met een verhoogde MPO-activiteit en hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokine productie. Agranulocytes, zoals lymfocyten eend monocyten, zijn belangrijke bronnen van pro-inflammatoire cytokines, terwijl MPO is een enzym dat vervat in granulocyten, zoals neutrofielen (en in mindere mate monocyten en macrofagen). Dit protocol kan ook worden gebruikt om MPO-activiteit in het colon weefselmonsters die werden behandeld met dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS) te meten -. Geïnduceerde colitis 15 DNBS-geïnduceerde colitis is een goed gekarakteriseerde T-cel gemedieerde transmurale ontsteking van de dikke darm die wordt beheerd door intrarectal instillatie van de DNBS stof in ethanol. 16 Ethanol wordt gebruikt voor het breken van de mucosale barrière, waardoor de DNBS om haptenize op autologe of microbiota eiwitten stimuleren van een gastheer immuunrespons op het hapteen gemodificeerde zelf-antigenen. 16 Een voordeel van dit model meer dan van de DSS-geïnduceerde model is dat de lokken agent is bekend. Het mechanisme waardoor DSS colitis ingewijden echter nog worden vastgesteld. Interessant, hebben studies aangetoond dat DSS administratie coli veroorzaakttis in natural killer cell-deficiënt, en T-en B-cel-deficiënte muizen, wat suggereert dat deze cellen (geassocieerd met het adaptieve immuunsysteem) niet mag worden kritisch bij de inductie van colitis en dus is dit model geschikt kan zijn voor het bestuderen van de rol van het aangeboren immuunsysteem in het ontstaan ​​van colitis. 4,17

Voor de meest nauwkeurige meting van MPO-activiteit, hebben we ontdekt dat, ongeacht welke colitis model wordt gebruikt, MPO niveaus moeten worden vastgesteld binnen de eerste week van weefsel verzameling als MPO-activiteit heeft de neiging om na verloop van tijd. MPO-activiteit kan worden gebruikt als een surrogaat marker van ontsteking. Echter, kwantificering van weefsel cytokines en histologische scoring zijn een integraal onderdeel van de volledige beoordeling van de ontstekingsreactie te vergemakkelijken tijdens de colitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en door de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Score Rectale bloeden Rectale prolaps Consistentie van de ontlasting Bloed
0 Geen Geen Normaal Normaal
1 Rood Tekenen van verzakking Zacht Rood
2 Dark Red Duidelijke verzakking Zeer zacht Donkerrood
3 Bruto Bloeden Uitgebreide verzakking Diarree Zwart
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).

Tags

Geneeskunde ontsteking myeloperoxidase (MPO) acute colon schade granulocyten dikke darm dextraansulfaat natrium (DSS) neutrofiel
Onderzoeken darmontsteking in DSS-geïnduceerde Model van IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha,… More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter