Summary
Vetgehalte analyse routinematig uitgevoerd onderzoeken waarin muizen obesitas modellen. Opkomende methoden in kleine dieren CT-beeldvorming en analyse leveren voor longitudinale detail rijke vetgehalte analyse. Hier hebben we uitvoerig stap voor stap de procedures voor het uitvoeren van kleine dieren CT-beeldvorming, analyse en visualisatie.
Abstract
Obesitas wordt in verband gebracht met een verhoogde morbiditeit en mortaliteit, en verlaagde metrics in kwaliteit van leven. 1 Beide milieu-en genetische factoren zijn geassocieerd met overgewicht, hoewel de precieze onderliggende mechanismen die bijdragen aan de ziekte worden momenteel afgebakend. 2,3 Verschillende kleine dieren modellen van obesitas zijn ontwikkeld en worden toegepast in een verscheidenheid van studies. 4 Een essentieel onderdeel van deze experimenten betreft het verzamelen van regionale en / of totale consumptie van dierlijke vetgehalte gegevens onder uiteenlopende omstandigheden.
Traditionele experimentele methoden voor het meten van het vetgehalte in kleine diermodellen van obesitas onder meer invasieve (bijv. ex vivo meting van vet deposito's) en niet-invasieve (bijv. Dual Energy X-ray absorptiometrie (DEXA), of magnetische resonantie (MR)) protocollen, die elk presenteert relatieve trade-offs. De huidige invasieve methoden voor het meten van het vetgehalte kunnen voorzien in detailsvoor orgel-en regiospecifieke vetverdeling, maar het opofferen van de onderwerpen sluit longitudinale beoordeling. Omgekeerd, de huidige niet-invasieve strategieën beperkte details voor orgel-en regiospecifieke vetverdeling, maar mogelijk waardevolle longitudinale beoordeling. Met de komst van speciale kleine dieren X-ray computertomografie (CT)-systemen en aangepaste analytische procedures, zowel orgel en regio specifieke analyse van de vetverdeling en longitudinale profilering mogelijk zijn. Recente rapporten hebben gevalideerd het gebruik van CT voor in vivo longitudinale beeldvorming van adipositas in levende muizen. 5,6 Hier hebben we een aangepaste methode die het mogelijk maakt voor vet / totale volume meting, analyse en visualisatie met behulp van de Carestream Molecular Imaging Albira CT-systeem in combinatie bieden met PMOD en Volview softwarepakketten.
Protocol
1. Dieren
- Voor de resultaten hieronder vermelde werden drie C57BL/6J-muizen en vier B6.V-Lep ob / J muizen verkregen van Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA). B6.V-Lep ob / J muizen vormen een van de eerste modellen van obesitas en blijven actief onderzocht. B6.V-Lep ob / J muizen vertonen een fenotype gekenmerkt door een verhoogde adipocyten grootte en het aantal en kan afwegen drie keer meer dan wild-type muizen. 7,8 Hier B6.V-Lep ob / J muizen werden gebruikt als een positieve controle voor een zwaarlijvige fenotype om de haalbaarheid van het Albira CT-systeem voor de CT-gebaseerde vetgehalte metingen te illustreren.
- Beeldvorming werd uitgevoerd toen de dieren bereikt ongeveer 12 weken oud. (Obesitas in B6.V-Lep ob / J muizen manifesteert zich na 4 weken oud).
- Muizen werden verdoofd door Isofluorane (2,5% debiet) en moeten worden op 2,5% via een neus-cone setup voor de beeldvorming. Eenimals werden geplaatst gevoelig in de standaard rat bed (M2M Imaging Inc Cleveland, OH) in die bij de Albira beeld station. Ledematen werden geplaatst laterale van de romp voor een uniforme CT acquisitie.
- Na het beeld overname werd afgerond, werden de muizen uit de neus en keerde terug naar een herstel van kooi tot ambulant.
2. Image Acquisition en wederopbouw
- Afbeelding overnames worden uitgevoerd met behulp van de Albira CT-systeem (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Muizen werden verdoofd door Isofluorane (2,5% debiet) en moeten worden op 2,5% via een neus-cone setup voor de beeldvorming. Overnames werden uitgevoerd om een bed van 115 mm lengte te scannen, met behulp van 600 projecties. De röntgenbron werd een stroom van 200 pA en spanning van 45 kVp en gebruikt 0,5 mm Al filter het harden van de balk.
- Geschatte straling diep equivalente dosis voor CT instellingen was 220 mSv, en ondiepe dosisequivalent was 357,4 mSv. Dezedoses zijn meer dan 20 keer lager dan de gerapporteerde LD50-waarden. 9
- Afbeeldingen worden gereconstrueerd met behulp van de FBP (gefilterde terug projectie) algoritme via de Albira Suite 5.0 Reconstructor met behulp van "Standaard" parameters. De combinatie van deze acquisitie en de wederopbouw instellingen produceren een uiteindelijke beeld met 125 micrometer isotrope voxels, die geacht worden voldoende voor hele dieren analyse. Voor gedetailleerde regio specifieke analyse, kan een reconstructie met 35 micrometer isotrope voxels worden geselecteerd voor een definitieve oplossing van 90 um.
3. Image Analysis
Afbeelding analyse wordt uitgevoerd met behulp van de PMOD (PMOD Technologies LTD, Zürich, Zwitserland) analyse software. Beelden zijn gesegmenteerd in PMOD volgens weefsel dichtheid voor het eerst dat het totale volume en dan voor vet volume.
3.1 Beelden kunnen worden verminderd voor analyse naar de computationele eisen te minimaliseren.
- Om te verminderen, ga naar de belangrijkste tabblad Weergave. Selecteer Extra> verminderen.
- Kies X met 2, Y met 2, en Z 2.
- Controleer Vervangen.
- Selecteer Uitvoeren.
De boodschap: "bounding box zal veranderen" op het scherm zodra de vermindering is voltooid.
3.2 Afbeeldingen kunnen worden gemaskeerd naar bed en de neus-cone elementen voor verdere volume-of-interest (VOI) analyse te elimineren.
- Om te maskeren, navigeert u naar Planes, Layouts, rotaties, Spiegel, 3D Markers> Vliegtuigen & lay-outs.
- Selecteer Toon vliegtuig Z.
- Ga naar de neus in de Z-vlak.
- Selecteer de belangrijkste VOI tab> Teken hoekpunten.
- Teken een region of interest (ROI) om het dier heen neus-met uitzondering van het bed en de neuskegel.
- KiezenKopieer Werkelijke ROI.
- Ga naar het volgende stuk, en plakken ROI van buffer door de betreffende vliegtuigen van de neus.
- Gebruik bewerken Groep van Hoekpunten om de ROI te passen als dat nodig is.
- Selecteer Verwijderen ROI bij de eerste vliegtuigen boven de neus kegels.
- Genereer een nieuwe VOI om het dier omtrek (met uitzondering van het dier bed) omvatten bij de eerste vliegtuigen boven de neus kegels.
- Ga naar VOI Extra> Masking & Algebra.
- Voer -1.000 in de meegeleverde dialoogvenster.
- Selecteer de Mask voxels buiten de geselecteerde VOI's te drukken.
De boodschap: ". Irreversible van gegevens in bedrijf Wilt u doorgaan?" wordt weergegeven.
- Selecteer Ja.
- Navigeer naar Planes, Layouts, rotaties, Spiegel, 3D Markers> Vliegtuigen & Layouts.
- Selecteer Toon alle vlakken.
- Onderzoek de VOI voor integriteit.
- Selecteer Opslaan.
- Opslaan als Analyseren.
- Verander de bestandsnaam prefix.
3.3 Eerste, het segment van de afbeelding voor in totaal dieren volume:
- Selecteer Extra> Externe.
- Selecteer het Segmentatie in.
- Voer een bereik van -300 tot 3500 (dichtheid bereikverwijzing afgeleid van buikvet-regio dichtheid bereik).
- Selecteer Run Segmentatie.
- Controleer de integriteit van de segmentatie.
- Selecteer OK.
- Selecteer Verwijderen ROI.
- Selecteer VOI statistieken.
De gerapporteerde statistieken vertegenwoordigen van het totale volume.
- Noteer de gemelde volume.
3.4 Vervolgens segment het beeld voor vet volume:
- Keer terug naar de niet-gesegmenteerde gemaskeerde afbeelding voor een vet-volume segmentatie.
- Om de opgeslagen verborgen gegevens te laden, controleert u de Analyseer doos in de Load venster).
- Selecteer Extra> Externe.
- Selecteer het Segmentatie in.
- Voer een reeks van -200 tot -50.
- Selecteer Run Segmentatie.
- Controleer de integriteit van de segmentatie.
- Selecteer OK.
- Selecteer VOI statistieken.
De gerapporteerde statistieken uitmaken hoeveelheid vet.
- Noteer de gemelde volume.
- Selecteer Opslaan.
- Opslaan als Analyseren.
- Verander de bestandsnaam prefix.
- Selecteer Extra> Externe.
- Selecteer de morfologische in. De morfologische uitzicht wordt weergegeven.
- Selecteer erosie.
- Selecteer OK.
- Selecteer Extra> Externe.
- Selecteer de morfologische in. De morfologische uitzicht wordt weergegeven.
- Selecteer Dilation.
- Selecteer OK.
4. Visualisatie van CT-beelden
4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) werd gebruikt om gerenderde 3D visual displays van gesegmenteerde afbeeldingen te maken.
- Gebruik de standaard instellingen in het pop-up venster.
- Open de plug-ins menu.
- Onder-configuratieprogramma, selecteer samenvoegen volumes.
- Haal het vinkje weg Rescale componenten.
- Klik op Toewijzen tweede ingang.
- Kies de gesegmenteerde vet gegevens voor de tweede ingang.
- Gebruik de standaard instellingen in het pop-up venster.
- Klik op Toepassen plug-in.
- Dubbelklik op Volume venster voor een grotere weergave van het onderwerp muis.
4.2 Terug naar de Kleur / Dekking tabblad. De component drop-down box verwijst naar die dataset wordt momenteel bewerkt. Twee schuiven bevinden zich aan de onderzijde van de tab en bepaal de relatieve lichtsterkte van elke component dataset in de overlay, met waarden 0 en 1. Voor component 1, the CT, we gebruiken liever een grijswaarden kleurenschema. Om de kleur te veranderen:
- In de scalaire Color Mapping gedeelte, dubbelklikt u op een van de schuifregelaars voor kleuren.
- Om een schuifknop te verwijderen, sleept u deze uit de doos.
- Om een nieuwe slider toe te voegen, klikt u ergens in de schuif gebied.
- Verwijder een van de schuifregelaars.
- Maak de linker kleur schuifregelaar zwart (scalaire waarde (S) = -19.000).
- Maak juiste kleur schuifregelaar wit ((S) = 15000).
- Van de scalaire Dekking in kaart brengen box, maakt u een nieuw punt door te klikken in de doos. Dit geeft een totaal drie punten in het venster.
- Voor de middelste punt, wijzigt u de (S) tot ~ -3.000, en de dekking (O) waarde op 0.
- Selecteer het derde punt aan de rechterkant van het venster.
- Wijziging (en) tot ongeveer 32.000, en
- Het eerste punt kan overal aan de linkerkant, net zo lang als de dekking waarde is ingesteld op 0.
- Ga verder met deel twee, die het uiterlijk van het vet te bewerken.
- Verander elk van de schuifregelaars voor kleuren naar rood door te dubbelklikken op en schuif de Hue (H) schuifregelaar naar links om kunstmatig gekleurde kaart het vet naar rood. Zeer weinig anders nodig moeten zijn om het uiterlijk van het vet aan te passen.
4.3 Om een drie-panel rotatie film weergeven van de CT-, vet-, en overlay te maken:
- Klik en sleep de muis het onderwerp in een verticale positie met de rug naar u toe.
- Onder Component Gewichten, stelt u de waarde van Component twee tot 0 tot alleen de CT-scan weer te geven.
- Klik op Controleren> Camera.
- Selecteer een aantal frames for de rotatie film (voor de onderhavige zaak, kozen we voor "36").
- Verander de X-rotatie waarde tot 360 graden.
- Selecteer Maken.
- In de pop-up dialoogvenster, maak een nieuwe map met de naam CT, en sla het bestand op in tiff-formaat, dat een reeks van rotatie als uitvoer produceren.
- Herhaal stap voor het vet beeld, alsmede voor de overlappende vet / CT beeld slaan in afzonderlijke mappen per keer.
4,4 ImageJ v 1.43u werd gebruikt om een rotatie filmbestand met behulp van de VolView de beelden te genereren.
- In ImageJ, selecteert u Bestand> Importeren> Image Sequence.
- Selecteer de eerste afbeelding in de CT-map. De software detecteert automatisch de andere bestanden en open ze als een stapel.
- Herhaal dit om het vet en overlay sequenties te openen.
- Open de ROI-manager onder Analyze> Extra> ROIManager.
- Teken een ROI rond het onderwerp muis, met uitzondering van onnodige achtergrond pixels.
- In de ROI manager, klikt u op Toevoegen om de ROI toe te voegen.
- Selecteer een andere sequentie van beelden.
- In de ROI manager, klikt u op de ROI toe te passen op de foto. Op deze wijze zal elk van de bijgesneden stapels perfect match-up.
- Wanneer de ROI is op alle stapels met de rechtermuisknop op binnen de ROI.
- Selecteer Dupliceren.
- Selecteer Controleer de Dubbele Stack Box om de ROI te scheiden van de rest van de afbeelding.
- Sluit het grotere afbeelding stacks.
- Herhaal deze procedure voor alle drie de beeld-sequenties.
- Ga naar Afbeelding> Stacks> Extra> Combineer met elkaar te combineren de stapels.
- Selecteer CT voor Stack 1.
- Selecteer Fat voor Stack 2.
- Er is nu een drie-panel, beeld-rotatie stack die kunnen vooraf worden bekeken door het selecteren van Play in de linkerbenedenhoek van de afbeelding venster.
- Om de film op te slaan als AVI, selecteert u Bestand> Opslaan als ...> AVI ...
- Klik op Opslaan.
5. Representatieve resultaten
Resultaten voor drie WT (C57BL/6J) muizen en vier obesitas (B6.V-Lep ob / J) muizen worden hier vermeld als een representatief voorbeeld van vet / totale volume-verhouding metingen in dienst van de Albira CT-systeem. Figuur 1 hieronder een vertegenwoordiger biedt te laten zien gemaakt met VolView v3.2 voor de segmentatie (dat wil zeggen het totale volume en de hoeveelheid vet) van obese muizen CT-beelden.
0/3680fig1.jpg "/>
Figuur 1. Vertegenwoordiger van CT-beelden gesegmenteerd voor vet. (A) bij muizen met overgewicht (B6.V-Lep ob / J) CT totale volume in grijstinten, (B) hoeveelheid vet in het rood, en (C) image fusion. (D) WT muis (C57BL/6J) CT totale volume in grijstinten, (E) de hoeveelheid vet in het rood, en (F) image fusion.
Totale volume, dikke delen en berekend vet / totale volume verhouding worden hieronder in tabel 1 voor elke muis WT en elk obesitas muis. De gemiddelde vet / totale volume verhouding van de WT-groep en de groep obesitas 0,09 en 0,42 respectievelijk (figuur 2). Het vet / totale volume ratio's voor de WT muizen ten opzichte van de obese muizen bleek significant (p = 0,001).
| WT (C57BL/6J) | Totaal (cm 3) | Fat (cm 3) | Vet / Totaal Ratio | Obese (B6.V-Lep ob | Totaal (cm 3) | Fat (cm 3) | Vet / Totaal Ratio |
| Dier 1 | 28,79 | 3,00 | 0,10 | Dier 1 | 66,25 | 26,75 | 0,40 |
| Animal 2 | 33,25 | 3,05 | 0,09 | Animal 2 | 61,15 | 26,31 | 0,43 |
| Dier 3 | 30,30 | 2,63 | 0,09 | Dier 3 | 64,19 | 25,7 | 0,40 |
| Animal 4 | 54,25 | 23,78 | 0,44 |
Tabel 1. Het totale volume, de hoeveelheid vet,en vet / totale volume ratio's voor WT en obese muizen. Total en FAT-volumes werden afgeleid van gesegmenteerde afbeeldingen met behulp van PMOD VOI analyse.
Figuur 2. Gemiddeld vet / totale volume ratio's voor WT muizen ten opzichte van obese muizen. Gemiddeld vet / totale volume ratio's voor WT (C57BL/6J) en obesitas (B6.V-Lep ob / J) bleek te zijn 0,09 en 0,42 respectievelijk worden weergegeven. (Fout = bars enkele standaard deviatie). WT versus obesitas vet / totale volume ratio's bleken significant (p-waarde = 0,001).
Discussion
Hier, gebruik te maken van B6.V-Lep ob / J muizen die we lieten zien de haalbaarheid van het uitvoeren van het vetgehalte metingen in een klein diermodel met behulp van de Albira CT-systeem. Deze metingen zijn in overeenstemming met de verwachtingen voor vergelijkingen van binnen de groep en inter-groep metingen. Ten eerste, representatieve resultaten die hier aandacht beperkt binnen de groep variabiliteit in de metingen van vet / totale volume verhoudingen in zowel de WT en obese muizen groepen met behulp van deze procedures. Tweede vet / totale verhoudingen WT versus obesitas muizen aanzienlijk verschillen. Tot slot, op basis van vergelijkingen (niet afgebeeld) met de vorige waarden gerapporteerd voor de relatieve totale vetmassa en het percentage lichaamsvet voor WT versus B6.V-Lep ob / J muizen, onze metingen voor vet / totale volume ratio's voor WT versus B6.V- LEP ob / J muizen binnen een verwachte bereik, 7, 8.
De methoden die hier worden beschreven zou kunnen worden toegepast of aangepast aan andere modellen en / of studie doelstellingen. Wijzigingen in de wederopbouw parameters kan nodig zijn om specifieke doelstellingen te bereiken. Bijvoorbeeld Judex et al.. (2010) rapporteerde dat 50 urn resolutie foto's zijn vereist voor sommige regio specifieke analyse. Een cm isotrope volumes van een afbeelding kan worden gekozen voor 35 micrometer reconstructies in de Albira 5,0 Suite Reconstructor met behulp van de "HR" reconstructie optie. Zodra de Albira CT-systeem is gebruikt voor de regio en orgaan-specifieke vetgehalte metingen van alle voordelen (dat wil zeggen gelijktijdig regio en orgaan-specifieke vet volume metingen en longitudinale metingen) van de CT-gebaseerde vetgehalte analyse kan worden gerealiseerd voor de Albira CT-systeem.
Conclusies:
Hier hebben we een gedetailleerde, stap voor stap methode voor het meten van het vetgehalte in levende muizen met behulp van X-ray CT-beeldvorming. We hebben onze CT-datasets met behulp van een Albira beeld station, en trad vervolgens segmentatie en analyse met behulp van de PMOD software suite. Tot slot geven we instructies om gemakkelijke rendering en visualisatie van het vetweefsel verdeling binnen het hele dier mogelijk te maken.
Disclosures
Todd A. Sasser, Shengting Li, Sean P. Orton, en Seth T. Gammon zijn medewerkers van Carestream Molecular Imaging. Carlos Correcher is een medewerker van Oncovision, Gem-Imaging SAW Matthew Leevy is adviseur voor Carestream Molecular Imaging.
Acknowledgments
Wij zijn van harte dank aan de Notre Dame Integrated Imaging Facility (NDIIF) en Carestream Health voor financiële steun voor dit project.
References
- Clarke, P. J., O'Malley, P. M., Schulenberg, J. E., Johnston, L. D. Midlife and Socioeconomic Consequences of Persistent Overweight Across Early Adulthood: Findings From a National Survey of American Adults (1986-2008). Am. J. Epidemiol. , (2008).
- Brockman, G., Bevova, M. Using Mouse Models to Dissect the Genetic of Obesity. TRENDS in Genetics. 18, 367-376 (2002).
- Bray, G. A. Progress in Understanding the Genetics of Obesity. Journal of Nutrition. 127, Suppl 5. 940S-942S (1997).
- Carroll, L. Mouse Models of Obesity. Clinics in Dermatology. 22, 345-349 (2004).
- Judex, S., Luu, Y. K., Ozcivici, E., Adler, B., Lublinsky, S., Rubin, C. T. Quantification of Adiposity in Small Animal Rodents using Micro-CT. Methods. 50, 14 (2010).
- Luu, Y. K., Lublinsky, S., Ozcivici, E., Capilla, E., Pessin, J. E., Rubin, C. T., Judex, S. In Vivo Quantificaiton of Subcutaneous and Visceral Adiposity by Micro Computed Tomography in a Small Animal Model. Med. Eng. Phys. 31, 34-41 (2009).
- Medina-Gomez, G., Gray, S. L., Yetukuri, L., Shimomura, K., Virtue, S., Campbell, M., Curtis, R. K., Jimenez-Linan, M., Blount, M., Yeo, G. S., Lopez, M., Seppänen-Laakso, T., Ashcroft, F. M., Oresic, M., Vidal-Puig, A. PPAR gamma 2 prevents lipotoxicity by controlling adipose tissue expandability and peripheral lipid metabolism. PLoS Genet. 3, e64 (2007).
- Sakkou, M., Wiedmer, P., Anlag, K., Hamm, A., Seuntjens, E., Ettwiller, L., Tschöp, M. H., Treier, M.A role for brain-specific homeobox factor bsx in the control of hyperphagia and locomotory behavior. Cell Metab. 5, 450-463 (2007).
- Patchen, M. L., MacVittie, T. J., Souza, L. M. Postirradiation treatment with granulocyte colony-stimulating factor and preirradiation WR-2721 administration synergize to enhance hemopoietic reconstitution and increase survival. International Journal of Radiation Oncology. 22, 773-779 (1992).
