Segmentering og måling af tykke bind i murine Fedme-modeller vha. X-ray Computed Tomography

Summary

Fedtindholdet analyse rutinemæssigt udføres i undersøgelser under anvendelse af murine fedme modeller. Nye metoder i lille dyr CT-scanning og analyser om langsgående detaljer rigt fedtindhold analyse. Her detalje trin for trin procedurer til at udføre små dyr CT-scanning, analyse og visualisering.

Abstract

Fedme er forbundet med øget sygelighed og dødelighed samt reducerede målinger i livskvalitet. ^1. Både miljømæssige og genetiske faktorer er forbundet med fedme, men de præcise bagvedliggende mekanismer, der bidrager til sygdommen er ved at blive afgrænset. ^2,3 Flere små dyr modeller for fedme er blevet udviklet og er ansat i en række undersøgelser. ⁴ En kritisk komponent i disse eksperimenter indebærer indsamling af regionale og / eller total animalsk fedt indhold data under forskellige forhold.

Traditionelle eksperimentelle metoder til måling af fedtindholdet i små dyremodeller af fedme omfatter invasive (f.eks ex vivo måling af fedtdepoter) og ikke-invasive (f.eks Dual Energy X-ray absorptiometry (DEXA), eller magnetisk resonans (MR)) protokoller, som hver især præsenterer relativt trade-offs. Nuværende invasive metoder til måling af fedtindholdet kan give oplysningerfor orgel og region specifik fedtfordeling, men ofrer de emner vil udelukke langsgående vurderinger. Omvendt nuværende non-invasive strategier giver begrænsede oplysninger for orgel og regionen specifik fedtfordeling, men så værdifuld langsgående vurdering. Med fremkomsten af ​​dedikerede små dyr X-ray computertomografi (CT), systemer og tilpassede analytiske procedurer, både orgel og region specifik analyse af fedt distribution og langsgående profilering kan være muligt. Nylige rapporter har valideret brugen af CT til in vivo langsgående billeddannelse af adipositas i levende mus. ^5,6 Her giver vi en modificeret metode, der giver mulighed for fedt / samlede måling, analyse og visualisering udnytte Carestream Molekylær Imaging Albira CT-systemet i forbindelse med PMOD og Volview softwarepakker.

Protocol

1. Dyr

1. For resultaterne angivet nedenfor, blev tre C57BL/6J-mus og fire B6.V-LEP ^ob / J mus opnået fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA). B6.V-LEP ^ob / J mus repræsenterer en af de tidligste modeller for fedme og forblive aktivt forsket. B6.V-LEP ^ob / J mus udviser en fænotype kendetegnet ved øget fedtcellerne størrelse og antal og kan veje op tre gange mere end vild type mus. ^7,8 Her blev B6.V-LEP ^ob / J mus ansat som en positiv styring af en overvægtig fænotype at illustrere muligheden for Albira CT for CT-baserede fedtindhold målinger.
2. Billeddannelse blev udført, hvor dyrene nåede cirka 12 uger gamle. (Fedme i B6.V-LEP ^ob / J-mus er åbenbart efter 4 ugers alderen).
3. Musene blev bedøvet ved isofluoran (2,5% strømningshastighed) og holdes under 2,5% via en næse-keglen opsætning til billeddannelse. Enimals blev anbragt tilbøjelig i standard rotte lejet (M2M Imaging Inc. Cleveland, OH) i forsynet med Albira billedet station. Lemmer var placeret lateralt fra torsoen for en ensartet CT købet.
4. Efter billede Købet blev gennemført, blev mus fjernet fra næsekeglen og vendte tilbage til et opsving bur indtil ambulant.

2. Billede Acquisition og genopbygning

1. Billede opkøb udføres ved hjælp af Albira CT-systemet (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Musene blev bedøvet ved isofluoran (2,5% strømningshastighed) og holdes under 2,5% via en næse-keglen opsætning til billeddannelse. Erhvervelser blev udført for at scanne et leje af 115 mm længde med 600 fremspring. Den røntgenkilde blev sat til en strøm på 200 uA, og spænding af 45 kVp og anvendes en 0,5 mm Al filter for at hærde strålen.
2. Ca. stråling dyb dosis svarende til CT indstillinger var 220 mSv, og lavvandet dosisækvivalent var 357,4 mSv. Dissedoser er over 20 gange lavere end rapporteret LD50-værdier. ⁹
3. Billeder rekonstrueres ved hjælp af FBP (filtreret bagprojektion) algoritme via Albira Suite 5,0 Reconstructor bruger "Standard" parametre. Disse kombinerede køb og genopbygning indstillinger giver et endeligt billede med 125 gm isotrope voxels, anses for tilstrækkelig for hele dyret analyse. For detaljeret region specifik analyse, kan en rekonstruktion med 35 um isotrope voxels blive udvalgt for en endelig løsning på 90 um.

3. Image Analysis

Billede analyse udføres ved hjælp af PMOD (PMOD Technologies Ltd, Zürich, Schweiz) analyse software. Billederne er segmenteret i PMOD efter vævstæthed-først for den samlede volumen og derefter for fedt volumen.

3.1 Billeder kan reduceres til analyse for at minimere beregningsmæssige krav.

1. For at reducere, navigere til de vigtigste fanen Vis. Vælg Funktioner> Reducer.
2. Vælges X med 2, Y med 2, og Z med to.
3. Kontroller Udskift.
4. Vælg Kør.

Meddelelsen: "afgrænsningsramme vil ændre sig" vises, når reduktionen er fuldstændig.

3.2 Billeder kan maskeres at fjerne seng og næse-kegle elementer til den efterfølgende volumen-af-interesse (VOI) analyse.

1. At maskere, navigere til Planes, Layouts, rotationer Spejl, 3D-markører> Fly og layout.
2. Vælg Vis fly Z.
3. Rulle til næsekeglen i Z planet.
4. Vælg vigtigste VOI fanen> Tegn hjørner.
5. Tegn et område af interesse (ROI) omkring dyrets næse-undtagen sengen og næse kegle.
6. VælgKopier Faktisk ROI.
7. Flyt til den næste skive, og indsæt ROI fra buffer gennem de relevante planer næse.
8. Brug Rediger gruppe af knuder til at justere ROIs efter behov.
9. Vælg Slet ROI på første fly ud over de næse kegler.
10. Generer en ny VOI at omfatte dyret omkreds (ekskl. dyret sengen) på de første fly ud over de næse kegler.
11. Naviger til VOI Tools> Masking & Algebra.
12. Indtast -1000 i dialogen relevante felt.
13. Vælg Mask voxels udenfor den valgte VOIs knappen.

Meddelelsen: ". Irreversible data operation Vil du fortsætte?" displays.

14. Vælg Ja.
15. Navigere til Planes, layout, rotationer, et spejl, 3D-markører> Fly & Layouts.
16. Vælg Vis alle planer.
17. Undersøg VOI for integritet.
18. Vælg Gem.
19. Gem som Analyser.
20. Ændre filnavnet præfiks.

3,3 første segment billedet for total dyr volumen:

1. Vælg Værktøjer> Eksterne.
2. Marker Segmentering afkrydsningsfeltet.
3. Indtast en række -300 til 3500 (tæthedsområde henvisning stammer fra abdominal fedt-region tæthed område).
4. Vælg Kør Segmentering.
5. Undersøg integritet segmentering.
6. Vælg OK.
7. Vælg Fjern ROI.
8. Vælg VOI statistik.

Rapporterede statistik repræsenterer den samlede mængde.

9. Optag rapporterede volumen.

   3,4 Dernæst segment billedet for fedt volumen:

   1. Vende tilbage til den ikke-segmenteret maskeret billede til fedt-volumen segmentering.
   2. For at indlæse gemte Maskeret datafil, skal du kontrollere Analyser boksen i Load vindue).
   3. Vælg Værktøjer> Eksterne.
   4. Marker Segmentering afkrydsningsfeltet.
   5. Ind i en række -200 til -50.
   6. Vælg Kør Segmentering.
   7. Undersøg integritet segmentering.
   8. Vælg OK.
   9. Vælg VOI statistik.

   De rapporterede statistik repræsenterer fedt volumen.

   10. Optag rapporterede volumen.
   11. Vælg Gem.
   12. Gem som Analyser.
   13. Ændre filnavnet præfiks.

   Valgfrit: Hvis huden / perifer tæthed stadig kan "erosion og dilatation" protokol nedenfor udføres for at fjerne disse regioner for VOI analyse.

   1. Vælg Værktøjer> Eksterne.
   2. Marker Morfologisk afkrydsningsfeltet. De morfologiske se displays.
   3. Vælg Erosion.
   4. Vælg OK.
   5. Vælg Værktøjer> Eksterne.
   6. Marker Morfologisk afkrydsningsfeltet. De morfologiske se displays.
   7. Vælge dilatation.
   8. Vælg OK.

   4. Visualisering af CT-billeder

   4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) blev benyttet til at skabe leverede 3D-visuelle displays af segmenterede billeder.

   Analyser format.
   1. Brug standardindstillingerne i pop-up vindue.
   2. Åbn plug-ins menu.
   3. Under Utility, vælg Flet mængder.
   4. Fravælg omskalere komponenter.
   5. Klik på Tildel anden indgang.
   6. Vælg de segmenterede fedt data for den anden indgang.
   7. Brug standardindstillingerne i pop-up vindue.
   8. Klik på Anvend plug-in.
   9. Dobbeltklik på Volume visningsvinduet for en større visning emnet musen.

   4,2 Retur til Farve / Opacity fanen. Komponenten rullelisten refererer til, hvilke data sættet øjeblikket redigeres. To glidere er placeret i bunden af fligen og bestemme den relative lysstyrke af hver komponent datasæt i topbelægningen under anvendelse af værdier fra 0 til 1. For komponent 1, the CT, vi foretrækker at bruge en gråtoner farveskema. For at ændre farven:

   1. I Scalar Color Mapping afsnit, skal du dobbeltklikke på en af de farveskydekontrollerne.
   2. For at fjerne en skyder, skal du trække det ud af kassen.
   3. Hvis du vil tilføje en ny skyder, skal du klikke hvor som helst i skyderen området.
   4. Tag en af ​​de skydere.
   5. Gør til venstre farve skyderen sort (skalar værdi (S) = -19.000).
   6. Gør rigtige farve skyder hvid ((S) = 15000).
   7. Fra Scalar Opacitet kortlægning kassen, oprette et nyt punkt ved at klikke i boksen. Dette vil give i alt tre punkter i vinduet.
   8. For det midterste punkt ændre (S) til ca -3000, og opacitet (O)-værdi på 0.
   9. Vælg det tredje punkt i højre side af vinduet.
   10. Ændre (S) til ca 32000, og 0,25.
   11. Det første punkt kan være hvor som helst til venstre, lige så længe Opacitet værdi er sat til 0.
   12. Skift til komponent to, der skal redigere udseendet af fedtet.
   13. Ændring hver af de farveskydekontrollerne til rød ved at dobbeltklikke på og skubbe Hue (H) skyderen til venstre for at falske farvekort fedtet til rød. Meget lidt andet bør der være behov for at justere udseendet af fedt.

   4,3 for at oprette en tre-panel rotation film visning af CT, fedt og overlay:

   1. Klik og træk emnet musen i en oprejst stilling med ryggen mod dig.
   2. Under Komponent vægte, skal du angive værdien af komponent to til 0 for at vise kun CT-scanning.
   3. Klik på Gennemse> Kamera.
   4. Vælg et antal rammer for rotation film (i den foreliggende sag, valgte vi "36").
   5. Skift X rotation værdien til 360 grader.
   6. Vælg Opret.
   7. I pop-up dialogboks, oprette en ny mappe med navnet CT, og gem filen i TIFF-format, som vil udsende en serie af rotation billeder.
   8. Gentag dette trin for fedt billede, samt for overlagt fedt / CT billede, gemme dem i individuelle mapper hver gang.

   4,4 ImageJ v 1.43u blev anvendt til at generere en rotation film fil ved hjælp af VolView output billeder.

   1. I ImageJ, vælge Filer> Importer> Billede sekvens.
   2. Vælg det første billede i CT mappen. Softwaren vil automatisk registrerer de andre filer og åbne dem som en skorsten.
   3. Gentag at åbne fedt og overlay-sekvenser.
   4. Åbn ROI lederen under Analyze> Værktøjer> ROIManager.
   5. Tegne en ROI omkring emnet mus, bortset fra unødvendige baggrundspixel.
   6. I ROI leder, klikke på Tilføj for at tilføje ROI.
   7. Vælg et andet billede sekvens.
   8. I ROI leder, skal du klikke på ROI at anvende den på billedet. På denne måde, vil hver af de beskårne stakke passer perfekt sammen.
   9. Når ROI er på alle stakke, skal du højreklikke i ROI.
   10. Vælg Dubler.
   11. Vælg Kontroller Duplicate Stack Box til at adskille investeringsafkast fra resten af billedet.
   12. Luk større billede stakke.
   13. Gentag denne procedure for alle tre billedsekvenser.
   14. Gå til Image> Stakke> Værktøj> Kombinér at kombinere de stakke sammen.
   15. Vælg CT for Stack 1.
   16. Vælg Fat for Stack 2.
   > Gentag, og vælg Kombineret stakke til Stack 1 og Overlay til Stack 2.
   17. Der er nu en tre-panel, image-rotation stak, der kan blive fremvist ved at vælge Afspil i nederste venstre hjørne af billedet vinduet.
   18. Hvis du vil gemme filmen som en AVI, vælge Filer> Gem som ...> AVI ...
   19. Klik på Gem.

   5. Repræsentative resultater

   Resultater for tre WT (C57BL/6J) mus og fire overvægtige (B6.V-Lep ^ob / J) mus er rapporteret her som et repræsentativt eksempel på fedt / samlet rumfangsforhold målinger anvender det Albira CT-systemet. Figur 1 nedenfor giver en repræsentativ display skabt med VolView v3.2 for segmentering (dvs. samlet volumen og fedt volumen) af fede mus CT-billeder.

   0/3680fig1.jpg "/>
   Figur 1. Repræsentative CT-billeder segmenterede for fedt. (A) Fede mus (B6.V-Lep ^ob / J) CT samlede volumen i gråtoner, (B), fedt volumen i rødt, og (C) billede fusion. (D) WT mus (C57BL/6J) CT samlede volumen i gråtoner, (E) fedt volumen i rødt, og (F) billede fusion.

   Samlede mængder, fedt mængder og beregnede fedt / samlede mængde nøgletal er angivet nedenfor i tabel 1 for hver WT mus og hver fede mus. Den gennemsnitlige fedt / totalt volumen-forholdet for WT gruppen og den fede gruppen var 0,09 og 0,42 (Figur 2). De fedt / samlede mængde nøgletal for WT musene versus fede mus blev fundet at afvige signifikant (p = 0,001).

   WT (C57BL/6J)	Total (cm3)	Fedt (cm3)	Fat / Total Ratio	Fede (B6.V-Lep ob	Total (cm3)	Fedt (cm3)	Fat / Total Ratio
   Dyr 1	28,79	3,00	0,10	Dyr 1	66,25	26,75	0,40
   Dyr 2	33,25	3,05	0,09	Dyr 2	61,15	26,31	0,43
   Dyr 3	30,30	2,63	0,09	Dyr 3	64,19	25,7	0,40
   				Animal 4	54,25	23,78	0,44

   
   

   Tabel 1. Samlet mængde, fedt volumen,og fedt / samlede mængde nøgletal for WT og fede mus. alt og fedt mængder blev udledt fra segmenterede billeder ved hjælp af PMOD VOI analyse.

   
   Figur 2. Gennemsnit fedt / samlede mængde nøgletal for WT mus versus fede mus. Gennemsnit af fedt / samlede mængde nøgletal for WT (C57BL/6J) og fede (B6.V-Lep ^ob / J) viser sig at være 0,09 og 0,42 henholdsvis vises. (Fejlmargener = enkelt standardafvigelse). WT versus fede fedt / samlet rumfang forhold blev fundet at afvige signifikant (p-værdi = 0,001).

Discussion

Her anvender B6.V-LEP ^ob / J-mus har vi vist muligheden for at udføre fedtindhold målinger i en lille dyremodel hjælp af Albira CT-systemet. Disse målinger er i overensstemmelse med forventningerne til sammenligninger af koncerninterne og inter-gruppe målinger. For det første repræsentative resultater forudsat her fremhæve begrænset koncerninterne variation i målinger af fedt / samlede volumen-forhold i både WT og fede mus grupper ved hjælp af disse procedurer. For det andet, fedt / samlede mængde nøgletal for WT versus fede mus adskiller sig væsentligt. Endelig, baseret på sammenligninger (ikke vist) med tidligere rapporterede værdier for relativ total fedtmasse og procent kropsfedt til WT versus B6.V-LEP ^ob / J mus, vores målinger for fedt / samlede mængde nøgletal for WT versus B6.V- LEP ^ob / J-mus falder inden et forventet ^{interval, 7, 8.}

De beskrevne metoder her, kan anvendes eller tilpasses til andre models og / eller studie mål. Ændringer i genopbygningen parametre kan være nødvendigt at nå specifikke mål. F.eks. Judex et al (2010) rapporterede, at 50 um opløsning var nødvendige for en region specifik analyse. En CM isotrope volumener af et billede kan udvælges til 35 um rekonstruktioner i Albira 5,0 Suite Reconstructor anvendelse af "HR" genopbygning valgmulighed. Når Albira CT-systemet er blevet anvendt for region og orgel specifikke fedtindhold målinger fulde udbytte (dvs. samtidig regionen og organspecifikke fedt volumen målinger og langsgående målinger) af CT-baseret fedtindhold analyse kan realiseres med henblik på Albira CT-systemet.

Konklusioner:

Her giver vi en detaljeret, trinvis metode til måling af fedtindholdet i levende mus ved hjælp af X-ray CT-scanning. Vi købte vores CT-datasæt ved hjælp af en Albira billede station, og optrådte efterfølgende segmentering og Analyse ved hjælp af PMOD software suite. Endelig vil vi give instruktioner for at aktivere letkøbt gengivelse og visualisering af fedtvæv fordelingen i hele dyret.